JP5647599B2 - 生物学的試料中の物質を検出する方法 - Google Patents
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Description
生物学的試料中の物質を検出するために、当該物質(被検物質)に対し特異的に結合する物質を利用する方法が、従来より広く用いられている。被検物質に特異的に結合させる物質としては、抗体やその他のタンパク質などが多く用いられる。これらはマイクロプレートや微小ビーズ、あるいはセンサーチップなどの担体に固定化されうる。固定化の汎用的な方法として、疎水結合、共有結合などが知られている。
アビジンは、卵白由来の糖タンパク質でビオチン(ビタミンH)に極めて強く結合する。アビジンとビオチンの相互作用は最も強い非共有結合の一つである(Green (1975) Adv Protein Chem 29: 85−133)。一方、ストレプトアビジンは放線菌由来のアビジン様タンパク質で、やはりビオチンと強く結合する。これまでに(ストレプト)アビジン−ビオチンの相互作用は、その作用力の強さから、例えば、抗原や抗体の検出など分子生物学や生化学の分野で、広範に用いられている(Green (1990) Methods Enzymol 184: 51−67)。
生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b−i) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b−ii) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する;そして、
4) 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。
生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い;
4) 工程3)のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、生物学的試料を添加し、そして、
5) 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。
生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い;
4) 工程3)のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b−i) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b−ii) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する;そして、
5) 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。
態様1の工程3(b−i)又は態様3の工程4(b−i)において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、態様1又は3に記載の方法。
ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、態様1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、汗、尿、涙、リンパ液、及び母乳からなる群から選択される、態様1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
生物学的試料中の物質を検出するための担体であって、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行う
ことを含む方法によって調製された、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体。
生物学的試料中の物質を検出するためのキットであって、
A) 検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体;並びに、
B−i) A)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、若しくは
B−ii) A)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤;および/又は
C) ビオチン結合性タンパク質を含むブロッキング剤
を含むキット。
本発明の検出方法(態様1)は、生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b−i) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b−ii) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する;そして、
4) 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した被検物質を検出する
ことを含む。
本発明は、生物学的試料中の物質を検出する方法に関する。
(1)SITH−1タンパク質、核酸
SITH−1タンパク質、核酸の構造及び機能は、PCT/JP2008/67300に開示されており、その全内容が本明細書中に援用される。
SITH−1に対する抗体は、SITH−1タンパク質又はその変異体、あるいはそれらの部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる。公知の方法としては、例えば、文献(Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA、講談社(1991)」」に記載の方法が挙げられる。このようにして得られる抗体は、SITH−1タンパク質の検出・測定などに利用できる。
本発明の検出方法は、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体を利用する。
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成する、
ことを含む方法によって作成することができる。
「ビオチン」とは、D−[(+)−cis−ヘキサヒドロ−2−オキソ−1H−チエノ−(3,4)−イミダゾール−4−吉草酸]の一般名称である。ビタミンB群に分類される水溶性ビタミンの一種で、Vitamin B7(ビタミンB7)とも呼ばれる、あるいは、ビタミンH、補酵素Rとも言われることもある。ビオチンは卵白中に含まれる糖タンパク質の一種、アビジンと非常に強く結合し、その吸収が阻害される。そのため、生卵白の大量摂取によってビオチン欠乏症を生じることがある。
被検物質と特異的に結合するタンパク質(以下、「特異的タンパク質」と呼称する場合がある)は、特に限定されない。当該発明による一つの態様としては、例えばこれらに限定されるものではないが、抗原と抗体、ホルモン等のリガンドと受容体、レクチンと糖、核酸の相補的結合等において、その一方を、他方との特異的な複合体形成能力を利用して、被検試料から選択的に分析する。
本発明は、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の間の結合を利用して、被検物質と特異的に結合するタンパク質を担体に固定することを含む。本発明において、「ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の間の結合」を「アビジン−ビオチン結合」と呼称する場合がある。
1)配列番号7の104番目のアルギニン残基;
2)配列番号7の141番目のリジン残基;
3)配列番号7の26番目のリジン残基;及び
4)配列番号7の73番目のリジン残基
から選択される1または複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質である。
配列番号7において、40番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、104番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質(D40N−R104E);
配列番号7において、40番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、141番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質(D40N−K141E);並びに、
配列番号7において、40番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、104番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、141番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質(D40N−R104E−K141E)、
からなるグループから選択される、改変型ビオチン結合タンパク質である。
本発明は、被検物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質(以下、「ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質」、又は「融合タンパク質」と呼称する場合がある。)を担体に固定する。
本発明においては、ビオチンを結合させた担体と、ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質を準備し、両者を接触させることにより、アビジン−ビオチン結合を介して担体にタンパク質を結合させることができる。
本発明の態様1の方法は、融合タンパク質が結合した担体を準備した後に、工程3)として、
工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b−i) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b−ii) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する、ことを含む。
本発明はその特徴の1つとして、生物学的試料へ融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞から調製した細胞破砕抽出液、並びにビオチン結合性タンパク質を混合して担体に添加する(工程b−i)か、あるいは、融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を被検試料に混合して担体に添加する(工程b−ii)。
本発明の検出方法は、融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する。
本発明の検出方法(態様2)は、生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い;
4) 工程3)のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、生物学的試料を添加し、そして、
5) 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した被検物質を検出する
ことを含む。
本発明の検出方法(態様3)は、生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い;
4) 工程3)のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b−i) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b−ii) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する;そして、
5) 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した被検物質を検出する
ことを含む。
本発明はまた、生物学的試料中の物質を検出するための担体を提供する。本発明の担体は、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行う
ことを含む方法によって調製された、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、ことを特徴とする。本発明の担体は、生物学的試料を添加する前に予めビオチン結合性タンパク質によりブロッキングされている。
本発明はまた、生物学的試料中の物質を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、
A) 検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体;並びに、
B−i) A)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、若しくは
B−ii) A)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤;および/又は
C) ビオチン結合性タンパク質を含むブロッキング剤
を含む。
本実施例では、SITH−1のC末側にリンカーを介して、タマビジン2(以下、TM2)が配置された融合タンパク質をコードする遺伝子を設計した。
SITH1−TM2融合遺伝子構築のために、まず、SITH−1とTM2の両遺伝子をリンカー(5xlinker: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号18)を介し融合させるためのプライマーを設計した。
SITH1−TM2融合遺伝子を構築するために、二段階のPCRを行った。
PCRによって得られたSITH1−TM2融合遺伝子をベクターpCR4Blunt TOPO(Invitrogen社製)にクローニングした。
SITH1−TM2/pTrc99Aを導入した大腸菌BL21を、抗生物質アンピシリン(最終濃度100μg/ml)を含むLB培地50mlに接種し、OD600における吸光度が0.5に達するまで30℃で振とう培養した。その後、1mM IPTGを添加し、さらに30℃で5時間振とう培養した。培養液50mlから遠心にて菌体を回収した。菌体は0.1M HEPES/KOH(pH7.4)3ml中に懸濁後、超音波により破砕した。破砕液を遠心(15,000rpm)し、その上清を大腸菌粗抽出液とした。TM2融合SITH−1タンパク質の発現を確認するため、粗抽出液中に含まれるタンパク質をSDS−PAGEで分画し、ウェスタンブロッティングにより解析した。
実施例1で得られたTM2融合SITH−1を発現した大腸菌粗抽出液を2mg総可溶性タンパク質/mlとなるように0.1M HEPES/KOH(pH7.4)で希釈し、ビオチンプレート(住友ベークライト社製)に100μlずつ添加した。室温で1時間静置し、タマビジン‐ビオチン結合によりTM2融合SITH−1タンパク質をビオチンプレートに固定化した。その後、プレートの各ウェルを0.1% Tween20を含むTBS緩衝液(TBST)で3回洗浄し、5μg/ml BSA/TBST溶液もしくは50μg/ml 精製TM2/5μg/ml BSA/TBST溶液を各ウェルに250μl添加し、室温で1時間静置し、ブロッキングを行った。その後、各ウェルはTBSTで3回洗浄した。
従って、S/N比が大きいほど検出感度が高いことを示している。
本実施例では、非常に薄い濃度のSITH−1抗体を検出する場合について、TM2融合SITH−1をビオチン化磁性ビーズへ固定化した系における各種血清希釈液の効果を調査した。
磁性ビーズのDynabeads M−270 Amine (DynalBiotech社製)1mL(30mgビーズ/mL)に、10mM NHS−Lc−Lc−Biotin (PIERCE社製)1mLを添加した。室温で30分間転倒混和することでアミノ基とNHS活性エステル基を反応させ、ビオチンと磁性ビーズを共有結合させた。その後、磁性ビーズを0.1% BSA/ 0.01% Tween20/ PBS溶液で2回洗浄し、最後にPBS緩衝液に懸濁した。得られた磁性ビーズ(30mgビーズ/mL PBS)をビオチン化磁性ビーズとした。
市販のヒト血清(Human Serum pool、Cosmo−Bio社製)に、実施例2のウサギ抗SITH−1抗体を1/50量加えて、SITH−1抗体を含むヒト血清を調製した。一方、SITH−1抗体を加えないヒト血清を対照とした。
本実施例では植物病原細菌由来タンパク質であるHarpin(hrpZpssタンパク、Takakuraら、2004、Physiol. Mol. Plant Pathol. 64, 83(89)とタマビジン2(TM2)との融合タンパク質を大腸菌で発現させ、ビオチン化マイクロプレートにタマビジンービオチン結合により固定化させた。こうして得られたHarpinプレートに、タマビジン2によるブロッキングを行った上で、各種大腸菌粗抽出液で希釈した血清(ウサギ抗Harpin抗体とヒト血清を混合した血清)を反応させた後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG抗体により抗Harpin抗体を検出した。以下、詳細に説明する。
PCRを用いてTM2の配列をHarpinのC末端側に接続させた融合タンパク質をコードする遺伝子を構築した。Harpin−TM2融合遺伝子構築のために、Harpin、TM2両遺伝子をリンカー(5xlinker: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号18)を介し結合させるためのプライマーを設計した。設計したプライマーを表4に示す。
TM2融合Harpin大腸菌粗抽出液を、総可溶性タンパク質濃度が1mg/mlとなるように0.1M HEPES/KOH(pH7.4)で希釈し、これをビオチンプレート(住友ベークライト)に100μlずつ添加した。室温で1時間静置することでタマビジンービオチン結合によりTM2融合Harpinを固定化した。その後、プレートの各ウェルを0.1% Tween20を含むTBS緩衝液(TBST)で3回洗浄した。50μg/ml 精製TM2(WO02/072817)/0.5%BSA/TBST溶液を各ウェルに250ul添加し、室温で1時間静置することで、TM2とBSAでブロッキングを行った。ブロッキング後、各ウェルはTBSTで3回洗浄した。
Claims (7)
- 生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b−i) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b−ii) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する;そして、
4) 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。 - 生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し;
2) ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い;
4) 工程3)のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b−i) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b−ii) 工程1)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する;そして、
5) 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。 - 請求項1の工程3(b−i)又は請求項2の工程4(b−i)において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、請求項1又は2に記載の方法。
- ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、汗、尿、涙、リンパ液、及び母乳からなる群から選択される、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的試料中の物質を検出するためのキットであって、
A) 検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体;並びに、
B−i) A)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、若しくは
B−ii) A)の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤
を含むキット。 - さらに、C) ビオチン結合性タンパク質を含むブロッキング剤を含む、請求項6に記載のキット。
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AU2010232303A1 (en) * | 2009-03-31 | 2011-11-10 | Japan Tobacco Inc. | Method for detecting antibody against SITH-1 in biological sample |
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WO2017115878A1 (ja) * | 2015-12-28 | 2017-07-06 | 日本たばこ産業株式会社 | 気分障害を診断、治療又は予防する方法 |
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Citations (4)
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---|---|---|---|---|
JPH04236353A (ja) * | 1991-01-17 | 1992-08-25 | Shin Etsu Chem Co Ltd | 抗体の測定方法 |
WO2004005319A2 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Chiron Corporation | Microarrays on mirrored substrates for performing proteomic analyses |
WO2008081938A1 (ja) * | 2006-12-28 | 2008-07-10 | Japan Tobacco Inc. | 耐熱性ビオチン結合性タンパク質の利用法、および当該タンパク質が結合した固体担体 |
WO2008130053A1 (ja) * | 2007-04-23 | 2008-10-30 | Synthera Technologies Co., Ltd. | プロテインgとアビジン類との融合タンパク質 |
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---|---|---|---|---|
US102441A (en) | 1870-04-26 | Improvement in metallic roofing | ||
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JPH01211727A (ja) | 1988-02-19 | 1989-08-24 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 表示デバイス |
US5051356A (en) | 1988-06-13 | 1991-09-24 | Eastman Kodak Company | Specific binding composition comprising a low pI protein or carbohydrate and a diagnostic test kit and method of use |
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DE4434093A1 (de) | 1994-09-23 | 1996-03-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis einer zu bestimmenden Substanz |
DE19748489A1 (de) | 1997-11-03 | 1999-05-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren |
DE19806989A1 (de) * | 1998-02-19 | 1999-08-26 | Roche Diagnostics Gmbh | Erzeugung räumlich scharf begrenzter Festphasen für Bindungsassays |
JP4407022B2 (ja) | 2000-08-04 | 2010-02-03 | 東ソー株式会社 | ビオチンを含む洗浄液、反応試薬および特異的結合アッセイ方法 |
WO2002046395A1 (fr) | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Keio University | Proteine a c-terminaison modifiee et procede permettant d'obtenir cette proteine, agent de modification et matrice de traduction necessaire a la production d'une proteine a c-terminaison modifiee, et procede de detection de l'interaction proteique avec l'utilisation de ladite proteine |
WO2002072817A1 (fr) * | 2001-03-12 | 2002-09-19 | Japan Tobacco Inc. | Nouvelle proteine, gene codant ladite proteine et procede d'utilisation correspondant |
US20030049694A1 (en) * | 2001-09-10 | 2003-03-13 | Chung-Hsiun Wu | Production of fusion proteins and use for identifying binding molecules |
BRPI0314038B8 (pt) * | 2002-09-06 | 2021-05-25 | Amgen Inc | anticorpo humano isolado, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, uso de um anticorpo, e, composição farmacêutica |
CN100341570C (zh) * | 2003-03-31 | 2007-10-10 | 穆海东 | 一种蛋白质芯片的制备方法 |
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---|---|---|---|---|
JPH04236353A (ja) * | 1991-01-17 | 1992-08-25 | Shin Etsu Chem Co Ltd | 抗体の測定方法 |
WO2004005319A2 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Chiron Corporation | Microarrays on mirrored substrates for performing proteomic analyses |
WO2008081938A1 (ja) * | 2006-12-28 | 2008-07-10 | Japan Tobacco Inc. | 耐熱性ビオチン結合性タンパク質の利用法、および当該タンパク質が結合した固体担体 |
WO2008130053A1 (ja) * | 2007-04-23 | 2008-10-30 | Synthera Technologies Co., Ltd. | プロテインgとアビジン類との融合タンパク質 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6014017494; 邨次 誠: '「(6)ビオチンを利用する化学分析法」' ビタミン Vol. 73, No. 11, 19991125, p. 691-697, 日本ビタミン学会 * |
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