KR20120001741A - 생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법, 해당 방법에 사용하는 담체, 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 방법은, 그 일 양태에 있어서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 준비하고;
2) 공정 1)의 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에,
(a) 생물학적 시료, 및
(b-i) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과 비오틴 결합성 단백질, 혹은
(b-ii) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액을 혼합하여 첨가한다; 그리고,
4) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은, 그 일 양태에 있어서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 준비하고;
2) 공정 1)의 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에,
(a) 생물학적 시료, 및
(b-i) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과 비오틴 결합성 단백질, 혹은
(b-ii) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액을 혼합하여 첨가한다; 그리고,
4) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는 것을 포함한다.
Description
본 발명은, 생물학적 시료 중의 물질을 정성적(定性的), 및/또는, 정량적(定量的)으로 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해, 특히 생물학적 시료 중에 미량으로 존재하며, 통상은 검출이 곤란한 물질의 검출도 가능하다.
피검물질에 특이적으로 결합하는 단백질을 소수결합, 공유결합 등에 의해 결합시킨 담체를 이용한 물질의 검출 방법
생물학적 시료 중의 물질을 검출하기 위해서, 해당 물질(피검물질)에 대해 특이적으로 결합하는 물질을 이용하는 방법이, 종래부터 널리 이용되고 있다. 피검물질에 특이적으로 결합시키는 물질로서는, 항체나 그 외의 단백질 등이 많이 이용된다. 이들은 마이크로 플레이트나 미소 비즈, 혹은 센서 칩 등의 담체에 고정화될 수 있다. 고정화의 범용적인 방법으로서 소수결합, 공유결합 등이 알려져 있다.
「소수결합」은, 담체의 소수성 표면과, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질(이하, 「특이적 단백질」이라고 부르는 경우가 있다)의 소수성 부분과의 상호작용을 이용하여, 담체와 특이적 단백질을 결합시키는 것으로, 특별한 시약을 필요로 하지 않는 점에서 간편하다. 그러나, 대체로 결합력은 약하고, ELISA(Enzyme linked immuno sorbent assay) 등에 이용하는 경우, 결합 후의 세정 조작 등으로, 단백질이 담체로부터 떨어져 버리는 일이 많다. 또한, 소수결합에 의해 특이적 단백질과 담체를 결합시켰을 경우, 단백질의 대부분이, 그 기능을 완전하게, 혹은 부분적으로 잃어 버리는 경우가 있다.
「공유결합」은, 특이적 단백질 중의 관능기(예를 들면 아미노기)와 담체 표면에 배치된 관능기(예를 들면 카르복실기)의 상호작용을 이용하는 것으로, 결합력은 강하다. 그러나, 공유결합에 의해 특이적 단백질과 담체를 결합시켰을 경우, 소수결합의 경우와 마찬가지로, 많은 단백질에 있어서, 그 기능은 완전하게, 혹은 부분적으로 잃게 되어 버린다.
소수결합이나 공유결합 외에도, 복수의 히스티딘을 단백질의 말단에 융합시키고, 이 히스티딘 태그를 가지는 융합 단백질을, 표면에 니켈이 배치된, 예를 들면 프로테인 칩 등의 기판 등에 결합시키는 방법이 알려져 있다. 그러나, 히스티딘 태그와 니켈 이온의 상호작용은 별로 강하지 않고, 또한 니켈 이온에는, 여러가지 생체 분자와의 비특이적인 결합이 알려져 있다.
일반적으로, 이러한 피검물질에 특이적으로 결합하는 단백질을 소수결합 또는 공유결합에 의해 결합시킨 고상(固相)을 이용한 특이적 결합 어세이계에 있어서, 백그라운드 시그널의 원인이 되는 비특이 결합을 저감시키는 것은, 중요한 과제이다. 이 과제를 해결하는 방법으로서, 예를 들면, 세균 성분 추출액을 검출용 시약에 함유시키는 방법(일본국 특허공개공보 소59-99257), 피검물질에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질 산생에 사용한 벡터와 동종이며 또한 해당 단백질을 코드하는 유전자를 포함하지 않는 벡터가 도입된 숙주 세포의 배양 성분을 시료에 첨가하는 방법(일본국 특허공개공보 평8-43392), 피검물질에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질을 산생한 세포와 동종이며, 또한 해당 단백질을 포함하지 않는 세포로부터의 수추출액(水抽出液)을 가열 처리한 후, 그 수용성 획분을 시료에 첨가하는 방법(일본국 특허공개공보 2004-301646) 등이 제안되고 있다. 이들 방법에 의해, 비특이 결합의 억제에는 일정한 효과를 볼 수 있다.
아비딘-비오틴 결합을 이용한 물질의 검출 방법
아비딘은, 흰자위 유래의 당단백질로 비오틴(비타민 H)에 지극히 강하게 결합한다. 아비딘과 비오틴의 상호작용은 가장 강한 비공유결합의 하나인(Green (1975) Adv Protein Chem 29: 85-133). 한편, 스트렙트아비딘은 방선균 유래의 아비딘양태 단백질로, 역시 비오틴과 강하게 결합한다. 지금까지 (스트렙트)아비딘-비오틴의 상호작용은, 그 작용력의 힘으로부터, 예를 들면, 항원이나 항체의 검출 등 분자생물학이나 생화학의 분야에서, 광범위하게 이용되고 있다(Green (1990) Methods Enzymol 184: 51-67).
이 아비딘이나 스트렙트아비딘의 비오틴 결합성을 이용하여, 단백질을 담체에 결합시키는 방법이 고안되고 있다. 즉(스트렙트) 아비딘을 공유결합이나 소수결합에 의해 마이크로 플레이트 등과 같은 기판에 결합하고, 또한 비오틴화한 단백질과 결합시킴으로써 고정화시키는 방법이다.
또한, 비오틴을 결합시킨 기판에, 우선 아비딘 단백질을, 아비딘-비오틴 결합에 의해서 결합시키고, 여기에 비오틴화한 소망하는 단백질을 결합시켜, 아비딘의 다른 비오틴 포켓에 결합시킴으로써, 기판-비오틴-아비딘-비오틴-소망하는 단백질이라는 순서로 고정시키는 기술이 보고되고 있다(일본국 특허공개공보 평4-236353). 이러한 방법으로 고정화한 플레이트를 이용하여 피검물질을 검출할 수 있다.
그러나, 아비딘-비오틴 결합을 이용한 어세이도, 피검물질에 특이적으로 단백질을 소수결합, 공유결합 등에 의해 결합시킨 고상을 이용한 어세이와 마찬가지로, 백그라운드 시그널에의 대처가 큰 문제이다. 이에 대해, 상술한 비특이 억제 방법에 더하여, 불활성화한 (스트렙트)아비딘을 결합시킨 고상에 시료를 접촉시킨 후에, 활성 (스트렙트)아비딘을 결합시킨 고상에 접촉시키는 방법(일본국 특허공개공보 평8-114590), 아비딘 결합 고상에 비오틴 화물질을 결합시킨 후에, 폴리에틸렌 글리콜과 비오틴의 포합체를 접촉시키는 방법(일본국 특허공개공보 평11-211727)이나 비오틴 함유 용액을 접촉시키는 방법(일본국 특허공개공보 2002-48794) 등이 제안되고 있다. 그러나, 실용상의 효과는 충분하다고는 말할 수 없었다.
지금까지, 단백질의 표지, 진단 마커나 세포 특이적 표적화 인자로서의 사용을 목적으로, 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 이용한 융합 단백질이 작성되어 왔다(Airenne et al. (1999) Biomol Eng 16: 87-92). 이들 중 특히 아비딘 또는 스트렙트아비딘과 scFv나 Fab 단편, IgG와 같은 항체와의 융합 단백질은, 암 세포 등에의 약제의 특이적 표적에의 응용 연구가 진행되고 있다. 또한, 스트렙트아비딘과 scFv와의 융합 단백질을 이용하고, scFv를 아비딘-비오틴 결합을 개재하여 고정화한 컬럼의 발상이 기재되어 있다(Kiprivanov et al. (1995) Hum Antib Hybrid 6:93-101, Dubel et al. (1995) J Immunol Methods 178:201-209). 그러나, 비오틴 결합성 단백질에 의한 고정화를 이용하여 생체 시료 중의 피검물질을 검출한 예는 알려지지 않았다. 스트렙트아비딘 융합 단백질을 비오틴화 플레이트에 고정화하고, 융합시킨 단백질을 항원으로 하는 항체를 이용하여 ELISA를 실시한 예(WO2002/046395)는 보고되고 있지만, 이것은, 스트렙트아비딘 융합 단백질을 담체에, 활성을 잃게 하는 일 없이 고정화하는 것이 가능한 것을 나타낸 것에 지나지 않는다.
비특허문헌 1: Green (1975) Adv Protein Chem 29: 85-133
비특허문헌 2: Green (1990) Methods Enzymol 184: 51-67
비특허문헌 3: Airenne et al. (1999) Biomol Eng 16: 87-92
비특허문헌 4: Kiprivanov et al. (1995) Hum Antib Hybrid 6: 93-101
비특허문헌 5: Dubel et al. (1995) J Immunol Methods 178: 201-209
비특허문헌 6: Takakura et al. (2009) FEBS J 276: 1383-1397
본 발명은, 생물학적 시료 중의 물질을 정성적, 및/또는, 정량적으로 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 특히, 생물학적 시료 중에 미량으로 존재하는 물질을, 백그라운드 시그널을 억제하면서, 정성적, 및/또는, 정량적으로 검출·측정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 예의 연구에 매진한 결과, 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 이용하여, 피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 담체에 고정화한 계를 개발했다. 그리고, 해당 계에 있어서, 특히 생물학적 시료 중에 미량으로 존재하는 물질을 검출하기 위해서는, 백그라운드 시그널에의 대처가 큰 문제가 된다는 것을 발견하고, 이를 저하시키는 궁리를 하여, 본 발명을 생각해 내었다. 구체적으로는, 생물학적 시료에 세포파쇄 추출액 및 비오틴 결합성 단백질을 첨가했을 경우에 있어서, 비특이 결합을 내리는 효과가 현저하였다. 혹은, 비오틴 결합성 단백질을 첨가하는 대신에, 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 결합시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액을 첨가하여도 같은 효과가 얻어졌다.
또한, 본 발명자들은, 검출 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 담체에 고정화한 계에 있어서, 생물학적 시료를 첨가하기 전에, 비오틴 결합성 단백질을 그 담체에 접촉(블로킹)시킴으로써, 보다 저농도의 물질을, 백그라운드 시그널을 억제하면서, 안정적으로 측정할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명은, 이상의 지견에 근거해서, 아비딘-비오틴 결합을 이용하여, 피검물질을 특이적으로 검출하는 물질을 담체에 고정화한 계에 있어서, 비특이 결합을 감소시킨 보다 감도가 높은 검출 방법을 제공하는 것이다.
한정되는 것은 아니지만, 본 발명은 이하의 양태를 포함한다.
[양태 1]
생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법으로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에,
(a) 생물학적 시료, 및
(b-i) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과, 비오틴 결합성 단백질, 혹은
(b-ii) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액
을 혼합하여 첨가한다; 그리고,
4) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는
것을 포함하는, 상기 방법.
[양태 2]
생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법으로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에, 비오틴 결합성 단백질을 접촉시켜 담체의 블로킹을 실시하고;
4) 공정 3)의 블로킹 공정 후, 융합 단백질이 결합한 담체에, 생물학적 시료를 첨가하고, 그리고,
5) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는
것을 포함하는, 상기 방법.
[양태 3]
생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법으로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에, 비오틴 결합성 단백질을 접촉시켜 담체의 블로킹을 실시하고;
4) 공정 3)의 블로킹 공정 후, 융합 단백질이 결합한 담체에,
(a) 생물학적 시료, 및
(b-i) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과, 비오틴 결합성 단백질, 혹은
(b-ii) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액
을 혼합하여 첨가한다; 그리고,
5) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는
것을 포함하는, 상기 방법.
[양태 4]
양태 1의 공정 3(b-i) 또는 양태 3의 공정 4(b-i)에 있어서, 세포파쇄 추출액으로서, 임의의 벡터를 포함하는 세포로부터 추출한 세포파쇄 추출액을 첨가하는, 양태 1 또는 3에 기재된 방법.
[양태 5]
비오틴 결합성 단백질이 타마비딘 또는 그 변이체인, 양태 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 방법.
[양태 6]
생물학적 시료가, 혈액, 혈청, 뇌척수액, 타액, 땀, 소변, 눈물, 림프액, 및 모유로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 방법.
[양태 7]
생물학적 시료 중의 물질을 검출하기 위한 담체로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에, 비오틴 결합성 단백질을 접촉시켜 담체의 블로킹을 실시하는
것을 포함하는 방법에 따라 조제된, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질이, 비오틴-비오틴 결합성 단백질간 결합에 의해서 결합하고 있는, 담체.
[양태 8]
생물학적 시료 중의 물질을 검출하기 위한 키트로서,
A) 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질이, 비오틴-비오틴 결합성 단백질간 결합에 의해서 결합하고 있는, 담체; 및,
B-i) A)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과 비오틴 결합성 단백질, 혹은
B-ii) A)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액을 포함하는, 생물학적 시료를 희석하기 위한 제; 및/또는
C) 비오틴 결합성 단백질을 포함하는 블로킹제
를 포함하는 키트.
본 발명의 방법에 의해, 생물학적 시료 중의 피검물질의 검출에 있어서, 백그라운드 시그널을 억제하여, 보다 고감도인 검출을 안정적으로 실시할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해, 특히 생물학적 시료 중에 미량으로 존재하고, 통상은 검출이 곤란한 물질의 검출도 가능하게 된다.
도 1은, 비오틴 결합성 단백질에 의한 블로킹의 모식도이다. 흰 동그라미는 비오틴을, 검은 타원은 비오틴 결합성 단백질을, 흰 타원은 피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질을 나타낸다. 도 1A: 비오틴 결합성 단백질에 의한 블로킹 없음, 융합 단백질의 고정화 있음; 도 1B: 비오틴 결합성 단백질에 의한 블로킹 없음, 융합 단백질의 고정화 없음; 도 1C: 비오틴 결합성 단백질에 의한 블로킹 있음, 융합 단백질의 고정화 있음; 도 1D: 비오틴 결합성 단백질에 의한 블로킹 있음, 융합 단백질의 고정화 없음.
도 2는, 대장균으로 발현시킨 SITH-1과 TM2의 융합 단백질을 웨스턴블롯에 의해 검출한 것이다. 대조로서 벡터만을 도입한 대장균을 이용했다.
도 3은, 비특이적 결합에 미치는 혈청에의 대장균파쇄추출액의 첨가 효과나, 타마비딘 2에 의한 블로킹 효과를 나타낸다. 도 3-1은, BSA(만)으로 블로킹했을 경우의 결과를 나타낸다. 즉, SITH-1-TM2 융합 단백질 고정화 플레이트(0.5% BSA Blocking)에 있어서의 측정치로부터, 아무것도 고정화되어 있지 않은 비오틴화 플레이트(0.5% BSA Blocking)에 있어서의 측정치를 공제한 결과를 나타낸다. 도 3-2는, BSA와 TM2로 블로킹 했을 경우의 결과를 나타낸다. 즉, SITH-1-TM2 융합 단백질 고정화 플레이트(50㎍/ml TM2/0.5% BSA Blocking)에 있어서의 측정치로부터, 아무것도 고정화되어 있지 않은 비오틴화 플레이트(50㎍/ml TM2/0.5% BSA Blocking)에 있어서의 측정치를 공제한 결과를 나타낸다.
도 4의 레인 2는, 대장균으로 발현시킨 Harpin과 TM2의 융합 단백질을 웨스턴블롯에 의해 검출한 것이다. 대조로서 벡터만을 도입한 대장균을 이용했다(레인 1).
도 2는, 대장균으로 발현시킨 SITH-1과 TM2의 융합 단백질을 웨스턴블롯에 의해 검출한 것이다. 대조로서 벡터만을 도입한 대장균을 이용했다.
도 3은, 비특이적 결합에 미치는 혈청에의 대장균파쇄추출액의 첨가 효과나, 타마비딘 2에 의한 블로킹 효과를 나타낸다. 도 3-1은, BSA(만)으로 블로킹했을 경우의 결과를 나타낸다. 즉, SITH-1-TM2 융합 단백질 고정화 플레이트(0.5% BSA Blocking)에 있어서의 측정치로부터, 아무것도 고정화되어 있지 않은 비오틴화 플레이트(0.5% BSA Blocking)에 있어서의 측정치를 공제한 결과를 나타낸다. 도 3-2는, BSA와 TM2로 블로킹 했을 경우의 결과를 나타낸다. 즉, SITH-1-TM2 융합 단백질 고정화 플레이트(50㎍/ml TM2/0.5% BSA Blocking)에 있어서의 측정치로부터, 아무것도 고정화되어 있지 않은 비오틴화 플레이트(50㎍/ml TM2/0.5% BSA Blocking)에 있어서의 측정치를 공제한 결과를 나타낸다.
도 4의 레인 2는, 대장균으로 발현시킨 Harpin과 TM2의 융합 단백질을 웨스턴블롯에 의해 검출한 것이다. 대조로서 벡터만을 도입한 대장균을 이용했다(레인 1).
1. 본 발명의 검출 방법(양태 1)
본 발명의 검출 방법(양태 1)은, 생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법으로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에,
(a) 생물학적 시료, 및
(b-i) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과, 비오틴 결합성 단백질, 혹은
(b-ii) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액
을 혼합하여 첨가한다; 그리고,
4) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는
것을 포함한다.
생물학적 시료 중의 검출 물질
본 발명은, 생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서의 생물학적 시료로서는, 검출 대상으로 되는 물질이 포함될 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 생물로부터 채취된 세포, 조직 또는 그 파편 등을 포함하는 시료, 예를 들면 체액, 더욱 바람직하게는, 혈액, 혈청, 뇌척수액, 타액, 땀, 소변, 눈물, 림프액, 및 모유 등이다.
이들 체액은, 필요에 따라 희석해서 이용한다. 희석율은 통상 2배 내지 10000배 정도, 바람직하게는 100배 내지 1000배 정도이지만, 이것에 한정되지 않는다. 희석하기 위한 용액은 임의의 완충액이 사용될 수 있는데, 적당한 블로킹제를 포함해도 된다. 블로킹제로서는, 비특이적인 결합을 억제하는 효과가 높은 것이 좋고, BSA나 카제인 등 , 당업자에게 주지의 블로킹제를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 양태 2는, 블로킹제로서 비오틴 결합성 단백질을 사용한다. 이에 관해서는 후술한다.
본 발명의 피검물질로서는, 생물학적 시료 중의 검출 또는 측정이 요망되는 물질이면 특별한 제한은 없지만, 항체나 항원 등의 단백질이나 그 단편, 펩티드, 핵산, 당질, 당지질 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명은 생물학적 시료 중, 농도가 낮고 종래의 방법에서는 검출이나 정확한 정량이 곤란했던 물질의 측정도 가능해진다. 예를 들면, 피검물질이 예를 들면 혈청 중의 항체이며, 또한 그 항체값이 낮은 경우(예를 들면, 혈청을 1000배 희석했을 경우에는 검출이 어렵지만, 100배 희석했을 경우에, 간신히 검출이 가능해지는 낮은 항체값의 경우)에는, 혈청의 희석율을 억제하는 것이 필요하게 되고, 그 결과, 혈청 중 성분에 유래하는 비특이적인 결합도 증가해 버리기 때문에, 기존의 방법에서는 해당 항체의 검출이나 정량은 곤란하지만, 본 발명의 방법에 따라 용이하게 검출, 혹은 보다 정확하게 정량하는 것이 가능해진다. 한정되는 것은 아니지만, 본 발명에 있어서의 피검물질로서 예를 들면, Small protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV-6(HHV-6의 잠복 감염 중간 단계 전사물에 의해서 코드되는 소단백질)(SITH-1)에 대한 항체가 포함된다. 그 외에도, 헤르페스 바이러스의 상기 이외의 항원에 대한 항체, 사이토메가로 바이러스, 간염 바이러스, HIV 바이러스, HTLV 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스 등에 유래하는 바이러스 관련 항원에 대한 항체, 혹은 헬리코박터·피로리균 등에 유래하는 세균 관련 항원에 대한 항체, 혹은 균류 관련 항원에 대한 항체 등을 들 수 있다.
PCT/JP2008/67300 및 미국 가출원 No.61/102441의 기재 내용에 근거하는 SITH-1
(1) SITH-1 단백질, 핵산
SITH-1 단백질, 핵산의 구조 및 기능은, PCT/JP2008/67300에 개시되어 있으며, 그 모든 내용이 본 명세서 중에 원용된다.
SITH-1은, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염에 관여하는 인자, 보다 상세하게는 헤르페스 바이러스의 잠복 감염 시에 특이적으로 발현하는 단백질이다. 여기서 「헤르페스 바이러스의 잠복 감염 시에 특이적으로 발현한다」라는 것은, 헤르페스 바이러스가 감염되어 있는 숙주에 있어서, 헤르페스 바이러스가 잠복 감염하고 있을(증식 감염하고 있지 않을) 때에, 특이적으로, 헤르페스 바이러스 유래의 유전자 또는 유전자 산물이 발현하는 것을 말한다.
SITH-1의 단백질 및 핵산으로서는, 예를 들면, (a) 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 및 이 단백질을 코드하는 핵산을 들 수 있다. 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 SITH-1 단백질은, 후술하는 참고예에 나타내는 바와 같이, 사람 헤르페스 바이러스-6(HHV-6)의 잠복 감염 시에 특이적으로 발현하는 단백질로서 단리·동정된 것이다. SITH-1 단백질은, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열을 가지며, 159 아미노산으로 이루어지는, 분자량 약 17.5kDa의 단백질이다.
SITH-1 단백질은, SITH-1 유전자의 핵산에 의해서 코드되고 있다. 이 SITH-1 유전자의 cDNA는, 서열 번호 3에 나타내는 바와 같이, 1795 염기쌍(약 1.79kbp)의 사이즈를 가지고 있으며, 954번째에서 956번째의 염기 서열이 개시 코돈(Kozak ATG)이며, 1431번째에서 1433번째의 염기 서열이 종지 코돈(TAA)이다. 따라서, 상기 SITH-1 핵산은, 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열 중, 954번째에서 1430번째까지의 염기 서열을 오픈 리딩 프레임(ORF)으로서 가지고 있으며, 이 ORF는, 477 염기쌍(약 0.48 kbp)의 사이즈를 가지고 있다. SITH-1의 cDNA 중, ORF 영역을 나타내는 염기 서열을 서열 번호 2로 나타낸다. 또한, 서열 번호 2로 나타내는 염기 서열은, 스탑코돈의 3 염기를 포함하여 기재하고 있다.
SITH-1 핵산은, HHV-6이 잠복 감염하고 있는 세포의 세포질에 있어서 항상 발현하고 있는 한편, 증식 감염 세포에서는 발현이 인정되지 않는다. SITH-1 단백질을 코드하는 핵산은, 지금까지 보고한 HHV-6 잠복 감염 특이적 유전자(H6LT)와 상보사슬의 관계에 있는 DNA로 코드되며, 그 발현은, HHV-6의 잠복 감염의 중간 단계에서 증강한다. 이러한 사실로부터, SITH-1 단백질은, HHV-6의 잠복 감염 시에 특이적으로 발현하는 단백질이라고 생각된다.
SITH-1 단백질은, 숙주 단백질인 CAML(calcium-modulating cyclophilin ligand, Accesion #; U18242,)과 결합하고, 그리어 세포내 칼슘 농도를 상승시킨다. CAML은 숙주 생체 내에 있어서, 뇌와 임파구에 많이 존재하며, 세포내의 칼슘 농도를 상승시키는 것이 알려져 있는 단백질이다. 또한, SITH-1 단백질의 발현에 의한 세포내 칼슘 농도의 상승은, 잠복 감염 세포내의 전반적인 시그널 전달의 활성화를 가져와, HHV-6의 효율적인 재활성화에 기여하는 것이라고 생각된다.
HHV-6은 뇌 내의 그리어 세포로 잠복 감염하는 것이 알려져 있으며, 잠복 감염 시나 활성이 높은 잠복 감염 상태인 중간 단계에 있는 HHV-6이 SITH-1을 발현시키면, 그리어 세포내의 칼슘 농도가 상승하는 것이라고 생각된다. 뇌의 세포에 있어서의 세포내 칼슘 농도의 상승은, 기분 장해 등의 정신 장해와 많이 관계하는 것이라고 생각되고 있다(이화학 연구소 연보 2003).
SITH-1 단백질은, 숙주의 단백질인 CAML과 결합하는 활성을 유지하여, 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 기능을 가지는 것이다. 또한, SITH-1 단백질을, 이 단백질이 가장 강하게 발현한다고 생각되는 뇌 내의 그리어 세포로 발현시킴으로써, 정신 장해를 유도할 수 있다. 그러므로, SITH-1 단백질은, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염 시 또는 재활성화 초기에 발현하여, 숙주에게 정신 장해를 일으키게 하는 기능을 가진다고 생각된다.
(2) SITH-1에 대한 항체
SITH-1에 대한 항체는, SITH-1 단백질 또는 그 변이체, 혹은 그들의 부분 펩티드를 항원으로 하여, 공지의 방법에 의해 폴리클로널 항체 또는 모노클로널 항체로서 얻어진다. 공지의 방법으로서는, 예를 들면, 문헌(Harlow들의 「Antibodies: A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork(1988)), 이와사키들의 「단클론 항체 하이브리도마와 ELISA, 강담사(1991)」」에 기재의 방법을 들 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 항체는, SITH-1 단백질의 검출·측정 등에 이용할 수 있다.
용어 「항체」는, 면역 글로블린(IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 이들의 Fab프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트, Fc프래그먼트)를 의미하고, 예로서는, 폴리클로널 항체, 모노클로널 항체, 단쇄항체, 항이디오타이프 항체 및 사람화 항체를 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 「SITH-1 단백질을 인식하는 항체」는, SITH-1 단백질에 특이적으로 결합 할 수 있는 완전한 분자 및 항체 프래그먼트(예를 들면, Fab 및 F(ab')2 프래그먼트)를 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 및 SITH-1 항체의 다른 프래그먼트는, 본 명세서 중에서 개시되는 방법, 또는 공지의 방법에 따라서 사용될 수 있다. 이러한 프래그먼트는, 대표적으로는, 파파인(Fab프래그먼트를 생성한다) 또는 펩신(F(ab')2 프래그먼트를 생성한다)과 같은 효소를 사용하는 단백질 분해에 의한 절단에 의해서 산생된다.
기분 장해 환자, 또는, 기분 장해의 가능성이 있는 개체는, SITH-1 단백질의 발현량이 증가하고 있으며, 그 결과 SITH-1 항체값도 상승하고 있다고 생각된다. 본 발명은, 한 양태에 있어서, 생물학적 시료 중의 SITH-1 항체를 검출함으로써, 기분 장해 환자 또는 기분 장해의 가능성이 있는 개체를 동정하는 것을 가능하게 한다.
검출해야 하는 물질과 특이적으로 결합하는 닥백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질이 결합한 담체(양태 1의 공정 1) 및 2))
본 발명의 검출 방법은, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질이, 비오틴-비오틴 결합성 단백질간 결합에 의해서 결합하고 있는, 담체를 이용한다.
본 발명의 담체는,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하는,
것을 포함하는 방법에 따라 작성할 수 있다.
비오틴을 결합시킨 담체
「비오틴」이란, D-[(+)-cis-헥사히드로-2-옥소-1H-티에노(3,4)-이미다졸-4-발레르산]의 일반 명칭이다. 비타민 B군으로 분류되는 수용성 비타민의 일종으로, 비타민 B7(Vitamin B7)이라고도 불리는, 혹은, 비타민 H, 보효소 R이라고 불리기도 한다. 비오틴은 흰자 중에 포함되는 당단백질의 일종, 아비딘과 매우 강하게 결합하여, 그 흡수가 저해된다. 그 때문에, 생난백의 대량 섭취에 의해서 비오틴 결핍증을 일으키는 일이 있다.
본 명세서 중에서 「비오틴」이란, 상기 비오틴 외에, 이미노비오틴(iminobiotin)(Hofmann et al.(1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 4666-4668)이나, 데스티오비오틴(desthiobiotin)(Hirsch et al.(2002) Anal Biochem 308: 343-357), 혹은 비오시틴(biocytin)이나 비오틴 설폭시드(Biotin sulfoxide) 등의 비오틴 유연체도 포함한다.
비오틴-아비딘(비오틴 결합성 단백질) 복합체를 이용한 시스템은, 조직 면역학이나 DNA 분석, 임상 검사 등의 분야에서 널리 이용되고 있다. 본 발명의 단백질을 담체에 결합하는 방법은, 비오틴 결합성 단백질에 소기의 단백질을 결합시킨 융합 단백질을, 비오틴-아비딘 결합을 이용하여, 담체에 결합시키는 것이다. 본 발명의 방법에서는, 종래의 비오틴-아비딘 결합을 이용한 결합과 비교하여, 단백질의 기능을 해치는 일 없이, 훨씬 효율 좋게 작용시키는 것이 가능하게 된다.
고체 담체를 구성하는 재료는, 셀룰로오스, 테플론(등록상표), 니트로 셀룰로오스, 아가로스, 덱스트란, 키토산, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리디비닐리덴디플루오라이드, 라텍스, 실리카, 유리, 유리 섬유, 금, 백금, 은, 동, 철, 스테인레스 스틸, 페라이트, 실리콘 웨이퍼, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌이민, 폴리 락트산, 수지, 다당류, 단백(알부민 등), 탄소 또는 그들의 조합, 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 또한, 일정한 강도를 가지며, 조성이 안정적이고, 또한 비특이 결합이 적은 것이 바람직하다.
고체 담체의 형상은, 비즈, 자성 비즈, 박막, 미세관, 필터, 플레이트, 마이크로 플레이트, 카본나노튜브, 센서 칩 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 박막이나 플레이트 등이 평탄한 고체 담체는, 해당 기술 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 피트, 홈, 필터 저부 등을 설치해도 된다.
발명의 한 양태에 있어서, 비즈는, 약 25nm~약 1mm의 범위의 구체 직경을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서는, 비즈는 약 50nm~약 10㎛의 범위의 직경을 가진다. 비즈의 사이즈는 특정의 적용에 따라 선택될 수 있다. 어느 정도의 세균 스포어는 약 1㎛의 오더의 사이즈를 가지므로, 이러한 스포어를 포착하기 위한 바람직한 비즈는 1㎛보다 큰 직경을 가진다.
한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 높은 검출 감도가 요망되는 경우에 있어서는, 검출해야 할 물질과 이것에 특이적으로 결합하는 물질의 접촉 빈도나 세정 조작의 용이성이라는 관점에서, 고체 담체로서 상기와 같은 비즈를 바람직하게는 사용할 수 있다.
비오틴을 담체에 결합시키는 방법으로서 예를 들면 비오틴화 시약을 이용하는 방법을 들 수 있다. 비오틴화 시약으로서 예를 들면, PIERCE 사제의(괄호 안은 순서대로 링커 길이, 반응기) EZ-Link(등록상표) Sulfo-NHS-Biotin(13.5Å, 1급 아민), EZ-Link(등록상표) Sulfo-NHS-LC-Biotin(22.4Å, 1급 아민), EZ-Link(등록상표) Sulfo-NHS-LCLC-Biotin(30.5Å, 1급 아민), EZ-Link(등록상표) PFP-Biotin(9.6Å, 아민), EZ-Link(등록상표) Maleimide-PEO2-Biotin(29.1Å, 티올기), EZ-Link(등록상표) Biotin-PEO2 Amine(20.4Å, 카르복실기), EZ-Link(등록상표) Biotin-PEO3-LC Amine(22.9Å, 카르복실기), EZ-Link(등록상표) Biotin-Hydrazide(15.7Å, 알데히드기), EZ-Link(등록상표) Biotin-LC-Hydrazide(24.7Å, 알데히드기), EZ-Link(등록상표) NHS-Iminobiotin(13.5Å, 1급 아민) 등을 이용할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
상기 비오틴화 시약을 이용하여, 마이크로 플레이트, 미소 비즈, 혹은 센서 칩 등 소망하는 담체에, 공지의 방법을 사용하여 비오틴을 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 아미노기, 카르복실기, 티올기, 토실기, 에폭시기, 마레이미드기, 활성화 에스테르 등 여러 가지의 관능기를 가지는 담체(예를 들면 자성 비즈, 세파로오스비즈, 아가로스비즈, 라텍스비즈, 마이크로타이터 플레이트 등)를 이용하는 방법이 있다. 이 경우 예를 들면, NHS 에스테르를 포함하는 비오틴화 시약을 이용하는 경우는, DMSO(demethylsulfoxide)와 같은 유기용매이거나, pH7-9의 인산 완충액으로 용해하고, 아미노기를 가지는 고정화 담체에 첨가함으로써 비오틴을 결합시킬 수 있다. 또한, 예를 들면 아미노기를 포함하는 비오틴화 시약을 이용하는 경우는, EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)과 같은 카르보디이미드를 이용하여 고정화 담체의 카르복실기를 활성화 에스테르로 변환시킨 후, pH5 부근의 완충액으로 용해한 비오틴화 시약을 첨가하여, 비오틴을 결합시켜도 된다. 또한, 비오틴화한 고정화 담체는, 바람직하게는 미반응의 관능기를 불활성화한 후, BSA 등으로 블로킹한다.
또한, 비오틴화된 시판 담체를 이용할 수도 있다. 비오틴화된 마이크로 플레이트로서는, 예를 들면, Reacti-BindTM Biotin Coated Polystyrene Plates(PIERCE사제)를 이용할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 비오틴화된 미소 비즈로서는, 예를 들면, 자성 비즈로서 BioMag Biotin(Polysciences사제)가, 나노 자성 비즈로서 코어 프런트사제의 nanomag(등록상표)-D biotin, nanomag(등록상표)-silica biotin이, 폴리스티렌제 마이크로 비즈로서 Beadlyte(등록상표) Biotin Beads(Upstate사제)가, 아가로스로서 Sigma사제의, Biotin Agarose, 2-iminobiotin-Agarose가, 고가교 아가로스로서 Biotin-Sepharose(바이오리서치 테크놀로지사제)를 이용할 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다.
담체와 비오틴과 연결하는 링커의 길이는, 적어도 5Å보다 긴 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 13.5Å 이상, 보다 바람직하게는 22.4Å 이상, 더욱 바람직하게는 30.5Å 이상이다.
검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질
피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질(이하, 「특이적 단백질」이라고 부르는 경우가 있다)은, 특별히 한정되지 않는다. 해당 발명에 의한 하나의 양태로서는, 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만, 항원과 항체, 호르몬 등의 리간드와 수용체, 렉틴과 당, 핵산의 상보적 결합 등에 있어서, 그 한 쪽을, 다른 쪽과의 특이적인 복합체 형성 능력을 이용하여, 피검시료로부터 선택적으로 분석한다.
보다 상세하게는, 예를 들면 단백질로서는, 항체, 항원 단백질, 렉틴, 펩티드, 혹은 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 수용체, 효소 단백질 등을 들 수 있다. 항체로서는, IgG 외에, scFv나 Fab 등의 항원 결합 부위를 포함한 항체 단편이, 항원 단백질로서는, B형·C형 간염 바이러스, HIV, 인플루엔자, 헤르페스 바이러스 등의 바이러스 유래의 단백질이나, 헬로코박터·파이로리 등의 세균 유래의 단백질, 혹은 CEA, PSA 등의 종양마커, 성호르몬 등을 들 수 있다. 렉틴은, 당결합성 단백질이며, 만노스 특이적 렉틴, GalNAc 특이적 렉틴, GlcNAc 특이적 렉틴, 후코스 특이적 렉틴, 시알산 특이적 렉틴 등의 단당 특이적 렉틴, 올리고당 특이적 렉틴 등을 들 수 있다. 또한, DNA/RNA 결합 단백질 등도 들 수 있다. 또한 펩티드로서는, 2~100 아미노산으로 이루어지는 것, 바람직하게는 4~50 아미노산으로 이루어지는 것, 보다 바람직하게는 6~30 아미노산으로 이루어지는 것을, 예로서 들 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다.
또한, 한정되는 것은 아니지만, 본 발명에 있어서, 피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질의 예로서 SITH-1 단백질을 들 수 있다.
비오틴 결합성 단백질
본 발명은, 비오틴-비오틴 결합성 단백질의 사이의 결합을 이용하여, 피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질을 담체에 고정하는 것을 포함한다. 본 발명에 있어서, 「비오틴-비오틴 결합성 단백질의 사이의 결합」을 「아비딘-비오틴 결합」이라고 부르는 경우가 있다.
비오틴 결합성 단백질로서는, 아비딘, 스트렙트 아비딘, 뉴트라 아비딘, AVR 단백질(Biochem. J., (2002), 363: 609-617), 브라다비딘(Bradavidin)(J. Biol. Chem., (2005), 280: 13250-13255), 리자비딘(Rhizavidin)(Biochem. J., (2007), 405: 397-405), 타마비딘(WOO2/072817)나 이들의 변이체 등 , 비오틴과 강하게 결합하는 단백질이면, 모두 적합하게 사용할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 비오틴과의 해리 정수(KD)가 10-6, 더욱 바람직하게는 10-8 이하, 더욱 바람직하게는 10-10 이하이다. 단, 피검시료에 첨가하는 비오틴 결합성 단백질, 및 담체 블로킹에 사용하는 비오틴 결합성 단백질에 관해서는, 후술하는 바와 같다.
비오틴 결합성 단백질로서, 특히, 대장균으로 고발현하는 타마비딘와 그 변이체를 바람직하게 이용할 수 있다. 타마비딘는, 식용 버섯인 담자균 노랑느타리버섯(Pleurotus conucopiae)으로부터 발견된 비오틴 결합성 단백질이다(WOO2/072817, Takakura et al.(2009) FEBSJ276: 1383-1397). 타마비딘의 변이체로서는, 예를 들면, 고결합능·저비특이 결합 타마비딘(PCT/JP2009/64302) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「타마비딘」는, 타마비딘 1, 타마비딘 2, 또는 그들의 변이체를 의미한다. 구체적으로는, 본 발명의 타마비딘은 전형적으로는, 서열 번호 5 혹은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 단백질, 또는, 서열 번호 4 혹은 서열 번호 6의 염기 서열을 포함해서 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질이어도 된다. 혹은, 본 발명의 타마비딘은, 서열 번호 5 혹은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 단백질, 또는, 서열 번호 4 혹은 서열 번호 6의 염기 서열을 포함해서 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질,의 변이체로서, 타마비딘 1 또는 2와 마찬가지의 비오틴 결합 활성을 가지는 단백질, 혹은, 고결합능·저비특이 결합의 활성을 가지는 단백질이어도 된다. 본 명세서에 있어서, 타마비딘 1, 타마비딘 2, 및 그들의 변이체를 총칭하여, 단지 타마비딘이라고 부르는 일이 있다.
타마비딘 1 또는 2의 변이체는, 서열 번호 5 또는 7의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산의 결실(缺失), 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 단백질이며, 타마비딘 1 또는 2와 마찬가지의 비오틴 결합 활성을 가지는 단백질이어도 된다. 치환은, 보존적 치환이어도 되며, 이것은, 특정의 아미노산잔기를 유사한 물리화학적 특징을 가지는 잔기로 치환한 것이다. 보존적 치환의 비한정적인 예에는, Ile, Val, Leu 또는 Ala 상호의 치환과 같은 지방족기 함유 아미노산잔기의 사이의 치환, Lys 및 Arg, Glu 및 Asp, Gln 및 Asn 상호의 치환과 같은 극성잔기의 사이에서의 치환 등이 포함된다.
아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가에 의한 변이체는, 야생형 단백질을 코드하는 DNA에, 예를 들면 주지 기술인 부위 특이적 변이 유발(예를 들면, Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982 참조, 인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)을 실시함으로써 작성할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「1 또는 복수의 아미노산」이란, 바람직하게는 부위 특이적 변이 유발법에 의해 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가할 수 있는 정도의 아미노산을 의미한다. 또한, 본 명세서에 있어서 「1 또는 복수의 아미노산」이란, 경우에 따라, 1 또는 여러개의 아미노산을 의미해도 된다. 한정되는 것은 아니지만, 「1 또는 복수의 아미노산」이란, 50개 이내, 바람직하게는, 40개 이내, 30개 이내, 20개 이내, 10개 이내, 8개 이내, 5개 이내, 3개 이내의 아미노산을 의미한다. 타마비딘 1 또는 2의 변이체는 또한 서열 번호 5 또는 7의 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.3% 이상의 아미노산 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 단백질이며, 타마비딘 1 또는 2와 같은 비오틴 결합 활성을 가지는 단백질, 혹은, 고결합능·저비특이 결합의 활성을 가지는 단백질이어도 된다.
2개의 아미노산 서열의 동일성 %는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해서 결정해도 된다. 혹은, 2개의 단백질 서열의 동일성 퍼센트는, Needleman, S. B. 및 Wunsch, C. D.(J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970)의 알고리즘에 근거하고, 그리고 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹(UWGCG)으로부터 입수 가능한 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써, 결정해도 된다. GAP 프로그램의 바람직한 디폴트 파라미터에는: (1) Henikoff, S. 및 Henikoff, J. G.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992)에 기재되는 바와 같은, 스코어링·매트릭스, blosum62; (2) 12의 갭 가중; (3) 4의 갭 길이 가중; 및 (4) 말단 갭에 대한 패널티 없음,이 포함된다.
당업자에게 이용되는, 서열 비교의 다른 프로그램도 또한, 이용해도 된다. 동일성의 퍼센트는, 예를 들면 Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재되어 있는 BLAST 프로그램을 이용하여 서열 정보와 비교해서 결정하는 것이 가능하다. 해당 프로그램은, 인터넷상에서 Natlonal Center for Biotechnology Information(NCBI), 혹은 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹 사이트로부터 이용하는 것이 가능하다. BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은 동사이트에 자세하게 기재되어 있으며, 일부의 설정을 적당히 변경하는 것이 가능하지만, 검색은 통상 디폴트치를 이용하여 실시한다. 또는, 2개의 아미노산 서열의 동일성%는, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스제)등의 프로그램, 또는, FASTA 알고리즘 등을 이용해서 결정해도 된다. 그 때, 검색은 디폴트치를 이용해도 된다.
2개의 핵산 서열의 동일성%은, 시각적 검사와 수학적 계산에 의해 결정 가능한거나, 또는 보다 바람직하게는, 이 비교는 컴퓨터·프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 이루어진다. 대표적인, 바람직한 컴퓨터·프로그램은, 유전학 컴퓨터·그룹(GCG; 위스콘신주 매디슨)의 위스콘신·패키지, 버젼 10.0 프로그램 「GAP」이다(Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387). 이 「GAP」프로그램의 사용에 의해, 2개의 핵산 서열의 비교 외에, 2개의 아미노산 서열의 비교, 핵산 서열과 아미노산 서열의 비교를 실시할 수 있다.
또한, 담체에 결합시키는 융합 단백질을 구성하는 「비오틴 결합성 단백질」은, 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 담체에 융합 단백질을 결합시켜서, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하기 위해서 이용되는 것이다. 따라서, 한정되는 것은 아니지만, 상기 타마비딘 1 또는 타마비딘 2의 변이체는, 이러한 야생형을 이용하여 융합 단백질을 형성했을 경우와 비교해서, 비오틴 결합 활성이 크게 감소하고 있지 않는 것이 바람직하다.
따라서, 비한정적으로, 타마비딘 1의 변이체는, 서열 번호 5의 아미노산 서열에 있어서, N14, S18, Y34, S36, S78, W82, W98, W110, D118이 개편되지 않는 것이 바람직하다. 또한 표기의, 예를 들면 Y34는, 서열 번호 5의 아미노산 서열의 제34번째의 티로신잔기를 의미한다. 혹은, 이들을 개변하는 경우에는, 성질 혹은 구조가 유사한 아미노산으로 개변하는 것이 바람직하고, 예를 들면 아스파라긴(N14)의 경우는, 글루타민(Q)이나 아스파라긴산(D)으로, 바람직하게는 아스파라긴산으로, 세린(S18, S36, S78)의 경우는, 트레오닌(T) 혹은 티로신(Y)으로, 바람직하게는 트레오닌으로, 티로신(Y34)의 경우는, 세린(S)이나 트레오닌(T) 혹은 페닐알라닌(F)으로, 바람직하게는 페닐알라닌으로, 트립토판(W82, W98, W110)의 경우는, 페닐알라닌(F)으로, 아스파라긴산(D118)의 경우는, 글루타민산(E)이나 아스파라긴(N)으로, 바람직하게는 아스파라긴으로, 각각 개변하는 것이 바람직하다.
또한, 타마비딘 2의 변이체는, 서열 번호 7의 아미노산 서열에 있어서, 4개의 트립트판잔기(W69, W80, W96, W108)가 개변되지 않는 것이 바람직하다. 혹은, 이들을 개변하는 경우에는, 성질 혹은 구조가 유사한 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌(F)으로의 개변이 바람직하다. 또한, 비오틴과 직접 상호작용 한다고 생각되는 아미노산잔기(N14, S18, Y34, S36, S76, T78, D116)에 관해서도 개변되지 않는 것이 바람직하다. 혹은, 이것들을 개변하는 경우에는 비오틴과의 결합을 유지할 수 있도록, 성질 혹은 구조가 유사한 아미노산으로 개변하는 것이 바람직하고, 예를 들면 아스파라긴(N14)의 경우는, 글루타민(Q)이나 아스파라긴산(D)으로, 바람직하게는 아스파라긴산으로, 아스파라긴산(D40)의 경우는, 아스파라긴(N)으로, 세린(S18, S36, S76)의 경우는, 트레오닌(T) 혹은 티로신(Y)으로, 바람직하게는 트레오닌으로, 티로신(Y34)의 경우는, 세린(S)이나 트레오닌(T) 혹은 페닐알라닌(F)으로, 바람직하게는 페닐알라닌으로, 트레오닌(T78)의 경우는, 세린(S)이나 티로신(Y)으로, 바람직하게는 세린으로, 아스파라긴산(D116)의 경우는, 글루타민산(E)이나 아스파라긴(N)으로, 바람직하게는 아스파라긴으로, 각각 개변하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 바람직한 타마비딘 개변체에는 이하의 것이 포함된다.(PCT/JP2009/64302).
서열 번호 7에 기재의 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1부터 여러개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서, 이하의 그룹
1) 서열 번호 7의 104번째의 아르기닌잔기;
2) 서열 번호 7의 141번째의 리신잔기;
3) 서열 번호 7의 26번째의 리신잔기;및
4) 서열 번호 7의 73번째의 리신잔기
로부터 선택되는 1 또는 복수의 잔기가, 산성 아미노산잔기 또는 중성 아미노산잔 기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 개변형 비오틴 결합 단백질이다.
보다 바람직하게는, 서열 번호 7에 있어서, 104번째의 아르기닌잔기가 글루타민산잔기로 치환되어 있어며, 그리고, 141번째의 리신잔기가 글루타민산잔기로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(R104E-K141E);
서열 번호 7에 있어서, 40번째의 아스파라긴산잔기가 아스파라긴잔기로 치환되어 있으며, 그리고, 104번째의 아르기닌잔기가 글루타민산잔기로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(D40N-R104E);
서열 번호 7에 있어서, 40번째의 아스파라긴산잔기가 아스파라긴잔기로 치환되어 있으며, 그리고, 141번째의 리신잔기가 글루타민산잔기로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(D40N-K141E); 및,
서열 번호 7에 있어서, 40번째의 아스파라긴산잔기가 아스파라긴잔기로 치환되어 있으며, 104번째의 아르기닌잔기가 글루타민산잔기로 치환되어 있으며, 그리고, 141번째의 리신잔기가 글루타민산잔기로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(D40N-R104E-K141E),
로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 개변형 비오틴 결합 단백질이다.
피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질
본 발명은, 피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질(이하, 「비오틴 결합성 단백질 융합 단백질」, 또는 「융합 단백질」이라고 부르는 경우가 있다.)을 담체에 고정한다.
비오틴 결합성 단백질 융합 단백질의 준비의 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 공지의 유전자 공학적 수법을 이용하여 발현시켜도 된다. 예를 들면, 비오틴 결합성 단백질과 소망하는 단백질의 융합 단백질을 코드하는 유전자를, 대장균 등의 발현 시스템을 이용하여 발현함으로서 취득할 수 있다. 또한 대장균으로 고발현시키려면 타마비딘이나 그 변이체가 적합하다.
비오틴 결합성 단백질 융합 단백질에 있어서, 비오틴 결합성 단백질과 소망하는 단백질은 직접 결합하고 있어도 되며, 혹은 링커를 개재하여 결합하고 있어도 되지만, 아미노산의 링커를 통한 결합이 바람직하다. 이 링커의 길이는, 적어도 1 아미노산 이상이면 좋지만, 바람직하게는 5 아미노산 이상, 더욱 바람직하게는 6 아미노산 이상이다. 또한, 담체와 결합하고 있는 비오틴과 타마비딘과의 결합력을 한층 향상시키기 위해서는, 바람직하게는 10 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 12 아미노산 이상, 15 아미노산 이상, 18 아미노산 이상, 더욱 바람직하게는 25 아미노산 이상이다. 또한, 이러한 링커는 타마비딘 융합 단백질의 활성도 향상시킨다고 추측된다. 이 링커를 구성하는 아미노산은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 글리신, 세린, 혹은 알라닌과 같은 중성 아미노산의 반복으로부터 된다.예를 들면, 이들로 한정되지 않지만, GGGGS, GGSGG, GASAG, GSGAA, GSGSA, GGGGSG, GGGSGGS, GGSGGGGS, AAAAGSGAA, GGGGSGGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 8-18)등을 들 수 있다.
또한 비오틴 결합성 단백질은, 소망하는 단백질의 N 말단측, 혹은 C 말단측 중 어느 쪽에 결합시켜도 된다. 또한 소망하는 단백질을 발현시킴에 있어서, 예를 들면 대장균의 세포질보다도 페리프라즘 공간의 쪽이 적합한 경우에는, 페리프라즘에 표적하기 위한 리더 서열을 이용해도 된다. 이러한 리더 서열로서 PelB(Lei et al. (1987) J Bacteriol 169: 4379-4383)나 OmpA(Gentry-Weeks et al. (1992) J Bacteriol 174: 7729-7742) 등이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
비오틴 결합성 단백질 융합 단백질이 가용성 획분으로부터 얻어지는 경우에는, 조단백 추출액을 정제하는 일 없이, 비오틴화 담체와 접촉시켜, 융합 단백질을 비오틴화 담체에 결합시켜도 된다. 이것을 그 후 충분히 세정함으로써, 융합 단백질의 정제와 담체에의 고정화를 한 번에 할 수 있다. 혹은 이미노비오틴 등 (Hofmann et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 4666-4668)의 비오틴 유연체가 결합한 컬럼을 이용하여 정제하고 나서, 비오틴화 담체에 결합시킬 수도 있다.
혹은 또한, 비오틴 결합성 단백질 융합 단백질의 N 말단 혹은 C 말단에, 한층 더 정제용의 태그를 부가해도 된다. 이러한 태그로서 예를 들면, c-myc 에피톱 태그(Munro and Pelham(1986) Cell 46: 291-300)나 히스티딘 태그(Hochuli et al (1988) Bio/Technol 6: 1321-1325, Smith et al. (1988) J Biol Chem 263: 7211-7215), Halo 태그(Los and Wood(2007) Methods Mol Biol 356: 195-208), Flag 태그(Einhauer and Jungbauer(2001) J Biochem Biophys Methods 49: 455-465) 등이 있으며, 혹은 그들의 조합도 생각할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
융합 단백질이 불용성 획분으로부터 얻어지는 경우에는, 예를 들면 요소나 염산 구아니딘과 같은 카오트로픽염을 이용해서, 한 번 단백질을 가용화하고, 그 후 투석 등을 이용하여, 카오트로픽염을 서서히 뽑으면서, 단백질의 리폴딩(refolding)을 촉구한다, 공지의 방법이 취해지는(Sano and Cantor(1991) Bio/Technology 9: 1378-1381, Sano et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1534-1538).
혹은 또한, 소망하는 단백질이 대장균 내에서 불용성 획분에 발현하는 경우, 예를 들면, 마르토스 결합 단백질(Bach et al.(2001) J Mol Biol 312: 79-93)이나, 티오레독신(Jurado et al. (2006) J Mol Biol 357: 49-61), 글루타티온 S트란스페라제(Tudyka and Skerra (1997) Protein Sci 6: 2180-2187), 혹은 Ideno et al (2004) Appl Microbiol Biotechnol 64: 99-105에 기재되어 있는 샤페론류를 공발현시키거나, 혹은 융합 단백질에 더 샤페론을 융합시킨 3련융합 단백질을 제작해도 된다. 또한, 마르토스 결합 단백질, 티오레독신, 글루타티온 S트란스페라제는 정제용의 태그로서도 이용할 수 있다.
융합 단백질의 발현 시스템으로서 곤충 세포나 식물세포, 포유류 세포, 효모 세포, 고초균 세포, 무세포 발현계 등, 다른 공지의 발현계로 발현시켜도 된다. 특히 융합 상대의 단백질이 식물세포로 발현하는 경우(예를 들면 식물 렉틴 등)는, 해당 융합 단백질도 식물세포의 발현계로 발현시키는 것이 바람직하다. 당업자는, 융합 상대의 단백질의 성질을 고려하여 적절한 발현계를 선택하는 것이 가능하다.
융합 단백질의 담체에의 결합
본 발명에 있어서는, 비오틴을 결합시킨 담체와 비오틴 결합성 단백질 융합 단백질을 준비하여, 양자를 접촉시킴으로써, 아비딘-비오틴 결합을 개재하여 담체에 단백질을 결합시킬 수 있다.
한정되는 것은 아니지만, 비오틴 결합성 단백질 융합 단백질을 포함하는 세포파쇄 조추출액을, 0.1mg/ml 내지 5mg/ml, 바람직하게는 0.2mg/ml 내지 2mg/ml의 총단백질 농도로 준비한다. 이것을, 10℃ 내지 40℃에서, 바람직하게는 20℃ 내지 30℃에서, 5분 내지 2시간, 바람직하게는 30분 내지 1시간, 비오틴을 결합시킨 담체와 접촉시킨다. 혹은 또한, 0.1㎍/ml 내지 5㎍/ml 의 농도의 정제한 비오틴 결합성 단백질 융합 단백질을, 비오틴을 결합시킨 담체와 접촉시켜도 된다.
담체에의 생물학적 시료의 첨가(양태 1의 공정 3)
본 발명의 양태 1의 방법은, 융합 단백질이 결합한 담체를 준비한 후에, 공정 3)으로서,
공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에,
(a) 생물학적 시료, 및
(b-i) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과, 비오틴 결합성 단백질, 혹은
(b-ii) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액
을 혼합하여 첨가하는, 것을 포함한다.
일반적으로, 담체를 이용한 검출 방법에 있어서, 백그라운드 시그널의 원인이 되는 비특이 결합을 저감시키기 위해, 세균 성분 추출액을 검출용 시약에 함유 시키는 방법(일본국 특허공개공보 소59-99257), 피검물질에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질 산생에 사용한 벡터와 동종이며 또한 해당 단백질을 코드하는 유전자를 포함하지 않는 벡터가 도입된 숙주 세포의 배양 성분을 시료에 첨가하는 방법(일본국 특허공개공보 평8-43392), 피검물질에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질을 산생한 세포와 동종이며, 또한 해당 단백질을 포함하지 않는 세포로부터의 물추출액을 가열 처리한 후, 그 수용성 획분을 시료에 첨가하는 방법(일본국 특허공개공보 2004-301646) 등이 알려져 있다.
본 발명자들은, 상기의 방법을 융합 단백질의 계에 시도했지만, 충분한 효과를 얻을 수 없었다. 그러나, 열심히 연구의 결과, 보다 현저한 효과를 얻는 방법을 생각해냈다. 구체적으로는, 피검시료를 담체에 접촉시킬 때에, 세포파쇄 추출액, 및 비오틴 결합성 단백질의 양쪽을 동시에 존재시키면 바람직하다는 것을 발견하였다.
일 양태에 있어서, 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과 비오틴 결합성 단백질을, 생물학적 시료와 혼합하여 첨가한다. 피검시료에, 비오틴 결합성 단백질과 세포의 파쇄추출액을 더하는 경우, 어느 것을 먼저 첨가해도 되며, 또한 동시에 첨가해도 된다. 혹은 비오틴 결합성 단백질과 세포의 파쇄추출액을 혼합한 후에 피검시료에 첨가해도 된다.
다른 일 양태에 있어서, 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액을 피검시료에 혼합해 첨가해도 된다. 구체적으로는, 비오틴 결합성 단백질을 발현 벡터에 편입시키고, 재조합 단백질을 세포에 발현시켜, 이 세포의 파쇄추출액을 이용해도 된다.
피검시료가 혈청 등인 경우, 통상 혈청을 세포파쇄 추출액으로 10배에서 10000배, 바람직하게는 100배에서 1000배, 보다 바람직하게는 100배에서 500배에 희석해서 이용한다.
세포파쇄 추출액이 유래하는 세포는, 대장균 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물세포 등, 특별한 제한은 없지만, 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포인 것이 바람직하다. 예를 들면, 융합 세포를 대장균으로 조제했을 경우, 세포파쇄 추출액도 대장균으로 조제하는 것이 바람직하다. 또한, 무세포계에 의해 융합 단백질을 발현시켰을 경우는, 사용한 세포파쇄 추출액을 그대로, 혹은 소망하는 완충액에 현탁하여, 사용할 수 있다.
보다 바람직하게는, 세포는, 생물학적 시료가 유래하는 생물과는 다른 종의 생물 유래의 세포인 것이 바람직하다. 예를 들면, 생물학적 시료가 사람 유래의 시료인 경우, 바람직하게는, 세포파쇄 추출액도 사람 이외의 생물에게 유래하는 세포로 조제하는 것이 바람직하다. 그러나, 예를 들면, 융합 단백질을 포유동물 세포로 발현시키는 경우, 특정의 암 세포 등으로 조제한 배양 세포주를 사용하는 경우가 일반적이다. 이러한 경우, 사람 배양 세포주와 생물학적 시료가 유래하는 (예를 들면) 생체 중의 사람 세포는 내용물이 실질적으로 크게 다르기 때문에, 사람 유래의 배양 세포주로부터 세포파쇄 추출액을 이용했을 경우라도, 본 발명의 효과를 얻는 것이 가능하다.
또한, 세포파쇄 추출액을 조제하기 위한 세포는, 임의의 벡터, 바람직하게는 공벡터를 포함해도 된다. 공벡터란, 피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질 또는 그 융합 단백질을 발현시켰을 때에 이용한 벡터와 동종이며, 또한 이들 단백질을 코드하는 유전자를 포함하지 않는 벡터여도 되며, 또한, 예를 들면, 이들 공벡터에 한층 더 임의의 핵산을 포함한, 임의의 벡터여도 된다. 또한, 피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질 또는 그 융합 단백질을 발현시켰을 때에 이용한 벡터와는, 무관계의 공지의 임의의 벡터여도 된다.
세포의 파쇄추출액으로서는, 세포에 유래하는 성분이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 그 단백질 성분, 당질 성분, 지방질 성분 또는 그 혼합 성분을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 세포의 가용성 추출물을 사용할 수 있다.
세포의 파쇄추출액의 조제 방법으로서는, 특별히 제한되지 않으며, 각종의 방법을 사용할 수 있다. 통상, 적절한 배지에서 배양한 세포를, 초음파 등의 물리적 수단 혹은 계면활성제 등을 이용한 화학적 수단 혹은 효소 처리 등으로 파쇄 혹은 가용화하여, 원심분리 또는 여과 등의 조작에 의해, 가용성 성분으로서 조제할 수 있다. 또한, 보존 수명을 늘이기 위해서는, 원심분리 또는 여과 등에 의해 청징(淸澄)으로 한 액에, 예를 들면 프로테아제 인히비터의 첨가, 또는 오토크레이브 처리 등의 가열 처리를 가하여, 세포 유래의 각종 효소 등을 억제 또는 실활시키는 것이 바람직하다. 세포의 파쇄추출액을 더하는 농도는, 생기는 비특이 반응의 힘에 따라 바꾸어도 되며, 그 비특이 반응을 흡수하는데 충분한 농도를 적당히 설정할 수 있다.
세포파쇄 추출액을 조제하는 구체적인 방법의 예로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 대장균 세포의 경우, 대장균(벡터를 포함해도 되며, 또한 벡터에는 비오틴 결합성 단백질을 코드하는 유전자를 포함해도 된다)을, 항생 물질을 포함하는 LB배지에 접종하여, OD600에 있어서의 흡광도가 0.25 내지 1, 바람직하게는 0.4 내지 0.6에 달할 때까지, 25℃ 내지 37℃에서 진탕 배양한 후, 0.1mM 내지 5mM, 바람직하게는 0.5mM 내지 1mM의 IPTG를 첨가하고, 또한 25℃ 내지 37℃에서, 2시간 내지 24시간, 바람직하게는 4시간 내지 16시간 진탕 배양을 실시한다. 배양액으로부터 원심으로 균체를 회수하고, 균체를 소망하는 완충액 중에 현탁 후, 파쇄하여, 파쇄액을 원심하고, 그 상청을 대장균 조추출액으로서 회수하면 된다.
담체에의 생물학적 시료, 및, 세포파쇄 추출액의 첨가는 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 다만, 생물학적 시료가 담체와 접촉하는 것보다도 전에, 생물학적 시료가 세포파쇄 추출액과 접촉해야 한다. 즉, 생물학적 시료와 세포파쇄 추출액 이 충분히 접촉하면 되고, 세포파쇄 추출액 유래의 성분은 반드시 최종적으로 생물학적 시료와 함께 담체에 첨가될 필요는 없다. 예를 들면, 세포파쇄 추출액 성분을 결합한 담체를 작성하고, 거기에 생물학적 시료를 처리한 것을 사용해도 된다.구체적으로는, 생물학적 시료를, 세포파쇄 추출액 성분 컬럼에 통과시키는, 등의 양태을 들 수 있다.
생물학적 시료에, 세포파쇄 조추출액을 혼합하는 경우, 한정되는 것은 아니지만, 시료에, 소망하는 완충액(BSA나 카제인, 시판의 블로킹제 등을 포함해도 된다)으로 0.05mg/ml 내지 5mg/ml, 바람직하게는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml의 총단백질 농도로 조제한 세포파쇄 조추출액을, 10℃ 내지 30℃에서, 바람직하게는 20℃ 내지 30℃에서, 30분 내지 4시간, 바람직하게는 1시간 내지 2시간 반응시킨다. 또한, 생물학적 시료가 혈청인 경우, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 상기 세포파쇄 조추출액으로 100배 내지 1000배로 희석하면 된다.
피검시료에의 비오틴 결합성 단백질의 첨가
본 발명은 그 특징의 하나로서 생물학적 시료에 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액, 및 비오틴 결합성 단백질을 혼합하여 담체에 첨가(공정 b-i)하거나, 혹은, 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액을 피검시료에 혼합하여 담체에 첨가한다(공정 b-ii).
본 발명의 방법에 있어서, 피검시료에 비오틴 결합성 단백질을 첨가함으로써, 최종적으로 백그라운드 시그널을 억제할 수 있다.
이러한 비오틴 결합성 단백질은, 융합 단백질을 구성하는 비오틴 결합성 단백질과, 같아도 달라도 된다. 또한, 야생형이어도 변이체여도 되며, 비오틴 결합능은 야생형과 비교하여, 동등해도, 높아도 되며, 낮아도 된다.
또한, 첨가의 양태로서 비오틴 결합성 단백질(천연 유래여도, 유전자 공학적으로 발현시킨 것이어도 된다)의 분말을 직접 첨가해도 되며, 적당한 액으로 용해하고 나서 첨가해도 된다. 또한 예를 들면, 비오틴 결합성 단백질을 시료에 직접 첨가하는 것이 아니라, 시료와 세포파쇄 추출액의 혼합물을 비오틴 결합성 단백질을 고정한 담체로 처리하는(예를 들면 컬럼에 통과시킨다) 양태여도 된다.(공정 b-i).
비오틴 결합성 단백질을 세포파쇄 조추출액에 첨가하는 경우, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 비오틴 결합성 단백질의 농도는 최종 농도로, 1㎍/ml 내지 500㎍/ml , 바람직하게는 10㎍/ml 내지 100㎍/ml로 첨가한다. 해당 세포 중에서 비오틴 결합성 단백질을 유전자 공학적으로 발현시키는 경우의, 비오틴 결합성 단백질의 농도에 관해서도, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 같은 농도여도 된다.
혹은, 비오틴 결합성 단백질을 코드하는 유전자를 숙주 세포에 도입하여 발현시키고, 해당 숙주 세포를 파쇄하여 얻어진 비오틴 결합성 단백질을 포함하는 세포 추출액으로서 사용해도 된다(공정 b-ii). 이 경우, 비오틴 결합성 단백질은 소망하는 숙주로, 당업자에게 주지의 방법으로 발현되면 되지만, 피검물질과 특이적으로 결합하는 단백질 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 유전자 공학적으로 발현시켰을 경우는, 그 숙주와 동종의 것이 바람직하다.
숙주가 대장균인 경우, 비오틴 결합성 단백질을 코드하는 유전자를 발현 벡터에 편입하고, 이것을 대장균에 도입하여, 단백질 발현을 유도하면서, 대장균의 배양을 실시한다. 발현 벡터나 숙주 대장균주, 배지 성분, IPTG 농도나 배양 온도등의 유도 조건은, 적당히 선택하면 된다.
피검물질의 검출 방법(양태 1의 공정 4)
본 발명의 검출 방법은, 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출한다.
피검물질을 검출하는 방법은, 소망하는 단백질의 성질에 근거하여, 당업자를 적절히 선택할 수 있다. 바람직한 것으로서, 효소 결합 면역 흡착 어세이법(ELISA, 샌드위치 ELISA법을 포함한다)이나 방사성 이뮤노어세이법(RIA)등의 이뮤노어세이법, 핵산 하이브리다이제이션 어세이법, 표면 프라즈몬 공명법 등과 같은 어세이법을 들 수 있다. 아비딘-비오틴 결합을 이용하여 고상화된, 피검물질과 특이적으로 결합·상호작용하는 물질에 대하여, 피검시료를 반응시킨 후, 해당 피검물질을 검출한다.
이뮤노어세이에 있어서, 예를 들면 측정해야 할 물질이 항체인 경우, 항원을 고상화하고, 피검시료 중에 존재하는 항체를 항원과 반응시켜, 당업자에게 주지의 방법으로 검출된다. 예를 들면 피검시료가 사람 유래인 경우, 항원에 결합한 사람 항체를, 항사람 항체를 이용하여 검출한다. 이 때, 이 항사람 항체는, 형광이나 효소, 혹은 방사성 동위 원소로 표지해 둠으로써, 최종적으로 형광량이나 효소 활성, 혹은 방사성량을 측정함으로써, 간접적으로 항체의 양을 측정, 정량한다. 또한 측정해야 할 물질이 항원인 경우, 그 항원이 있는 부분(에피토프)에 대한 항체를 고상화하여, 피검시료 중에 존재하는 항원과 반응시킨 후, 또한 그 항원의 다른 에피토프에 대한 항체를 반응시킨다. 이 다른 에피토프에 대한 2차 항체를 상기와 같이 표지해 두면, 간접적으로 항원의 양을 측정할 수 있다. 혹은 또한, 핵산 하이브리다이제이션어세이에서는, 측정해야 할 핵산과 상보적인 서열 영역을 가지는 수십에서 수백, 혹은 수천 염기의 핵산을 아비딘-비오틴 결합을 이용하여 고상화해 둔다. 여기에 미리 형광이나 방사성 동위 원소로 표지한 핵산을 포함하는 피검시료를 반응시켜, 형광량이나 방사성량을 측정한다.
상기 표지는 당업자에게 주지인 방법으로 실시하면 되며, 또한 시판의, 형광이나 효소 표식된 항사람 항체 등을 이용해도 된다. 형광 표지로서는 예를 들면 플루오레세인 및 로다민 등에 의한 표지나, GFP 등의 형광 단백질에 의한 표지도 생각할 수 있다. 효소 표지로서는 페르옥시다아제나 알카리포스파타제, 혹은 루시페라아제나 글루코스옥시다아제 등이 이용될 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 이러한 효소에 의한 측정을 위한 기질은 시판되고 있으며, 예를 들면 페르옥시다아제의 경우, TBA나 케밀루미네센스 용의 기질을 이용할 수 있다. 또한, 방사성 동위 원소로서 예를 들면, 옥소(125I, 121I), 탄소(14C), 유황(35S), 및 트리튬(3H), 핵산의 경우는 인(32P)등을 들 수 있다.
생물학적 시료(샘플) 중에 존재하는 항원이나 항체의 양은, 예를 들면, 직선 회귀 컴퓨터 알고리즘을 사용하여, 표준적인 조제물(예를 들면 임상 검체의 경우, 건상자의 표준 시료 혹은 전형적인 환자의 표준 시료) 중에 존재하는 양과의 비교에 의해서 간단하고 쉽게 산출될 수 있다. 항원이나 항체를 검출하기 위한 이러한 어세이법은, 예를 들면, ELISA에 관하여, Iacobelli 등, Breast Cancer Research and Treatment 11: 19-30(1988)에 기재되어 있다.
혹은, 예를 들면, 생물학적 시료 중의 검출해야 할 물질, 예를 들면, 항체가 적은 경우(항체값이 낮은 경우)나, 혈청 등의 생물학적 시료 그 자체에 비특이적인 결합이 많은 경우에는, 비특이 결합에 의한 백그라운드 시그널의 영향이 커진다. 그 때문에, 측정치에서 백그라운드 시그널을 적절히 공제함으로써, 검출하고 싶은 물질을 보다 정확하게 측정하는 것이 가능하게 된다. 공제하는 백그라운드는 실험계에 따라 당업자가 적절히 판단할 수 있다.
예를 들면, 이러한 양태의 예로서 혈청 중에 존재하는 콜라겐에 대한 항체를 검출하는 「사람/원숭이항 I형 및 II형 콜라겐 IgG 항체 측정 키트」(Chondrex사제)가 있다. 이 키트에서는 샘플 측정치로부터 백그라운드의 값(혈청은 더하지 않고 2차 항체에만 의한 측정치)을 공제하여 산출한다.
또한, 혈청과 같이, 생물학적 시료 그 자체에 비특이적인 결합이 많은 경우에는, 그러한 비특이 반응에 의한 백그라운드를 공제하기 위해서, 실시예 2에 기재한 바와 같이, SITH-1 항원(검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질)과 타마비딘의 융합 단백질을 고정화한 담체(플레이트)에 있어서의 측정치에서, SITH-1 항원을 고정화되어 있지 않은 구(區)(다만 SITH-1 항원을 고정화한 구와 마찬가지로, BSA 등에 의한 블로킹 조작은 실시되며, 또한 항SITH-1 항체(생물학적 시료 중의 검출하고 싶은 물질)를 포함하는 혈청(생물학적 시료)을 첨가한 구)의 측정치를 공제하는 양태도 유효하다. 혹은, 실시예 2 또는 실시예 3에 기재한 바와 같이, SITH-1 항원과 타마비딘의 융합 단백질을 고정화한 담체(플레이트 또는 자성 비즈)에 있어서의 측정치로부터, 타마비딘만을 고정화(결합)한 담체에 있어서의 측정치를 공제하여 산출해도 된다.
샘플에 고유의 비특이 반응을 공제하기 위한 양태의 새로운 예로서는, 상술한 「사람/원숭이항 I형 및 II형 콜라겐 IgG 항체 측정 키트」와 같이, 콜라겐을 고정화한 마이크로타이터 플레이트의 웰을 이용한 혈청 중 콜라겐 항체의 측정치에서, 콜라겐을 고정화되어 있지 않은 웰의 측정치를 공제하는 경우도 있다. 또한, 유사한 양태을 취하는 키트로서, 혈청 또는 혈장 중의 항단순 헤르페스 바이러스 IgM형 항체의 검출에 이용하는 「바이러스 항체 EIA 「생연(生硏)」헤르페스 IgM」(덴카세이켄사제)이 있다.
또한, 바람직하게는, 시료가 유래하는 생물(예를 들면, SITH-1의 경우는 사람)이 항체를 가지지 않는 임의의 단백질(제한되는 것은 아니지만, 상기 생물이 포유류의 경우는, 예를 들면 GFP 등을 들 수 있다)을 고상화한 구의 측정치를 공제함으로써, 보다 정확하게 구할 수 있다. 고상화의 방법으로서는, 특별히 한정은 되지 않지만, 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 제작하여, 비오틴화 담체에, 비오틴-아비딘 결합에 의해 고상화하는 것이 바람직하다.
이상과 같은 산출 방법은, 생물학적 시료의 성질이나 사용하는 항체의 특징등을 근거로 하여 당업자가 적절히 설계, 선택할 수 있다.
본 발명의 검출 방법은, 바람직하게는 혈청 중의 항체값의 낮은 항체를 특이적으로 검출하는 것이 가능하다.
본 발명의 양태 1의 효과는, 예를 들면, 실시예 2에 있어서 도 3-1의 TM2/pTrc99A/BL21 세포파쇄 추출액(검정 세모)의 결과를, PBS(흰색 네모) 또는 pTrc99A/BL21 세포파쇄 추출액(검정 동그라미)의 결과와 비교함으로써 이해된다. 또한, 실시예 3에 있어서 표 3의 TM2/pTrc99A 도입 BL21 조추출액의 S/N비를, PBS 또는 pTrc99A 도입 BL21 세포파쇄 추출액의 S/N비와 비교함으로써도 이해된다.
II. 본 발명의 검출 방법(양태 2)
본 발명의 검출 방법(양태 2)은, 생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법으로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에, 비오틴 결합성 단백질을 접촉시켜 담체의 블로킹을 실시하고;
4) 공정 3)의 블로킹 공정 후, 융합 단백질이 결합한 담체에, 생물학적 시료를 첨가하고, 그리고,
5) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는
것을 포함한다.
본 발명의 양태 2의 방법에 있어서, 공정 1 및 2의, 융합 단백질이 결합한 담체의 조제 방법은, 양태 1과 같다. 또한, 마지막 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는 공정(양태 1의 공정 4, 양태 2의 공정 5)도 마찬가지이다.
양태 2의 방법은, 생물학적 시료를 담체에 첨가하기 전에, 담체의 블로킹 공정(양태 2의 공정 3)을 실시하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 융합 단백질이 결합한 담체에, 생물학적 시료를 담체에 첨가하기 전에, 또한 비오틴 결합성 단백질을 담체에 접촉시킴으로써, 한층 백그라운드 시그널을 억제할 수 있다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 이것은, 담체 표면에 있어서, 융합 단백질이 결합하고 있지 않으며 유리(遊離)의 상태(free)로 되어 있는 비오틴 부분에, 비오틴 결합성 단백질이 결합하기 때문이라고 생각할 수 있다(도 1).
결합 담체에 접촉시키는 비오틴 결합성 단백질은, 융합 단백질을 구성하는 비오틴 결합성 단백질과, 같아도 달라도 된다. 또한 야생형이어도 변이체여도 상관없다. 비오틴 결합능은, 야생형과 비교하여, 동등해도, 높아도 되며, 낮아도 되지만, 바람직하게는 동등 또는 그 이하이다. 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 야생형 단백질보다 비오틴 결합능이 낮고, 또한, 비오틴과의 해리 정수(KD)가 10-5(M)보다 작은 단백질이어도 된다. 이러한 비오틴 결합 단백질을 제작하기 위해서는, 화학적으로 수식하는 방법(US-A-5051356)등이 있지만, 아미노산 서열을 개변하는 방법이 가장 바람직하다(Qureshi et al. (2002) J. Biol. Chem., 276, 46422-46428).
본 발명에 있어서, 비오틴 결합성 단백질을 결합 담체에 접촉시키는 경우, 이 방법에 특단의 제한은 없다. 즉, 비오틴 결합성 단백질을 직접 첨가해도 되며, 적당한 액에 용해하여 담체와 접촉시켜도 된다. 또한 BSA나 카제인 등, 당업자에게 주지의 블로킹제를 동시에 사용해도 된다.
한정되는 것은 아니지만, 소망하는 완충액(예를 들면 0.02% 내지 1%, 바람직하게는 0.1 내지 0.5%의 농도의 Tween-20이나 Triton를 포함하는 TBS나 PBS)에, 최종 농도로 1㎍/ml 내지 500㎍/ml , 바람직하게는 10㎍/ml 내지 100㎍/ml의 비오틴 결합성 단백질을 첨가한다. 또한 여기에 최종 농도로 1㎍/ml 내지 50㎍/ml , 바람직하게는 5㎍/ml 내지 10㎍/ml의 BSA나 카제인을 첨가해도 된다. 이 블로킹 용액을, 10℃ 내지 40℃에서, 바람직하게는 20℃ 내지 30℃에서, 10분 내지 2시간, 바람직하게는 30분 내지 1시간, 비오틴 결합성 단백질 융합 단백질을, 아비딘-비오틴 결합에 의해 결합시킨 담체와 접촉시킨다.
본 발명의 양태 2의 효과는, 예를 들면, 실시예 2에 있어서, 항체가 0일 때의 도 3-1과 도 3-2의 pTrc99A/BL21 세포파쇄 추출액(검정 동그라미)의 값을 비교함으로써, 이해된다. 항체가 0인 경우에는 항체가 존재하지 않기 때문에, 만일 비특이적 결합이 없으면, 형광은 0이 될 것이다. 여기에 있어서, 도 3-1과 도 3-2의 항체 0에 있어서의 검정 동그라미끼리를 비교하면, TM2에 의한 담체의 블로킹이 실시된 경우에는, 형광치가 절반 가까이까지 내려가며, 비특이적 결합이 큰폭으로 저하되고 있는 것이 이해된다. 또한, TM2에 의한 담체의 블로킹을 실시한 도 3-2에서는, 도 3-1과 비교하여, 그래프 전체가 하방으로 시프트하고 있다. 또한, 실시예 2의 표 2의 pTrc99A/BL21 세포파쇄 추출액의 결과에 관하여, 「BSA에 의한 블로킹」의 값과 「BSA와 TM2에 의한 블로킹」의 값을 비교함으로써도 이해된다.
III. 본 발명의 검출 방법(양태 3)
본 발명의 검출 방법(양태 3)은, 생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법으로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 통해, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에, 비오틴 결합성 단백질을 접촉시켜 담체의 블로킹을 실시하고;
4) 공정 3)의 블로킹 공정 후, 융합 단백질이 결합한 담체에,
(a) 생물학적 시료, 및
(b-i) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과 비오틴 결합성 단백질, 혹은
(b-ii) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액
을 혼합하여 첨가한다; 그리고,
5) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는
것을 포함한다.
양태 3은, 양태 1과 양태 2를 조합한 양태이다. 구체적으로는, 양태 1의 세포파쇄 추출액 및 비오틴 결합성 단백질의 첨가,와 양태 2의 비오틴 결합성 단백질에 의한 담체의 블로킹의 쌍방을 실시하는 것이다.
본 발명의 양태 3의 효과는, 예를 들면, 실시예 2에 있어서 도 3-2의 TM2/pTrc99A/BL21 세포파쇄 추출액(검정 세모)의 결과를, 도 3-1, 도 3-2 중의 다른 결과, 예를 들면, PBS(흰색 네모)의 결과와 비교함으로써 이해된다. 또한, 실시예 4에 있어서, 표 5의 TM2/pTrc99A 도입 BL21 조추출액의 S/N비를, 다른 결과, 즉, PBS, 대장균(BL21) 또는 pTrc99A 도입 BL21 세포파쇄 추출액의 S/N비와 비교함으로써 이해된다.
IV. 융합 단백질이 결합한 담체
본 발명은 또한, 생물학적 시료 중의 물질을 검출하기 위한 담체를 제공한다. 본 발명의 담체는,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 통해, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에, 비오틴 결합성 단백질을 접촉시켜 담체의 블로킹을 실시하는
것을 포함하는 방법에 의해 조제된, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질이, 비오틴-비오틴 결합성 단백질간 결합에 의해서 결합하고 있는, 것을 특징으로 한다. 본 발명의 담체는, 생물학적 시료를 첨가하기 전에 미리 비오틴 결합성 단백질에 의해 블로킹되고 있다.
따라서, 본 발명의 담체는, 바람직하게는, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질이 아비딘-비오틴 결합에 의해 결합하고 있으며, 또한 담체상의 미반응의 비오틴에, 비오틴 결합성 단백질이 아비딘-비오틴 결합에 의해 결합하고 있다.
VII. 키트
본 발명은 또한, 생물학적 시료 중의 물질을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는,
A) 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질이, 비오틴-비오틴 결합성 단백질간 결합에 의해서 결합하고 있는, 담체; 및,
B-i) A)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과 비오틴 결합성 단백질, 혹은
B-ii) A)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액을 포함하는, 생물학적 시료를 희석하기 위한 제; 및/또는
C) 비오틴 결합성 단백질을 포함하는 블로킹제
를 포함한다.
생물학적 시료를 희석하기 위한 제는, 세포파쇄 추출액(및 비오틴 결합성 단백질) 그 자체여도 되며, 혹은, 세포파쇄 추출액을 생물학적 시료와 함께 한층 더 희석하는 제로서, 적당한 완충액이나 시판의 세포 희석액 혹은 혈청 희석액 등의 용제를 포함해도 된다.
실시예
이하, 실시예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 기술적 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 근거하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 가할 수 있으며, 그것들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
본 실시예 1, 2에서는, 사람 헤르페스 바이러스 6(HHV-6) 유래의 SITH-1 단백질과 타마비딘 2와의 융합 단백질을 대장균으로 발현시키고, 초음파 파쇄에 의해 얻어진 대장균 조추출액을 직접 비오틴화 마이크로 플레이트에 반응시켜, 융합 단백질을 타마비딘-비오틴 결합에 의해 고정화시켰다. 이렇게 해서 얻어진 SITH-1 플레이트에, 대장균 조추출액으로 희석한 사람 혈청(토끼 항 SITH-1 항체를 포함한다. 본 시험에서는 시판의 사람 혈청에 토끼의 항 SITH-1 항체(항혈청)를 단계 희석해 더한 혈청을, 의사 임상 검체로서 이용했다.)을 반응시켜, 사람 혈청 중에 포함되는 항SITH-1 항체량을 측정했다.
실시예 1 SITH-1 유전자와 타마비딘 2의 융합 단백질 발현용 벡터의 구축
본 실시예에서는, SITH-1의 C말측에 링커를 개재하여, 타마비딘 2(이하, TM2)가 배치된 융합 단백질을 코드하는 유전자를 설계했다.
1-1. 프라이머의 설계
SITH1-TM2 융합 유전자 구축을 위해서, 우선, SITH-1과 TM2의 양 유전자를 링커(5xlinker:GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(서열 번호 18)를 개재하여 융합시키기 위한 프라이머를 설계했다.
즉, 5'측에 SITH-1의 C말단 부위, 중앙에 링커, 3'측에 TM2의 N말단 부위를 코드하는 DNA 서열로 이루어지는 프라이머(SITH1C-5xlink-TM2N-F)(서열 번호 19), 5'측에 TM2의 N말단 부위, 링커, 3'측에 SITH-1의 C말단 부위를 역방향으로 코드하는 DNA 서열로 이루어지는 프라이머(SITH1C-5xlink-TM2N-R)(서열 번호 20)를 설계했다.
다음으로, SITH-1의 N말단 부위를 포함하는 5'부분과, 그 상류에 EcoR I 제한 효소 절단 부위(CCATGG)가 배치된 프라이머(SITH1 5' EcoRI-F(서열 번호 21)), 또한, TM2 유전자의 3'부분과 그 하류에 BamH I 제한 효소 절단 부위(GGATCC)를 코드하는 서열로 이루어지는 프라이머(TM2CtermBam)(서열 번호 22)를 설계했다. SITH-1과 TM2와의 융합 유전자 구축용 프라이머를 표 1에 정리했다.
[표 1]
1-2. PCR
SITH1-TM2 융합 유전자를 구축하기 위하여, 2단계의 PCR을 실시하였다.
1단계째의 PCR은, SITH-1 유전자(ORF)(서열번호 2)가 FLAG Expression Vector(SIGMA)에 편입되어 있는 플라스미드를 주형으로 하여, 프라이머 SITH1 5' EcoRI-F와 SITH1C-5xlink-TM2N-R을 이용하여 SITH-1 부위의 증폭을, 또한, TM2 유전자가 벡터 pTrc99A에 편입된 플라스미드(WOO2/072817)를 주형으로 하고, 프라이머 SITH1C-5xlink-TM2N-F와 TM2CtermBam를 이용하여 TM2 부위의 증폭을 각각 실시하였다.
PCR 반응 조건은, 20μl의 반응액 중에 주형 DNA를 500ng, 10(ExTaq buffer(TaKaRa사)를 2μl, 2.5mM dNTP를 1.6μl, 프라이머를 각 20pmoles, 5U/μl ExTaq를 0.1(l 첨가하고, GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)를 이용하여 96℃, 3분을 1회, 95℃, 1분 , 60℃, 1분 , 72℃, 2분을 20회, 72℃, 6분을 1회 실시하였다. 그 결과, SITH-1 부분에 있어서는, 579bp, TM2 부분에 있어서는 528bp의 PCR 산물이 얻어졌다. 이들 PCR 산물을 TAE 완충액 중에서, 아가로스겔 전기영동을 이용하여 분획했다. 각 PCR 산물을 겔마다 잘라내고, QIAEX II 겔 추출 키트(QIAGEN)를 이용하여 그들 산물을 회수하였다. 추출 방법은 키트 첨부의 설명서에 따랐다.
상기 2개의 PCR 산물을 주형으로 하고, 프라이머 SITH1 5' EcoRI-F와 TM2CtermBam을 이용하여 2단계째의 PCR을 실시하였다. 반응 조건은, 20μl의 반응액 중에 주형 DNA를 각 500ng, 10(Pyrobest buffer(TaKaRa사)을 2μl, 2.5mM dNTP를 1.6μl, 프라이머를 각 20pmoles, 5U/μl(I Pyrobest DNA polymerase를 0.1μl 첨가하고, GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)을 이용하여 96℃, 3분을 1회, 95℃, 1분 , 60℃, 1분 , 72℃, 2분을 20회, 72℃, 6분을 1회 실시하였다. 그 결과, 990bp의 PCR 산물이 얻어졌다.
1-3.클로닝
PCR에 의해서 얻어진 SITH1-TM2 융합 유전자를 벡터 pCR4Blunt TOPO(Invitrogen사제)로 클로닝 했다.
구체적으로는 먼저, 벡터 키트 첨부의 설명서에 따라서, 라이게이션 반응을 실시하였다. 대장균 TB1에 일렉트로포레이션법을 이용하여 DNA를 도입하고, 상법(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition)에 따라서 플라스미드 DNA를 추출했다. 인서트의 존재가 확인된 플라스미드에 관해서 M13 프라이머(TaKaRa사)와 ABI PRISM 형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer사)를 이용하여 염기 서열을 결정하고, 설계한 유전자의 서열과 비교하여, 변이가 없는 것을 확인했다. 융합 유전자가 편입된 플라스미드를 EcoRI와 BamHI로 이중 소화하고, 상술한 것과 같은 방법으로 아가로스겔 전기영동과 정제를 실시하여, DNA 단편을 회수했다. 이 단편을 미리 EcoRI와 BamHI로 소화해 둔 대장균용의 발현 벡터 pTrc99A(Pharmacia사제)에, Ligation Kit(TaKaRa사제)를 이용하여 라이게이션시켰다. 라이게이션 산물을 대장균 TB1로 형질 전환하고, 플라스미드 DNA를 추출하여, 또한 대장균 BL21로 형질 전환했다. 얻어진 대장균 콜로니를 주형에, SITH15' EcoRI-F와 TM2CtermBam를 이용하여 PCR에 의한 삽입 유전자 부위의 증폭을 실시하고, 삽입 유전자의 유무를 확인했다.
이상과 같이, SITH-1과 TM2의 융합 단백질 발현용의 벡터 SITH1-TM2/pTrc99A를 완성시켰다. 발현용의 벡터 SITH1-TM2/pTrc99A 중의 SITH1-TM2를 코드하는 염기 서열을 서열 번호 23에, 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 24에 나타냈다.
SITH1-TM2는, 5'측에 관해서는, EcoRI 부위를 이용하여 pTrc99A에 편입되었기 때문에, 번역 개시 메티오닌의 뒤애 2개의 아미노산잔기가 부가되어 있다(서열 번호 23의 염기 번호 4-9, 서열 번호 24의 아미노산잔기번호 2-3). 다음으로, SITH-1의 서열(서열 번호 23의 염기 번호 10-483, 서열 번호 24의 아미노산잔기 번호 4-161), 5xlinker(서열 번호 23의 염기 번호 484-558, 서열 번호 24의 아미노산잔기번호 162-186), TM2의 서열(Met를 제거한 것)(서열 번호 23의 염기 번호 559-981, 서열 번호 24의 아미노산잔기번호 187-326)가 이어진다.
1-4. 대장균 발현
SITH1-TM2/pTrc99A를 도입한 대장균 BL21을, 항생 물질 암피실린(최종 농도 100㎍/ml)을 포함하는 LB 배지 50ml에 접종하고, OD600에 있어서의 흡광도가 0.5에 이를 때까지 30℃에서 진탕 배양했다. 그 후, 1mM IPTG를 첨가하고, 또한 30℃에서 5시간 진탕 배양했다. 배양액 50ml로부터 원심으로 균체를 회수했다. 균체는 0.1M HEPES/KOH(pH7.4) 3ml 중에 현탁 후, 초음파에 의해 파쇄하였다. 파쇄액을 원심(15,000rpm)하고, 그 상청을 대장균 조추출액으로 하였다. TM2 융합 SITH-1 단백질의 발현을 확인하기 위해, 조추출액 중에 포함되는 단백질을 SDS-PAGE로 분획하고, 웨스턴 블로팅에 의해 해석하였다.
SITH-1의 검출에는 토끼항 SITH-1 항체(대장균으로 발현시킨 SITH-1을 정제하고, 토끼에 면역 해 작성한 항SITH-1 항체(항혈청))와 알카리포스파타제 표지항토끼 IgG 항체(BIORAD사제)를 각각 1000배 희석해서 이용하였다. 결과를 도 2에 나타냈다. TM2 융합 SITH-1 발현 대장균으로부터는 35kDa 부근에 밴드가 검출되었다. 이 사이즈는 TM2 융합 SITH-1의 분자량 34.8kDa와 거의 일치했다. 또한, pTrc99A나 TM2/pTrc99A를 도입한 대장균 BL21(Takakura et al. (2009) FEBS J. 276: 1383-1397)에 관해서도 상기와 마찬가지로, IPTG 존재하에서 배양 후, 대장균 조추출액을 조제하였다.
실시예 2 ELISA에 의한 사람 혈정 존재하에서의 항SITH-1 항체의 검출
실시예 1에서 얻어진 TM2 융합 SITH-1을 발현한 대장균 조추출액을 2mg 총가용성 단백질/ml가 되도록 0.1M HEPES/KOH(pH7.4)로 희석하고, 비오틴 플레이트(스미토모 베이크라이트사제)에 100μl씩 첨가했다. 실온에서 1시간 정치하고, 타마비딘-비오틴 결합에 의해 TM2 융합 SITH-1 단백질을 비오틴 플레이트에 고정화하였다. 그 후, 플레이트의 각 웰을 0.1% Tween20를 포함하는 TBS 완충액(TBST)으로 3회 세정하고, 5㎍/ml BSA/TBST 용액 혹은 50㎍/ml 정제 TM2/5㎍/ml BSA/TBST 용액을 각 웰에 250μl 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하여, 블로킹을 실시했다. 그 후, 각 웰은 TBST로 3회 세정하였다.
다음으로, 사람 혈청(Human Serum pool, Cosmo-Bio사제)을 PBS, 혹은, 실시예 1-4에서 조제한 5mg 총가용성 단백질/ml의 pTrc99A 도입 대장균 조추출액, 또는, 5mg 총가용성 단백질/ml의 TM2/pTrc99A 도입 대장균 조추출액으로 100배 희석한 용액에, 토끼항 SITH-1 항체(항혈청)를 체적비로 0.002, 0.001, 0.0005, 0.00025가 되도록 단계 희석하여 더하고, TM2 융합 SITH-1을 고정화한 플레이트에 100μl씩 첨가하여, 1시간 실온에서 반응시켰다.
토끼항 SITH-1 항체(항혈청)의 혈청 중 항체값은, 전형적인 우울증(기분 장해) 환자의 혈청중 항SITH-1 항체값에 비해, 대략 50배 정도 높다고 추정된다. 따라서 시판(건상자(健常者)) 사람 혈청에 체적비로 1/50량의 토끼항 SITH-1 항체(항혈청)를 혼합하면, 전형적인 우울증 환자 혈청의 의사 검체가 된다고 생각된다. 따라서, 상기의 항체 희석율은, 우울증 환자 혈청을 대략 10배에서 80배 희석해서 이용하는 경우와 동일한 정도로 간주할 수 있다.
대조로서, 아무것도 고정화되어 있지 않은 비오틴 플레이트에, 상기 BSA만에 의한 블로킹과 BSA와 TM2에 의한 블로킹의, 2 종류의 블로킹 조작을 각각 실시한 구를 설치하였다. 또한, 타마비딘을 포함하는 용액으로 블로킹 조작을 실시했을 경우에 있어서는, 블로킹 용액 중의 타마비딘의 일부가 플레이트 상의 비오틴에 특이적으로 결합하기 때문에, 타마비딘 고정화 플레이트를 이용하고 있는 것과 같은 상태가 된다고 생각된다. 그 후, 상기와 마찬가지로 PBS 용액이나, pTrc99A 도입 혹은 TM2/pTrc99A 도입 대장균 조추출액(5mg 총가용성 단백질/ml)으로 100배 희석한 사람 혈청에, 단계적으로 희석한 토끼항 SITH-1 항체를 더한 것을 100μl씩 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 사람 혈청 존재하에서, 토끼항 SITH-1 항체를 TM2 융합 SITH-1로 반응시킨 후, TBST로 3회 세정하였다.
그 후, 플레이트에 타마비딘를 개재하여 고정화된 SITH-1에, 반응·결합한 토끼항 SITH-1 항체, 및 각 웰 중에서 비특이적으로 결합하고 있다고 생각되는 혈청 중의 사람 IgG를, 각각 검출하기 위해서, 서양 고추냉이 페르옥시다아제 표지 염소항 토끼 IgG 항체, 및 페르옥시다아제 표지 염소항 사람 IgG 항체를, 각각 TBST로 5000배 희석한 혼합 용액을 100μl씩 첨가하여, 1시간 실온에서 정치하였다. 그 후, TBST로 3회 세정하여, 페르옥시다아제 활성을 검출하였다. 활성은 각 웰에, SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(PIERCE)를 100μl씩 첨가하고, 5분간 실온에서 정치한 후 발광량을 플레이트 리더 Infinite M200(TECAN사제)에 의해서 측정하였다.
또한, 데이터치로서는, 토끼항 SITH-1 항체의 각 농도구 각각에 있어서, 대조구(TM2 융합 SITH-1을 고정하고 있지 않지만, BSA 또는 BSA와 TM2에 의해 블로킹 조작은 실시되며, 또한 각 농도의 항SITH-1 항체를 포함하는 사람 혈청을 처리한 구)의 각 발광량의 측정도 아울러 실시하여, 그 대조구의 값을, TM2 융합 SITH-1을 고정화한 구의 발광량의 값으로부터 공제했다. 이것을 혈청 중에 포함되는 항SITH-1 항체의 검출량으로 하였다.
비특이 결합에 미치는, 혈청에의 대장균 파쇄추출액의 첨가 효과나, TM2에 의한 블로킹 효과의 결과를 도 3에 나타냈다. 도 3에서는, 혈청을, PBS로 100배 희석한 구를 흰색 네모, 발현 벡터만을 가지는 대장균 파쇄추출액으로 100배 희석한 구를 검정 동그라미, TM2를 발현시킨 대장균 파쇄추출액으로 100배 희석한 구를 검정 세모로 나타냈다. 각 그래프의 세로축(루미네센스)은 항SITH-1 항체의 검출량을 나타내며, 횡축은 단계 희석한 항SITH-1 항체의 희석 비율을 나타낸다.
도 3-1은, 비오틴 결합성 단백질(TM2)에 의한 블로킹을 실시하지 않는 경우에 있어서, 사람 혈청을 PBS(흰색 네모), pTrc99A 도입 대장균 조추출액(검정 동그라미), 또는 TM2/pTrc99A 도입 대장균 조추출액(검정 세모)으로 희석했을 경우의, 혈청중 항SITH-1 항체량의 검출의 결과를 나타낸다.
도 3-2는, 비오틴 결합성 단백질(TM2)에 의한 블로킹을 실시한 경우에 있어서, 사람 혈청을 PBS(흰색 네모), pTrc99A 도입 대장균 조추출액(검정 동그라미), 또는 TM2/pTrc99A 도입 대장균 조추출액(검정 세모)으로 희석했을 경우의, 혈청중 항SITH-1 항체량의 검출의 결과를 나타낸다.
또한, 블로킹의 효과나 각 혈청 희석액의 효과의 비교를 실시하기 위해서, S/N비를 이하에 나타내는 식에 의해서 산출했다.
S/N비 = 항SITH-1 항체를 각 농도로 더한 구의 항SITH-1 항체 검출량 / 항SITH-1 항체를 더하지 않은 구의 항SITH-1 항체 검출량
따라서, S/N비가 클수록 검출 감도가 높은 것을 나타내고 있다.
각 구에 있어서의 S/N비의 계산 결과를 표 2에 나타냈다.
[표 2]
혈청 중에 포함되는 항SITH-1 항체는, 혈청을 PBS로 희석한 구에서는, 비특이적 결합이 많고, 항SITH-1 항체를 첨가하지 않는 구에서도 높은 발광량이 검출되었다. 한편, pTrc99A 도입 대장균 조추출액이나 TM2/pTrc99A 도입 대장균 조추출액을 첨가한 구에 있어서는, SITH-1 항체를 더하지 않는 구에 있어서의 루미네센스치가 상당히 낮고, 비특이 결합이 극적으로 감소하고 있었다. 특히 TM2/pTrc99A 도입 대장균 조추출액을 첨가한 구에 있어서는 비특이 결합이 낮았다(도 3-1, 도 3-2). 이 경우, BSA만의 블로킹보다 TM2를 더 첨가한 블로킹(BSA+TM2)쪽이, 특히 저농도(희석율 0.0005 이하)의 항체의 검출에 정량성이 보였다(도 3-2).
또한 pTrc99A 도입 대장균 조추출액을 첨가한 구, 및 TM2/pTrc99A 도입 대장균 조추출액을 첨가한 구에 있어서는, TM2를 더한 BSA로 블로킹하면 S/N비가 상승하여, 보다 고감도로 항SITH-1 항체를 검출할 수 있는 것이 분명해졌다(표 2). 특히 TM2/pTrc99A 도입 대장균 조추출액을 첨가한 구에 있어서는 S/N비의 상승이 현저했다.
이상으로부터, TM2 융합 SITH-1 고정화 플레이트를, TM2를 포함하는 용액으로 블로킹한 후, TM2가 발현하고 있는 대장균 조추출액으로 사람 혈청을 희석함으로써, 사람 혈청 유래 비특이 결합을 감소시키고, 지극히 낮은 농도의 항SITH-1 항체도 감도 좋게 안정적으로 또한 정량적으로 검출할 수 있다는 것이 나타났다.
실시예 3 자성 비즈를 이용한 ELISA에 의한 사람 혈청 존재하에서의 항SITH-1 항체의 검출
본 실시예에서는, 매우 연한 농도의 SITH-1 항체를 검출하는 경우에 관하여, TM2 융합 SITH-1을 비오틴화 자성 비즈에 고정화한 계에 있어서의 각종 혈청 희석액의 효과를 조사했다.
3-1. TM2 융합 SITH-1 고정화 자성 비즈의 조제
자성 비즈의 Dynabeads M-270 Amine(DynalBiotech사제) 1mL(30mg비즈/mL)에, 10mM NHS-Lc-Lc-Biotin(PIERCE사제) 1mL를 첨가하였다. 실온에서 30분간 전도 혼화 함으로써 아미노기와 NHS 활성 에스테르기를 반응시ㅋ켜, 비오틴과 자성 비즈를 공유결합시켰다. 그 후, 자성 비즈를 0.1% BSA/ 0.01% Tween20/ PBS 용액으로 2회 세정하고, 마지막에 PBS 완충액에 현탁하였다. 얻어진 자성 비즈(30mg비즈/mL PBS)를 비오틴화 자성 비즈로 하였다.
TM2 융합 SITH-1을 상술한 실시예 1-4와 마찬가지로 대장균으로 발현시키고, 조제한 대장균 조추출액을, 총가용성 단백질 농도가 5mg/ml가 되도록 0.1M HEPES/KOH(pH7.4)로 희석하여, 여기에 비오틴화 자성 비즈를 첨가했다. 실온에서 1시간 전도 혼화함으로써, 타마비딘-비오틴 결합에 의해 TM2 융합 SITH-1을 자성 비즈에 고정화했다. 그 후, 자성 비즈를 0.2% Tween20를 포함하는 TBS 완충액(TTBS)으로 3회 세정했다.
또한, TM2가 발현한 대장균(Takakura et al. (2009) FEBS J 276: 1383-1397)의 조추출액을, 총가용성 단백질 농도가 5mg/ml가 되도록 0.1M HEPES/KOH(pH7.4)로 희석하고, 여기에 비오틴화 자성 비즈를 첨가했다. 실온에서 1시간 전도 혼화함으로써, 타마비딘-비오틴 결합에 의해 TM2를 고정화했다. 상기와 마찬가지로 세정 후, 완성한 TM2 고정화 자성 비즈(30mg비즈/mLPBS)는 혈청 샘플 고유의 비특이 결합을 공제하기 위해서 이용되었다.
3-2. 자성 비즈를 이용한 ELISA 분석
시판의 사람 혈청(Human Serum pool, Cosmo-Bio사제)에, 실시예 2의 토끼항SITH-1 항체를 1/50량 더하여, SITH-1 항체를 포함하는 사람 혈청을 조제했다. 한편, SITH-1 항체를 더하지 않는 사람 혈청을 대조로 하였다.
사람 혈청 혹은, 토끼 SITH-1 항체를 포함하는 사람 혈청을, PBS 혹은, 총가용성 단백질 농도가 5mg/ml가 되도록 0.1M HEPES/KOH(pH7.4)로 조정한 pTrc99A 벡터 산물 발현 대장균 조추출액, 혹은 총가용성 단백질 농도가 5mg/ml가 되도록 0.1M HEPES/KOH(pH7.4)로 조정한 TM2 발현 대장균 조추출액으로, 1000배에 희석한 용액에, 또한, 최종 농도가 2%(w/v)가 되도록 BSA를 첨가하였다. 또한, 상기 실시예 2에 있어서는, 사람 혈청을 100배 희석한 후에, 그 희석 후의 혈청에 대한 체적비로 0.00025에서 0.002가 되도록 토끼항 SITH-1 항체를 더했다. 그러나, 본 실시예 3-2에서는, 토끼항 SITH-1 항체를 사람 혈청에 1/50량(체적비로 0.02)를 더하고 나서, 1000배 희석하고 있으므로, 토끼 SITH-1 항체의 희석율은 1/50000이 된다. 따라서, 상기의 항체 희석율은, 우울증 환자 혈청을 대략 1000배 희석해서 이용하는 경우와 동일한 정도가 된다.
이렇게 해서 조제한 희석 혈청 1mL에, TM2 융합 SITH-1 고정화 자성 비즈, 혹은 TM2 고정화 자성 비즈를 각 10μl씩 첨가하고, 1시간 실온에서 전도 혼화하여 반응시켰다. TBST로 3회 세정한 후, 자성 비즈에 고정화한 SITH-1 항원에 결합한 토끼항SITH-1 항체를 검출하기 위해서, 서양 고추냉이 페르옥시다아제 표지 염소항토끼 IgG 항체를, 또한, 각 자성 비즈에 비특이 결합하고 있는 사람 IgG를 검출하기 위해서, 페르옥시다아제 표지 염소항사람 IgG 항체를, 각각 2% BSA를 포함하는 TBST로 5000배 희석하고 나서 혼합하고, 이 페르옥시다아제 표지 2차 항체 혼합 용액을 각 자성 비즈에 1000μl씩 첨가하여, 1시간 실온에서 전도 혼화하였다. 그 후 또한 TBST로 3회 세정하고, 검출 시약 1 step ELISA ultraTMB(PIERCE)를 100μl 첨가하여, 실온으로 1분간 반응시켰다. 2M 황산을 100μl 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 발색 정도(파장 450nm에 있어서의 흡광도, A450)를 플레이트 리더 Infinite M200(TECAN사제)에 의해서 측정했다. 측정은 처리구 마다 2회 실시하여 평균치를 구했다.
데이터치로서는, TM2 융합 SITH-1 고정화 자성 비즈에 있어서, 각 혈청 희석액(PBS, pTrc99A 벡터 산물 발현 대장균 조추출액, TM2 발현 대장균 조추출액)을 이용했을 경우의 A450의 값으로부터, 각 혈청 희석액마다 각각, TM2 고정화 자성 비즈를 이용했을 경우의 A450의 값을 공제한 것을 이용했다. 결과를 표 3에 나타냈다.
[표 3]
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 사람 혈청 중의 SITH-1 항체의 A450의 값(S)은, 혈청 희석액으로서 PBS를 이용했을 경우가, 가장 높은 값을 나타냈지만, 동시에 SITH-1 항체를 포함하지 않는 혈청에 있어서의 A450치(N)도 지극히 높아, 결과, PBS에서는 S/N비(토끼항 SITH-1 항체를 더한 사람 혈청에 있어서의 발색 정도/토끼항 SITH-1 항체를 더하지 않는 혈청에 있어서의 발색 정도)는 가장 낮았다.
한편, TM2 발현 대장균 조추출액을 혈청 희석액으로서 이용했을 경우는, SITH-1 항체를 포함하지 않는 혈청에 있어서의 A450치가 가장 낮아, 비특이 결합을 크게 억제할 수 있었다. 또한, S/N비는 TM2 발현 대장균 조추출액을 혈청 희석액으로서 이용했을 경우가 가장 높아, 값으로서 10을 넘었다. 이러한 점에서, TM2 융합 SITH-1 고정화 자성 비즈를 이용했을 경우, TM2 발현 대장균 조추출액을 사람 혈청에 혼합함으로써, 비특이 결합을 감소시키고, 고감도로 항SITH-1 항체를 검출할 수 있다는 것이 나타났다.
또한, SITH-1 항체의 정량에 의해 우울증(기분 장해)의 진단을 실시하는 경우를 상정하면, 본 명세서 중에 있어서 이용한, 토끼 SITH-1 항체를 더한 사람 혈청, 토끼 SITH-1 항체를 더하지 않는 사람 혈청은, 각각 우울증(기분 장해) 환자 혈청, 건상자 혈청으로 간주할 수도 있다. 여기서 표 3에 있어서, 혈청 희석액으로서 PBS를 이용했을 경우는, 우울증 환자(S)에서 0.64, 건상자(N)에서 0.25라는 값으로 되며, 한편 혈청 희석액으로서 TM2/pTrc99A 도입 BL21 조추출액을 이용했을 경우는, 우울증 환자(S)에서 0.22, 건상자(N)에서 0.02라는 값으로 된다. 많은 임상 검체(혈청) 중에는, 건상자라도 비특이 결합이 높은 혈청이 포함되며, 또한 우울증이어도, SITH-1 항체값이 분명히 높지 않은 혈청도 포함된다고 생각된다. 따라서, 그러한 차이를 검출하기 위한 측정 방법으로서는, 극력 비특이 결합(N)이 적으며, 또한 특이적인 결합(S)도 확실히 검출할 수 있는 측정 방법이 바람직하다. 본 실시예에 있어서의 S/N비는, 이러한 관점에서의, 각 혈청 희석액 등의 효과를 비교하기 위해서도 유효한 지표가 된다.
실시예 4. Harpin과 타마비딘의 융합 단백직을 이용한 ELISA에 있어서의 사람 혈청 존재하에서의 항Haroin 항체의 검출
본 실시예에서는 식물 병원 세균 유래 단백질인 Harpin(hrpZpss 단백, Takakura등, 2004, Physiol. Mol. Plant Pathol. 64, 83(89)와 타마비딘 2(TM2)와의 융합 단백질을 대장균으로 발현시키고, 비오틴화 마이크로 플레이트에 타마비딘-비오틴 결합에 의해 고정화시켰다. 이렇게 해서 얻어진 Harpin 플레이트에, 타마비딘 2에 의한 블로킹을 실시한 다음, 각종 대장균 조추출액으로 희석한 혈청(토끼항Harpin 항체와 사람 혈청을 혼합한 혈청)을 반응시킨 후, 페르옥시다아제 표지 염소항 사람 IgG 항체와 서양 고추냉이 페르옥시다아제 표지 염소항 토끼 IgG 항체에 의해 항Harpin 항체를 검출했다. 이하, 상세하게 설명한다.
4-1. Harpin과 타마비딘 2의 융합 단백질 발현용 벡터의 구축과 대장균 발현
PCR을 이용하여 TM2의 서열을 Harpin의 C말단 측에 접속시킨 융합 단백질을 코드하는 유전자를 구축했다. Harpin-TM2 융합 유전자 구축을 위해서, Harpin, TM2 양유전자를 링커(5xlinker: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(서열 번호 18)를 개재하여 결합시키기 위한 프라이머를 설계했다. 설계한 프라이머를 표 4에 나타냈다.
[표 4]
표 4에 나타낸 바와 같이, 5'측에 Harpin C말단 부위, 중앙에 링커, 3'측에 TM2 N말단 부위로 이루어지는 프라이머(HarpinC-5xlink-TM2N-F, 표 4, 서열 번호 27), 5'측에 TM2 N말단 부위, 중앙에 링커, 3'측에 Harpin C말단 부위를 역방향으로 코드하는 DNA 서열로 이루어지는 프라이머(HarpinC-5xlink-TM2N-R, 표 4, 서열 번호 26)를 설계했다. 또한, Harpin의 N말단 부위의 프라이머 HarpinNtermEcoRI-F(5'말단에 EcoRI 절단 서열을 포함하는, 표 4, 서열 번호 25)를 설계했다.
Harpin-TM2 융합 유전자를 구축하기 위해서, 2단계의 PCR을 실시했다. 일단계째의 PCR은, Harpin 유전자(ORF)(서열 번호 28)(코드 아미노산 서열: 서열 번호 29)가 pCR2.1 Vector(Invitrogen)에 편입되어 있는 플라스미드(Takakura등, 2004, Physiol. Mol. Plant Pathol 64, 83(89)을 주형으로 하고, 프라이머 HarpinNtermEcoRI-F와 HarpinC-5xlink-TM2N-R을 이용하여 Harpin 부위의 증폭을 실시하였다. 또한, 별개로, TM2 유전자가 벡터 pTrc99A에 편입된 플라스미드(WOO2/072817)를 주형으로 하고, 프라이머 HarpinC-5xlink-TM2N-F와 TM2CtermBam을 이용하여 TM2 부위의 증폭을 실시했다.
PCR 반응 조건은, 20μl의 반응액 중에 주형 DNA를 100ng, 10(ExTaq buffer(TaKaRa사)를 2μl, 2.5mM dNTP를 1.6μl, 프라이머를 각 20pmoles, 5U/μl ExTaq를 0.1(l 첨가하고, GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)를 이용하여, 94℃, 60℃, 72℃ 각 30초를 25회 실시하였다. 그 결과, Harpin 부분에 있어서는, 약 1kbp, TM2 부분에 있어서는 약 0.5 kbp의 PCR 산물이 얻어졌다. 이러한 PCR 산물을 TAE 완충액 중에서, 아가로스겔 전기영동을 이용하여 분획했다. 각 PCR 산물을 겔 마다 잘라내어, QIAEX II 겔 추출 키트(QIAGEN)를 이용하여 그들 산물을 회수했다. 추출 방법은 키트 첨부의 설명서에 따랐다.
상기 2개의 PCR 산물을 주형으로 하고, 프라이머 HarpinNtermEcoRI-F와 TM2CtermBam을 이용하여 2단계째의 PCR을 실시했다. 반응 조건은, 20μl의 반응액중에 주형 DNA를 각 100ng, 10(Pyrobest buffer(TaKaRa사)를 2μl, 2.5mM dNTP를 1.6μl, 프라이머를 각 20pmoles, 5U/μl Pyrobest DNA polymerase를 0.1μl 첨가하고, GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)를 이용하여 94℃, 30초, 60℃, 1분, 72℃, 1.5분을 25회 실시하였다. 그 결과, 약 1.5kbp의 PCR 산물이 얻어졌다.
PCR에 의해서 얻어진 harpin-TM2 융합 유전자를 벡터 pCR4Blunt TOPO(Invitrogen사제)에 클로닝했다. 염기 서열을 확인한 후, 융합 유전자가 편입된 플라스미드를 EcoRI와 BamHI로 이중 소화하고, 상술한 바와 같은 방법으로 아가로스겔 전기영동과 정제를 실시하여, DNA 단편을 회수했다. 이 단편을 미리 EcoRI와 BamHI로 소화해 둔 대장균용의 발현 벡터 pTrc99A(Pharmacia사제)에, Ligation Kit(TaKaRa사제)를 이용하여 라이게이션시켰다. 라이게이션 산물을 대장균 BL21(DE3)로 형질 전환하여, 염기 서열을 확인했다.
이상과 같이, harpin과 TM2의 융합 단백질 발현용의 벡터 harpin-TM2/pTrc99A를 완성시켰다. harpin-TM2를 코드하는 염기 서열을 서열 번호 30에, 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 31에 나타냈다.
Harpin-TM2/pTrc99A를 도입한 대장균 BL21(DE3)을, 항생 물질 암피실린(최종 농도 100㎍/ml)을 포함하는 LB 배지 50ml에 접종하고, OD600에 있어서의 흡광도가 0.5에 이를 때까지 30℃에서 진탕 배양했다. 그 후, 1mM IPTG를 첨가하고, 또한 30℃에서 5시간 진탕 배양했다. 배양액 50ml로부터 원심으로 균체를 회수하였다. 균체는 0.1M HEPES/KOH(pH7.4) 3ml 중에 현탁 후, 초음파에 의해 파쇄하였다. 파쇄액을 원심(15,000rpm)하고, 그 상청을 대장균 조추출액으로 하였다. TM2 융합 harpin 단백질의 발현을 확인하기 위해, 조추출액 중에 포함되는 단백질을 SDS-PAGE로 분획하여, 웨스턴 블로팅에 의해 해석했다.
Harpin의 검출에는 토끼항 harpin 항체(Takakura등, 2004, Physiol. Mol. Plant Pathol. 64, 83(89)과 알카리포스파타제 표지 항토끼 IgG 항체(BIORAD사제)를 각각 1000배 희석해서 이용했다.
결과를 도 4에 나타냈다. 인서트를 포함하지 않는 발현 벡터만을 발현시킨 대장균 추출액에서는, 특이적인 밴드가 검출되지 않았지만(도 4 레인 1), 한편 TM2 융합 harpin 발현 대장균에서는, 약 50kDa 부근에 밴드가 검출되었다(도 4 레인 2). 이 사이즈는 TM2 융합 harpin의 분자량 51.4kDa와 거의 일치했다.
4-2. ELISA에 의한 사람 혈청 존재하에서의 항Harpin 항체의 검출
TM2 융합 Harpin 대장균 조추출액을, 총가용성 단백질 농도가 1mg/ml가 되도록 0.1M HEPES/KOH(pH7.4)로 희석하고, 이것을 비오틴 플레이트(스미토모 베이크라이트)에 100μl씩 첨가했다. 실온에서 1시간 정치함으로써 타마비딘-비오틴 결합에 의해 TM2 융합 Harpin를 고정화했다. 그 후, 플레이트의 각 웰을 0.1% Tween20을 포함하는 TBS 완충액(TBST)으로 3회 세정했다. 50㎍/ml 정제 TM2(WOO2/072817)/0.5% BSA/TBST 용액을 각 웰에 250μl 첨가하여, 실온에서 1시간 정치함으로써, TM2와 BSA로 블로킹을 실시했다. 블로킹 후, 각 웰은 TBST로 3회 세정했다.
다음으로 사람 혈청(Human Serum pool, Cosmo-Bio사제)을, PBS 혹은 5mg 총가용성 단백질/ml(0.1M HEPES/KOH, pH7.4)의 대장균 조추출액, 5mg 총가용성 단백질/ml(0.1M HEPES/KOHpH7.4)의 pTrc99A 벡터 산물 발현 대장균 조추출액 혹은 5mg 총가용성 단백질/ml(0.1M HEPES/KOH, pH7.4)의 TM2 발현 대장균 조추출액으로 100배 희석했다. 또한 이 용액에 1% BSA를 첨가 후, 1/500량의 토끼항 Harpin 항체를 더하여 항Harpin 항체 함유 혈청을 조제했다. 또한, Harpin 항체를 더하지 않는 혈청을 대조로 하였다.
이들 혈청을 TM2 융합 Harpin을 고정화한 플레이트에 100μl씩 첨가하고, 1시간 실온에서 정치하여 반응시킨 후, TBST로 3회 세정했다. Harpin 항원에 결합한 토끼항 Harpin 항체를 검출하기 위해서, 서양 고추냉이 페르옥시다아제 표지 염소항토끼 IgG 항체를, 또한, 웰에 비특이 결합하고 있는 사람 IgG를 검출하기 위해서, 페르옥시다아제 표지 염소항사람 IgG 항체를, 각각 1% BSA를 포함하는 TBST로 5000배 희석하고 나서 혼합하고, 이 페르옥시다아제 표지 2차 항체 혼합 용액을 각 웰에 100μl씩 첨가하고, 1시간 실온에서 정치하여, 반응시켰다. 그 후, 또한 TBST로 3회 세정하고, 검출 시약 1step ELISA ultra TMB(PIERCE)를 100μl 첨가하여, 실온으로 5분간 반응시켰다. 2M 황산을 100μl 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 발색 정도(파장 450nm에 있어서의 흡광도, A450)를 플레이트 리더 Infinite M200(TECAN사제)에 의해서 측정했다. 측정은 처리구마다 3회 실시하여 평균치를 구했다. 또한, 본 실시예에 있어서는, 항체의 농도가 비교적 높고, 또한 비특이 결합도 적은 계가 되었기 때문에, 항원을 고상화하지 않은 구의 측정치를 공제할 필요가 없었다.
결과를 표 5에 나타냈다.
[표 5]
표 5에 나타낸 바와 같이, 사람 혈청 중의 harpin 항체의 A450의 값(S)은, 각 혈청 희석액간에서 큰 차이는 없었지만, 대조로 한 harpin 항체를 포함하지 않는 혈청에 있어서의 값(N)은, TM2/pTrc99A 도입 BL21 조추출액, pTrc99A 도입 BL21 조추출액, 대장균(BL21) 조추출액, PBS의 순서로 낮았다. 이것은, TM2/pTrc99A 도입 BL21 조추출액이 가장 비특이 결합을 억제할 수 있었다는 것을 나타낸다. 또한, S/N비(토끼항 Harpin 항체를 더한 사람 혈청에 있어서의 발색 정도/토끼항 Harpin 항체를 더하지 않는 혈청에 있어서의 발색 정도)에 관해서도, 타마비딘 2를 발현시킨 대장균 추출액(TM2/pTrc99A 도입 BL21 조추출액)을 혈청 희석액으로서 이용한 경우가 가장 높았다.
이상의 것으로부터, 타마비딘 2를 발현시킨 대장균 추출액을 이용하여 사람 혈청을 희석함으로써, 비특이적인 결합이 억제되고, 감도가 높은 검출을 할 수 있는 것을 나타냈다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 1: SITH-1의 아미노산 서열.
서열 번호 2: SITH-1 ORF의 염기 서열.
서열 번호 3: SITH-1 cDNA의 염기 서열.
서열 번호 4: 타마비딘 1의 염기 서열.
서열 번호 5: 타마비딘 1의 아미노산 서열.
서열 번호 6: 타마비딘 2의 염기 서열.
서열 번호 7: 타마비딘 2의 아미노산 서열.
서열 번호 8: 링커 서열의 예.
서열 번호 9: 링커 서열의 예.
서열 번호 10: 링커 서열의 예.
서열 번호 11: 링커 서열의 예.
서열 번호 12: 링커 서열의 예.
서열 번호 13: 링커 서열의 예.
서열 번호 14: 링커 서열의 예.
서열 번호 15: 링커 서열의 예.
서열 번호 16: 링커 서열의 예.
서열 번호 17: 링커 서열의 예.
서열 번호 18: 링커 서열의 예(실시예에서 사용).
서열 번호 19: 프라이머 SITH1C-5xlink-TM2N-F의 염기 서열.
서열 번호 20: 프라이머 SITH1C-5xlink-TM2N-R의 염기 서열.
서열 번호 21: 프라이머 SITH1 5' EcoRI-F의 염기 서열.
서열 번호 22: 프라이머 TM2CtermBam의 염기 서열.
서열 번호 23: SITH-1-TM2의 염기 서열.
서열 번호 24: SITH-1-TM2의 아미노산 서열.
서열 번호 25: 프라이머 HarpinNtermEcoRI-F의 염기 서열.
서열 번호 26: 프라이머 HarpinC-5xlink-TM2N-R의 염기 서열.
서열 번호 27: 프라이머 HarpinC-5xlink-TM2N-F의 염기 서열.
서열 번호 28: Harpin 유전자(ORF)의 염기 서열.
서열 번호 29: Harpin 유전자(ORF)에 의해서 코드되는 아미노산 서열.
서열 번호 30: harpin-TM2의 염기 서열.
서열 번호 31: harpin-TM2의 아미노산 서열.
SEQUENCE LISTING
<110> Virus Ikagaku kenkyusho Inc.
Japan Tobacco Inc.
<120> Method for detecting substance in biological sample
<130> FA0392-09154
<160> 31
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 159
<212> PRT
<213> Human herpesvirus 6
<400> 1
Met Gly Tyr Glu Glu Lys Val Ser Ala Thr Gly Lys Thr Arg Leu Lys
1 5 10 15
Ile Leu Ala Cys Leu Ile Val Leu Ile Leu Ala Ala Ala Ile Thr Met
20 25 30
Leu Thr Leu Glu Ile Ile Ser Asn Gln Lys Arg Thr Thr Thr Asp Leu
35 40 45
Glu Ala Val Thr Val Ala Leu Lys His Val Ser Thr Ser Leu Ala Ser
50 55 60
Cys Thr Glu Ser Thr Thr Ser Val His Thr Asp Ser Val Thr Ser Gln
65 70 75 80
Pro Thr Lys Asn Lys Glu Ser Arg Lys Lys Ile Glu Gly Lys Ser Pro
85 90 95
Ser Trp Val Gln Ala Leu Thr Thr Ala Ser Gly Ile Ile Leu Leu Phe
100 105 110
Cys Ile Met Met Ile Phe Ile Thr Cys Ser Trp Thr Thr Glu Lys Asp
115 120 125
Thr Glu Lys Ser Glu Val Gln Ser Tyr Ala Ser Ser Val Glu Thr Leu
130 135 140
Asp Ser Leu Asn Glu Ala Ile Ile Pro Lys Thr Glu Met Asn Val
145 150 155
<210> 2
<211> 480
<212> DNA
<213> Human herpesvirus 6
<400> 2
atgggatatg aagaaaaagt gtcagctact ggaaagactc gtttaaagat actggcatgt 60
ctgatcgttt taatactagc tgcggcaata actatgttaa cgctggaaat tatatcgaac 120
caaaaacgta ccactactga tctcgaagct gtgactgtgg cgctgaagca tgtaagcaca 180
tctcttgcca gctgcactga atccactact tctgtacata ccgattctgt gacgagccaa 240
cccacgaaaa acaaagaatc gaggaaaaaa attgaaggga aatctccaag ttgggttcag 300
gctttaacta cagcatctgg aattatccta ctgttttgta taatgatgat attcattaca 360
tgttcctgga ccacagaaaa agatacagag aagagtgaag tgcaatctta tgcttcttca 420
gtagagactt tagactcttt aaatgaggct attataccga aaactgaaat gaatgtgtaa 480
<210> 3
<211> 1795
<212> DNA
<213> Human herpesvirus 6
<400> 3
aggctctgct ggaggctctg ctggaggcct tgctgaaggc tctgctggag gccctgctgg 60
aggtcttgct ggaggctctg ctggaggctc tgctggaggc tctgctggag gctctgctgg 120
aggctctgct ggaggctctg ctggaggctc tgtcagagac ctcggtgaaa gttttactca 180
gaggtttatc agagttttcg ccattagttt ggttagaagt ttcagattta ttttcggtgg 240
aactgcagtt aggtttcatg tcagtacatt catcaccgtt agaagtgcta ttcatggtgc 300
tgttgccact gttggatttg ttaaaagcag taaatgagct aggattggaa tgactccgaa 360
tagctaataa atttgagcat tttcttcgaa tggatcataa tcagagggat agccatctaa 420
tttaaagact tccattttat cactgttgca atcacttcta atggagtatc tggatacatt 480
ttttctacat ctttttcatc ccctccaaca tggatctgtg cagcgttaat aagccagcgg 540
agttaattaa atcgtcttcc atgttagaca gttcctgttt catggcagcc ttcactgatg 600
caccaatact ttggatgcaa gtgccaacgg actgagctag gatgtaaaag aagatattct 660
aattttgaat tcttcagatg ctccttcttc cacattactg gaataggaca cattcttgga 720
agcgatgtcg ttggaagact ctgggatgaa aagatcacag gcttccagtt ctggaaaaag 780
caggctttca aaggacacat cacacttgag actctcttcc aatatttctt tgatggattc 840
ttccaccact ggatcgggat ggtagctata tatactatat aaggagatta ccaccaccac 900
ctctttcttt gcagagatta ttctctgctt gaaaatctgt aacactgatc atgatgggat 960
atgaagaaaa agtgtcagct actggaaaga ctcgtttaaa gatactggca tgtctgatcg 1020
ttttaatact agctgcggca ataactatgt taacgctgga aattatatcg aaccaaaaac 1080
gtaccactac tgatctcgaa gctgtgactg tggcgctgaa gcatgtaagc acatctcttg 1140
ccagctgcac tgaatccact acttctgtac ataccgattc tgtgacgagc caacccacga 1200
aaaacaaaga atcgaggaaa aaaattgaag ggaaatctcc aagttgggtt caggctttaa 1260
ctacagcatc tggaattatc ctactgtttt gtataatgat gatattcatt acatgtccct 1320
ggaccacaga aaaagataca gagaagagtg aagtgcaatc ttatgctcct tcagtagaga 1380
ctttagaccc tttaaatgag gctattatac cgaaaactga aatgaatgtg taatgtctgt 1440
atttttcttt acagagatgt acggagagtt tatatttggg gaaaatacct gactgttctg 1500
cctatatgcg aatgttaaag tatgtataat ataaattctt accttttaag agtgattcaa 1560
ggtggaggtt tctttggaga ttgattccag gtggtggttt cgggtgcaat caatctttct 1620
tctgggcggg aagaaaatcc agcaatccaa taattgatgg gatgtaatca atgtcacaaa 1680
tctgtaagat taaatgtgaa cagtataaat tctttcgtgc ttatcaaatt acaattatgc 1740
gcatgaaaat atcattaaat tgttttaaac attcttaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1795
<210> 4
<211> 432
<212> DNA
<213> Pleurotus cornucopiae
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(432)
<400> 4
atg aaa gac gtc caa tct ctc ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48
Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu
1 5 10 15
ggc tca aca atg aat ttg act gca aat aaa gac ggt tcg ctc acc gga 96
Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly
20 25 30
acg tac cac tcc aac gtc ggc gag gtt ccc cca act tat cac ctt tct 144
Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser
35 40 45
ggc cgg tac aac ctc cag ccc ccc tcg ggt caa ggc gtt act ctg gga 192
Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly
50 55 60
tgg gcg gtg tct ttc gaa aac act agt gcg aat gtt cat tct gtc tca 240
Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His Ser Val Ser
65 70 75 80
aca tgg agc ggg cag tac ttc tct gaa ccc gcc gag gtg atc ctc acc 288
Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val Ile Leu Thr
85 90 95
cag tgg ctg ttg tca agg agc tct gag cgc gaa gat ttg tgg cag tcc 336
Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu Trp Gln Ser
100 105 110
acc cat gtg ggg cat gat gag ttc agc aag aca aag cca acc aag gag 384
Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro Thr Lys Glu
115 120 125
aag att gcc cag gct caa ctc ctt cgt cgc ggg ttg aag ttc gag tga 432
Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys Phe Glu
130 135 140
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<211> 143
<212> PRT
<213> Pleurotus cornucopiae
<400> 5
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1 5 10 15
Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly
20 25 30
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35 40 45
Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly
50 55 60
Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His Ser Val Ser
65 70 75 80
Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val Ile Leu Thr
85 90 95
Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu Trp Gln Ser
100 105 110
Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro Thr Lys Glu
115 120 125
Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys Phe Glu
130 135 140
<210> 6
<211> 426
<212> DNA
<213> Pleurotus cornucopiae
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(426)
<400> 6
atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48
Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu
1 5 10 15
aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96
Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly
20 25 30
aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144
Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser
35 40 45
ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192
Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly
50 55 60
tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg 240
Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288
Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp
85 90 95
ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336
Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu
100 105 110
gtg ggg aat gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384
Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile
115 120 125
gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426
Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys
130 135 140
<210> 7
<211> 141
<212> PRT
<213> Pleurotus cornucopiae
<400> 7
Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly
20 25 30
Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser
35 40 45
Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly
50 55 60
Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile
115 120 125
Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys
130 135 140
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser
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<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 9
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 10
Gly Ala Ser Ala Gly
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 11
Gly Ser Gly Ala Ala
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 12
Gly Ser Gly Ser Ala
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 6
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 14
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 7
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 8
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 16
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Ala Ala
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 19
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer SITH1C-5xlink-TM2N-F
<400> 19
ccgaaaactg aaatgaatgt gggtggcggt ggcagcggtg gcggtggcag cggtggcggt 60
ggcagcggtg gcggtggcag cggtggcggt ggcagctcag acgttcaatc ttcactc 117
<210> 20
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer SITH1C-5xlink-TM2N-R
<400> 20
gagtgaagat tgaacgtctg agctgccacc gccaccgctg ccaccgccac cgctgccacc 60
gccaccgctg ccaccgccac cgctgccacc gccacccaca ttcatttcag ttttcgg 117
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer SITH1C-5' EcoRI-F
<400> 21
aaagaattcg gatatgaaga aaaagtgtc 29
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer TM2CtermBam
<400> 22
tttggatcct tacttcaacc tcggtgcg 28
<210> 23
<211> 981
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding fusion protein SITH-1-TM2
<400> 23
atg gaa ttc gga tat gaa gaa aaa gtg tca gct act gga aag act cgt 48
Met Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Lys Val Ser Ala Thr Gly Lys Thr Arg
1 5 10 15
tta aag ata ctg gca tgt ctg atc gtt tta ata cta gct gcg gca ata 96
Leu Lys Ile Leu Ala Cys Leu Ile Val Leu Ile Leu Ala Ala Ala Ile
20 25 30
act atg tta acg ctg gaa att ata tcg aac caa aaa cgt acc act act 144
Thr Met Leu Thr Leu Glu Ile Ile Ser Asn Gln Lys Arg Thr Thr Thr
35 40 45
gat ctc gaa gct gtg act gtg gcg ctg aag cat gta agc aca tct ctt 192
Asp Leu Glu Ala Val Thr Val Ala Leu Lys His Val Ser Thr Ser Leu
50 55 60
gcc agc tgc act gaa tcc act act tct gta cat acc gat tct gtg acg 240
Ala Ser Cys Thr Glu Ser Thr Thr Ser Val His Thr Asp Ser Val Thr
65 70 75 80
agc caa ccc acg aaa aac aaa gaa tcg agg aaa aaa att gaa ggg aaa 288
Ser Gln Pro Thr Lys Asn Lys Glu Ser Arg Lys Lys Ile Glu Gly Lys
85 90 95
tct cca agt tgg gtt cag gct tta act aca gca tct gga att atc cta 336
Ser Pro Ser Trp Val Gln Ala Leu Thr Thr Ala Ser Gly Ile Ile Leu
100 105 110
ctg ttt tgt ata atg atg ata ttc att aca tgt tcc tgg acc aca gaa 384
Leu Phe Cys Ile Met Met Ile Phe Ile Thr Cys Ser Trp Thr Thr Glu
115 120 125
aaa gat aca gag aag agt gaa gtg caa tct tat gct tct tca gta gag 432
Lys Asp Thr Glu Lys Ser Glu Val Gln Ser Tyr Ala Ser Ser Val Glu
130 135 140
act tta gac tct tta aat gag gct att ata ccg aaa act gaa atg aat 480
Thr Leu Asp Ser Leu Asn Glu Ala Ile Ile Pro Lys Thr Glu Met Asn
145 150 155 160
gtg ggt ggc ggt ggc agc ggt ggc ggt ggc agc ggt ggc ggt ggc agc 528
Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
ggt ggc ggt ggc agc ggt ggc ggt ggc agc tca gac gtt caa tct tca 576
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Val Gln Ser Ser
180 185 190
ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc aac tcc aag atg gaa ttg act 624
Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr
195 200 205
gca aac aaa gac ggt act ctc act gga aag tac ctc tcc aaa gtt ggg 672
Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly
210 215 220
gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct ggt cgc tat aac ctc caa ccc 720
Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro
225 230 235 240
ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg tgg gcg gta tcc tgg gag aac 768
Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn
245 250 255
agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg agc gga cag ttc ttc tct gag 816
Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu
260 265 270
tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg ttg ttg tca tcg agc act gcg 864
Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala
275 280 285
cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt gtg ggg aat gat tcg ttt aca 912
Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr
290 295 300
aag acg gcg ccg act gag cag cag atc gct cat gct caa ctc cat tgt 960
Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile Ala His Ala Gln Leu His Cys
305 310 315 320
cgc gca ccg agg ttg aag taa 981
Arg Ala Pro Arg Leu Lys
325
<210> 24
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusion protein SITH-1-TM2
<400> 24
Met Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Lys Val Ser Ala Thr Gly Lys Thr Arg
1 5 10 15
Leu Lys Ile Leu Ala Cys Leu Ile Val Leu Ile Leu Ala Ala Ala Ile
20 25 30
Thr Met Leu Thr Leu Glu Ile Ile Ser Asn Gln Lys Arg Thr Thr Thr
35 40 45
Asp Leu Glu Ala Val Thr Val Ala Leu Lys His Val Ser Thr Ser Leu
50 55 60
Ala Ser Cys Thr Glu Ser Thr Thr Ser Val His Thr Asp Ser Val Thr
65 70 75 80
Ser Gln Pro Thr Lys Asn Lys Glu Ser Arg Lys Lys Ile Glu Gly Lys
85 90 95
Ser Pro Ser Trp Val Gln Ala Leu Thr Thr Ala Ser Gly Ile Ile Leu
100 105 110
Leu Phe Cys Ile Met Met Ile Phe Ile Thr Cys Ser Trp Thr Thr Glu
115 120 125
Lys Asp Thr Glu Lys Ser Glu Val Gln Ser Tyr Ala Ser Ser Val Glu
130 135 140
Thr Leu Asp Ser Leu Asn Glu Ala Ile Ile Pro Lys Thr Glu Met Asn
145 150 155 160
Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Val Gln Ser Ser
180 185 190
Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr
195 200 205
Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly
210 215 220
Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro
225 230 235 240
Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn
245 250 255
Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu
260 265 270
Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala
275 280 285
Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr
290 295 300
Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile Ala His Ala Gln Leu His Cys
305 310 315 320
Arg Ala Pro Arg Leu Lys
325
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HarpinNtermEcoRI-F
<400> 25
aaagaattca tgcagagtct cagtcttaa 29
<210> 26
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HarpinC-5xlink-TM2N-R
<400> 26
gtgaagattg aacgtctgag ctgccaccgc caccgctgcc accgccaccg ctgccaccgc 60
caccgctgcc accgccaccg ctgccaccgc caccggctgc agcctgattg cggg 114
<210> 27
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer HarpinC-5xlink-TM2N-F
<400> 27
cccgcaatca ggctgcagcc ggtggcggtg gcagcggtgg cggtggcagc ggtggcggtg 60
gcagcggtgg cggtggcagc ggtggcggtg gcagctcaga cgttcaatct tcac 114
<210> 28
<211> 1029
<212> DNA
<213> Pseudomonas syringae
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1029)
<400> 28
atg cag agt ctc agt ctt aac agc agc tcg ctg caa acc ccg gca atg 48
Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met
1 5 10 15
gcc ctt gtc ctg gta cgt cct gaa acc gag acg act ggc gcc agt acg 96
Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Thr Glu Thr Thr Gly Ala Ser Thr
20 25 30
tcg agc aag gcg ctt cag gaa gtt gtc gtg aag ctg gcc gag gaa ctg 144
Ser Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu
35 40 45
atg cgc aat ggt caa ctc gac gac agc tcg cca ttg ggc aaa ctg ctg 192
Met Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu
50 55 60
gcc aag tcg atg gcc gcg gat ggc aag gca ggc ggc ggt atc gag gat 240
Ala Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp
65 70 75 80
gtc atc gct gcg ctg gac aag ctg att cat gaa aag ctg ggt gac aac 288
Val Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn
85 90 95
ttc ggc gcg tct gcg gac aac gcc tcg ggt acc gga cag cag gac ctg 336
Phe Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu
100 105 110
atg act cag gtg ctc agt ggc ctg gcc aag tct atg ctc gat gat ctt 384
Met Thr Gln Val Leu Ser Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu
115 120 125
ctg acc aag cag gat ggc ggg gca agc ttc tcc gaa gac gat atg ccg 432
Leu Thr Lys Gln Asp Gly Gly Ala Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro
130 135 140
atg ctg aac aag atc gcg cag ttc atg gat gac aat ccc gca cag ttt 480
Met Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe
145 150 155 160
ccc aag ccg gac tcg ggt tcc tgg gtg aac gaa ctc aag gaa gac aac 528
Pro Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn
165 170 175
ttc ctt gat ggc gac gaa acg gct gcg ttc cgc tcg gca ctc gac atc 576
Phe Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile
180 185 190
att ggc cag caa ctg ggt aat cag cag agt ggc gct ggc ggt ctg gcg 624
Ile Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Gly Ala Gly Gly Leu Ala
195 200 205
ggg acg ggt gga ggt ctg ggc act ccg agc agt ttt tct aac aac tcg 672
Gly Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser
210 215 220
tcc gtg acg ggt gat ccg ctg atc gac gcc aat acc ggt ccc ggt gac 720
Ser Val Thr Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp
225 230 235 240
agc ggc aat agc agt ggt gag gcg ggg caa ctg atc ggc gag ctt atc 768
Ser Gly Asn Ser Ser Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile
245 250 255
gac cgt ggc ctg caa tcg gta ttg gcc ggt ggt gga ctg ggc aca ccc 816
Asp Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro
260 265 270
gta aac acc ccg cag acc ggt acg gcg gcg aat ggc gga cag tcc gct 864
Val Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ala Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala
275 280 285
cag gat ctt gac cag ttg ctg ggc ggc ttg ctg ctc aag ggc ctt gaa 912
Gln Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu
290 295 300
gcg acg ctc aag gat gcc ggt caa acc gct acc gac gtg cag tcg agc 960
Ala Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Ala Thr Asp Val Gln Ser Ser
305 310 315 320
gct gcg caa atc gcc acc ttg ctg gtc agt acg ctg ctg caa ggc acc 1008
Ala Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr
325 330 335
cgc aat cag gct gca gcc tga 1029
Arg Asn Gln Ala Ala Ala
340
<210> 29
<211> 342
<212> PRT
<213> Pseudomonas syringae
<400> 29
Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met
1 5 10 15
Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Thr Glu Thr Thr Gly Ala Ser Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu
35 40 45
Met Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu
50 55 60
Ala Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp
65 70 75 80
Val Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn
85 90 95
Phe Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu
100 105 110
Met Thr Gln Val Leu Ser Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu
115 120 125
Leu Thr Lys Gln Asp Gly Gly Ala Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro
130 135 140
Met Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe
145 150 155 160
Pro Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn
165 170 175
Phe Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile
180 185 190
Ile Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Gly Ala Gly Gly Leu Ala
195 200 205
Gly Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser
210 215 220
Ser Val Thr Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp
225 230 235 240
Ser Gly Asn Ser Ser Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile
245 250 255
Asp Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro
260 265 270
Val Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ala Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala
275 280 285
Gln Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Ala Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Ala Thr Asp Val Gln Ser Ser
305 310 315 320
Ala Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr
325 330 335
Arg Asn Gln Ala Ala Ala
340
<210> 30
<211> 1524
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding fusion protein Harpin-TM2
<220>
<223> Harpin (1-1026) - Linker (1027-1101) - Tamavidin2 (1102-1524)
<400> 30
atg cag agt ctc agt ctt aac agc agc tcg ctg caa acc ccg gca atg 48
Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met
1 5 10 15
gcc ctt gtc ctg gta cgt cct gaa acc gag acg act ggc gcc agt acg 96
Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Thr Glu Thr Thr Gly Ala Ser Thr
20 25 30
tcg agc aag gcg ctt cag gaa gtt gtc gtg aag ctg gcc gag gaa ctg 144
Ser Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu
35 40 45
atg cgc aat ggt caa ctc gac gac agc tcg cca ttg ggc aaa ctg ctg 192
Met Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu
50 55 60
gcc aag tcg atg gcc gcg gat ggc aag gca ggc ggc ggt atc gag gat 240
Ala Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp
65 70 75 80
gtc atc gct gcg ctg gac aag ctg att cat gaa aag ctg ggt gac aac 288
Val Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn
85 90 95
ttc ggc gcg tct gcg gac aac gcc tcg ggt acc gga cag cag gac ctg 336
Phe Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu
100 105 110
atg act cag gtg ctc agt ggc ctg gcc aag tct atg ctc gat gat ctt 384
Met Thr Gln Val Leu Ser Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu
115 120 125
ctg acc aag cag gat ggc ggg gca agc ttc tcc gaa gac gat atg ccg 432
Leu Thr Lys Gln Asp Gly Gly Ala Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro
130 135 140
atg ctg aac aag atc gcg cag ttc atg gat gac aat ccc gca cag ttt 480
Met Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe
145 150 155 160
ccc aag ccg gac tcg ggt tcc tgg gtg aac gaa ctc aag gaa gac aac 528
Pro Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn
165 170 175
ttc ctt gat ggc gac gaa acg gct gcg ttc cgc tcg gca ctc gac atc 576
Phe Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile
180 185 190
att ggc cag caa ctg ggt aat cag cag agt ggc gct ggc ggt ctg gcg 624
Ile Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Gly Ala Gly Gly Leu Ala
195 200 205
ggg acg ggt gga ggt ctg ggc act ccg agc agt ttt tct aac aac tcg 672
Gly Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser
210 215 220
tcc gtg acg ggt gat ccg ctg atc gac gcc aat acc ggt ccc ggt gac 720
Ser Val Thr Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp
225 230 235 240
agc ggc aat agc agt ggt gag gcg ggg caa ctg atc ggc gag ctt atc 768
Ser Gly Asn Ser Ser Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile
245 250 255
gac cgt ggc ctg caa tcg gta ttg gcc ggt ggt gga ctg ggc aca ccc 816
Asp Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro
260 265 270
gta aac acc ccg cag acc ggt acg gcg gcg aat ggc gga cag tcc gct 864
Val Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ala Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala
275 280 285
cag gat ctt gac cag ttg ctg ggc ggc ttg ctg ctc aag ggc ctt gaa 912
Gln Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu
290 295 300
gcg acg ctc aag gat gcc ggt caa acc gct acc gac gtg cag tcg agc 960
Ala Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Ala Thr Asp Val Gln Ser Ser
305 310 315 320
gct gcg caa atc gcc acc ttg ctg gtc agt acg ctg ctg caa ggc acc 1008
Ala Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr
325 330 335
cgc aat cag gct gca gcc ggt ggc ggt ggc agc ggt ggc ggt ggc agc 1056
Arg Asn Gln Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
ggt ggc ggt ggc agc ggt ggc ggt ggc agc ggt ggc ggt ggc agc tca 1104
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
355 360 365
gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc aac tcc 1152
Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser
370 375 380
aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga aag tac 1200
Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr
385 390 395 400
ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct ggt cgc 1248
Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg
405 410 415
tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg tgg gcg 1296
Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly Trp Ala
420 425 430
gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg agc gga 1344
Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly
435 440 445
cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg ttg ttg 1392
Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu
450 455 460
tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt gtg ggg 1440
Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu Val Gly
465 470 475 480
aat gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc gct cat 1488
Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile Ala His
485 490 495
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Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys
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<223> Harpin (1-342) - Linker (343-367) - Tamavidin2 (368-507)
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1 5 10 15
Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Thr Glu Thr Thr Gly Ala Ser Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu
35 40 45
Met Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu
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Val Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn
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Ser Val Thr Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp
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Ser Gly Asn Ser Ser Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile
245 250 255
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500 505
Claims (8)
- 생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법으로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에,
(a) 생물학적 시료, 및
(b-i) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과 비오틴 결합성 단백질, 혹은
(b-ii) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액
을 혼합하여 첨가한다; 그리고,
4) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는
것을 포함하는, 상기 방법. - 생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법으로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에, 비오틴 결합성 단백질을 접촉시켜 담체의 블로킹을 실시하고;
4) 공정 3)의 블로킹 공정 후, 융합 단백질이 결합한 담체에, 생물학적 시료를 첨가하고, 그리고,
5) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는
것을 포함하는, 상기 방법. - 생물학적 시료 중의 물질을 검출하는 방법으로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에, 비오틴 결합성 단백질을 접촉시켜 담체의 블로킹을 실시하고;
4) 공정 3)의 블로킹 공정 후, 융합 단백질이 결합한 담체에,
(a) 생물학적 시료, 및
(b-i) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과, 비오틴 결합성 단백질, 혹은
(b-ii) 공정 1)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액을 혼합하여 첨가한다; 그리고,
5) 융합 단백질 중의 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질에 결합한 피검물질을 검출하는
것을 포함하는, 상기 방법. - 제1항 또는 제3항에 있어서,
청구항 1의 공정 3(b-i) 또는 청구항 3의 공정 4(b-i)에 있어서, 세포파쇄 추출액으로서, 임의의 벡터를 포함하는 세포로부터 추출한 세포파쇄 추출액을 첨가하는, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
비오틴 결합성 단백질이 타마비딘 또는 그 변이체인, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적 시료가, 혈액, 혈청, 뇌척수액, 타액, 땀, 소변, 눈물, 림프액, 및 모유로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법. - 생물학적 시료 중의 물질을 검출하기 위한 담체로서,
1) 비오틴을 결합시킨 담체, 및, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질을 준비하고;
2) 비오틴-비오틴 결합성 단백질간의 결합을 개재하여, 공정 1)에서 준비한 담체에 융합 단백질을 결합시켜, 융합 단백질이 결합한 담체를 작성하고;
3) 공정 2)에서 작성한 융합 단백질이 결합한 담체에, 비오틴 결합성 단백질을 접촉시켜 담체의 블로킹을 실시하는
것을 포함하는 방법에 따라 조제된, 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질이, 비오틴-비오틴 결합성 단백질간 결합에 의해서 결합하고 있는, 담체. - 생물학적 시료 중의 물질을 검출하기 위한 키트로서,
A) 검출해야 할 물질과 특이적으로 결합하는 단백질과 비오틴 결합성 단백질과의 융합 단백질이, 비오틴-비오틴 결합성 단백질간 결합에 의해서 결합하고 있는, 담체; 및,
B-i) A)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액과 비오틴 결합성 단백질, 혹은
B-ii) A)의 융합 단백질을 발현시키는데 이용한 숙주 세포와 동종의 세포에 유전자 공학 기술에 의해 비오틴 결합성 단백질을 발현시킨 세포로부터 조제한 세포파쇄 추출액을 포함하는, 생물학적 시료를 희석하기 위한 제; 및/또는
C) 비오틴 결합성 단백질을 포함하는 블로킹제
를 포함하는 키트.
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