BRPI0816103A2 - método para ligar proteínas a carregadores por fazer uso de tamavidinas. - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA LIGAR PROTEÍNAS A CARREADORES POR FAZER USO DE TAMAVIDINAS. A presente invenção refere-se a um método para Iigar uma proteína a um carreador de tal maneira que a proteína não seja prejudicada na sua função, mas pode permitir que aja de forma mais eficiente do que quando ela está ligada diretamente. O método da presente invenção para ligar uma proteína a um carreador compreende: preparar um carreador ligado à biotina; preparar uma proteína de fusão tendo a proteína ligada a um tamavidin e ligar a proteína ao carreador através de ligações tamavidinm biotina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA LIGAR PROTEÍNAS A CARREADORES POR FAZER USO DE TA- MAVIDINAS". Campo técnico Este pedido de patente reivindica prioridade baseado no Pedido de Patente japonesa N°. 2007 220921, depositado em 28 de agosto de

2007. A presente invenção refere-se a um método para ligar proteínas e carreadores por fazer uso de tamavidinas. Antecedentes da Invenção Até agora, qs métodos comuns conhecidos para fazer as proteí- nas se ligarem a carreadores como microplacas, micro grânulos ou chips sensores incluem ligação hidrofóbica, ligação covalente e similares. A liga- ção hidrofóbica depende da interação entre uma superflcie hidrofóbica do carreador e uma porção hidrofóbica da proteina e é conveniente na medida em que ela não requer nenhum reagente especial; por outro Iado, ela geral- mente apresenta uma força de ligação fraca e se é usada no teste ELISA (método imunoenzimático) ou similares, a lavagem e outras operações que são executadas após a ligação, muitas vezes causam a saída da protelna do carreador. Sabe-se também que quando as protelnas e os carreadores es- tão Iigados por Iigação hidrofóbica, a maioria das proteinas perde total ou parcialmente suas funções. Em contrasíe, a ligação covalente apresenta uma força de ligação forte, porque depende da interação entre grupos fun ' cionais (por exempb, grupos aminos) na proteína e grupos funcionais (por exemplo, grupos carboxílicos) existentes na superfície do carreador. Entre- tanto, quando protelnas e carreadores estão ligados por ligação covalente, a maioria das proteínas tem suas funções totai ou parcialmente perdidas, co- mo no caso da ligação hidrofóbica. Além da ligação hidrofóbica e da ligação covalente, um método é conhecido em que uma pIuralidade de histidinas é fundida a uma extremida- de terminal da proteína e a prõtelna fundida tendo tais marcadores de histi- dina é ligada a um substrato, como um chip de proteína que tem níquel exis-

tente em sua superfície.

Entretanto, a interação entre o marcador da histidi- na e o Íon do niquel não é muito forte e, mais, o Íon do níquel que é conhe- cido por ligar não especificamente a várias biomoléculas não é necessaria- mente uma ferramenta para todos os fins. 5 A avidina é uma glicoprotelna derivada da clara de ovo e se liga à biotina (vitamina H) extremamente forte.

A interação entre a biotina e a avidina é uma dos modos mais fortes de ligação não-covalentes (Green (1975) Adv Protein Chem 29: 85-133). A estreptavidina é uma proteina se- melhante à avidina derivada dos actinomicetos e também se Iiga fortemente 10 à biotina.

Até agora, a interação (estrepta) avidina-biotina, devido à sua grande força, tem sido usada extensivamente nas áreas de biologia molecu- Iar e bioquímica para tais fins como a detecção de antígenos e anticorpos (Green (1990) Methods Enzymol 184: 51-67). Métodos têm sido projetados que ligam proteínas aos carreado- : 15 res, fazendo uso da capacidade de ligação da biotina a avidina ou a estrep- . tavidina descrita acima.

Um exemplo é um método em que a (estrepta) avi- dina é fixada a um substrato, tal como uma microplaca por ligações covalen- tes ou hidrofóbicas e uma proteína biotinilada é então imobilizada pela liga- ção com a (estrepta) avidina.

Neste método, entretanto, a atividade da avidi- 20 na por si só é parcialmente perdida e, mais ainda, a atividade específica de ligação da protelna através da biotina diminui, resultando em uma eficiência de ação que não é de forma nenhuma satisfatória.

Em contraste, uma técnica tem sido relatada em que uma prote- Ína avidina é primeiro ligada a um substrato, ligado à biotina, formando liga- 25 ções avidina-biotina, para a qual uma proteína biotinilada desejada é ligada para garantir que a avidina seja Iigada aos bolsos de biotina adicionais, pe- Ios quais a biotina, avidina, biotina, e a proteína desejada são fixadas nessa ordem ao substrato (JP 4-236353 Al). Entretanto, esse método envolve a " etapa de biotinilizar a protelna desejada, que resulta na necessidade de tra-

.- 30 balho adicional; outro problema é a necessidade de levar em consideração a eficiência da marcação da biotina.

Até agora, a fim de usá-las como um marcador de proteína, um marcador para diagnóstico, ou um fator para atingir uma célula específica, as

- protelnas fundidas usando avidina ou estreptavidina tem sido preparadas (Airenne et al. (1999) Biomol Eng 16:87-92). Em particular, as proteínas fun- didas preparadas ao fundir a avidina ou a estreptavidina aos anticorpos, tais 5 como os fragmentos scFv ou Fab e a lgG têm sido estudados por suas apli- cações potenciais em atingir especificamente os fármacos para as células cancerosas e similares.

Além disso, a ideia tem sido descrita de uma coluna que usa uma proteína fundida estreptavidina-scFv para fixar o scFv através das ligações avidina-biotina (Kiprivanov et al. (1995) Hum Antib Hybrid 6: 93 10 101 e Dubel et al. (1995) J lmmunol Methods 178: 201-209). Entretanto, a avidina e a estreptavidina são difíceis de expressar na E. coli como uma forma solúvel em alto rendimento; e mais, não houve nenhum relatório no qual uma proteína fundida a avidina ou uma protelna fundida a estreptavidi- . na fosse imobilizada por estar ligada a um carreador biotinilado assim como : 15 para melhorar a atividade da proteína em comparação com métodos con- vencionais de ligação.

Pelo contrário, tem sido relatado que, quando uma protelna de fusão de estreptavidina e de j3-galactosidase foi ligada a partícu- las biotiniladas, a atividade específ ica de jj-galactosidase diminuiu para cer- ca de 5O°/j (Huang et al. (1996) Enzyme and Microbial technology). 20 Documento 1 Patente (Patent Document): JP 4-236353 Al Documento 2 Patente: WO02/07281 7 Documento 3 Patente: PCT/JP2006/326260 Documento 4 Patente: PCT/JP2006/304993 Documento 1 não patente(Non-patent Document): Green (1975) Adv Pro- 25 tein Chem 29: 85-133 Documento 2 não patente: Green (1990) Methods Enzymol 184: 51-67

" Documento 3 não patente: Airenne et al. (1999) Biomol Eng 16: 87-92 Documento 4 não patente: Kiprivanov et al. (1995) Hum Antib Hybrid 6: 93- - . " 1 01 .. 30 Documento 5 não patente: Dubel et al. (1995) J lmmunol Methods 178: 201- 209 Documento 6 não patente: Huang et al. (1996) Enzyme and Microbial tech-

nology Documento 7 não patente: Hofmann et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 4666-4668 Document 8 não patente: lba et al. (1997) Gene 194: 35-46 5 Documento 9 não patente: ldeno et al. (2004) Appl Microbiol Biotechnol 64: 99-105 Documento 10 não patente: Kada et al. (1999) Biochim, Biophys.

Acta., 1427: 33-43 Descrição da invenção 10 Problemas a serem solucionados pela invenção A presente invenção tem como objetivo fornecer um método pa- ra ligar uma proteína a um carreador de tal maneira que a proteína aja de forma mais eficiente do que quando está Iigada diretamente.

Os métodos * convencionais que envolvem a ligação direta das proteínas aos carreadores : 15 tiveram o problerna da atividade reduzida da proteína ligada.

A presente in- venção visa resolver este problema com métodos convencionais de imobili- zação de proteínas.

Meios para soIucionar os problemas Como resultado de seus esforços de investigação intensivos pa- 20 ra soIucionar o problema, os presentes inventores prepararam uma proteína com o tamavidin fundido a uma proteína desejada e descobriram que ligando a proteÍna fundida a um carreador com a biotina imobilizada em sua superfí- cie, a proteína desejada não foi prejudicada em sua função, mas poderia permitir também que agisse com muito mais eficiência do que quando foi 25 fixada ao carreador por métodos convencionais.

Para ser mais específico, os presentes inventores usaram prote- Ínas de fusão de uma enzima e do tamavidin para fazer com que elas fos- sem ligadas às partículas magnéticas biotiniladas, formando ligações tama- vidin-biotina e descobriu que a atividade enzimática melhorou enormemente

_ 30 por um fator 10, e mais comparado ao caso em que"a proteína enzimática era ligada às partículas magnética por ligação covalente.

Os inventores tam- bém descobriram que quando as proteínas de fusão de um fragmento de anticorpo e o tamavidin estavam Iigados a uma microplaca biotinilada, a ati- vidade de iigação do antlgeno foi maior do que no caso onde o fragmento do anticorpo de interesse estava ligado a microplaca por ligação hidrofóbica.

Os inventores ainda descobriram que quando as proteínas de fusão da proteina 5 A e o tamavidin estavam ligados a uma microplaca biotinilada e os anticor- pos foram então ligados a micropiaca, a sensjbj|jdade de detecção melhorou por um fator de cerca de 2 a 4, em comparação com o caso em que os anti- corpos foram diretamente ligados à microplaca por Iigação hidrofóbica.

Com base nestes resultados, a presente invenção fornece um 10 método novo para ligar as proteínas aos carreadores, sem prejudicar as ati- vidades dessas proteínas. [Modos para realizar a presente invenção] A presente invenção inclui preferencialmente os seguintes mo- dos. r 15 Modo (1) « Um método para ligar uma proteína a um carreador, que com- preende: preparar um carreador ligado à biotina; preparar uma proteína de fusão tendo a proteína ligada a 20 um tamavidin; e Iigar a proteína ao carreador através de ligações tamavidin- biotina.

Modo (2) O método de acordo com o modo 1, em que o tamavidin 25 é selecionado de: (a) uma proteína constituída de uma sequência de aminoácidos com deleção, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e tendo atividade de ligação à biotina, ou (b) uma proteína constituída de uína sequência de aminoácido 30 compartilhando uma identidade de 60% ou mais com a SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NO: 4 e tendo atividade de ligação à biotina, ou (C) uma proteina constituída de uma sequência de aminoácido daSEQIDNO:2edaSEQIDNO:4;ou (d) uma protelna constitulda de uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico hibridizável sob condições estritas, com um filamento complementar à sequência de base da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ 5 ID NO: 3 e tendo atividade de ligação à biotina.

Modo (3) O método de acordo com qualquer um dos modos 1 e 2, em que a proteína é selecionada do grupo constituído de anticorpos ou fragmen- tos do mesmo, proteínas antigênicas, enzimas, lectinas, peptídeos, proteína 10 A, protelna G e protelna L.

Modo (4) O método de acordo com qualquer um dos modos de 1 a 3, em que o carreador é selecionado do grupo constituído de grânulos, partículas D4 magnéticas, filmes finos, microtubos, filtros, placas, microplacas, nanotubos r 15 de carbono e chips sensores. - Modo (5) O método de acordo com qualquer um dos modos de 1 a 4, em que o tamavidin e a proteína são ligados através de um ligador para constitu- ir a proteína de fusão. 20 Mode (6) O modo de acordo com qualquer um dos modos de 1 a 4, em que o tamavidin e a proteína são ligados através de um Iigador, constituído de seis ou mais aminoácidos para formar a proteína de fusão.

Modo (7) 25 O método de acordo com qualquer um dos modos de 1 a 6, em que a proteína de fusão tem ainda uma sequência líder ligada a ela.

Modo (8) O método de acordo com qualquer um dos modos de 1 a 7, em que a biotina e o carreador estão ligados" através de um ligador superior a 30 13,5 Â de comprimento.

Modo (9) Um carreador da protelna de ligação fundido ao tamavidin no qual uma proteína de fusão tendo uma proteína ligada a um tamavidin é li- gada a um carreador ligado à biotina através de ligações tamavidin-biotina.

Modo (10) Um vetor de expressão para expressar uma proteína fundida ao 5 tamavidin que compreende uma codificação do ácido nucleico para uma pro- teína de fusão tendo um tamavidin ligado a uma protelna através de um li- gador.

Nas páginas seguintes, os modos preferidos para realizar a pre- sente invenção são descritos. 10 Tamavidins Os tamavidins são proteínas novas de (igação à biotina que fo- ram descobertos em um cogumelo comestível, P/eurotus cornucopiae (WO 02/07281 7). Este documento mostra: 3 - que o tamavidin 1 e o tamavidin 2 têm uma homologia de ami- · 15 noácidos de 65,5% uns com os outros e se ligam fortemente à biotina; - - que o tamavidin 2 é altamente expressado na E.

CO// em fra- ções solúveis e - que, quando o tamavidin 2 foi expresso na E. co/i, uma cultura de 4,5 hr produziu uma proteína recombinante purificada de alta pureza em 20 uma quantidade de cerca de 1 mg por 50 ml de cultura; este é um valor mui- to alto, maior ainda que aqueles para avidina e estreptavidina que são co- nhecidos como protelnas de Iigação à biotina.

Os presentes inventores fizeram mais estudos sobre os tamavi- dins e descobriram o seguinte: 25 - O tamavidin 1 também é altamente expressado na E. co/i em frações solúveis: e - quando o tamavidin 1 foi expresso na E. co/i, uma cultura de 4,5 hr também deu uma proteína recombinante purificada de alta pureza em uma quantidade de"cerca de 1 mg por 50 ml de cultura. 30 Carreadores que tinham proteinas, tais como enzimas ou anti- corpos iigados a ela pelo método de ligação da presente invenção, que usou a proteína fundida com o tamavidin com sucesso, exibiram um aumento sig-

nificativo em suas atividades em comparação com os carreadores conven- cionais aos quais eles eram ligados por ligação hidrofóbica ou Iigação cova- lente.

Resumidamente, ao expressar uma proteína desejada como uma pro- telna de fusão com um tamavidin e Iigando a proteína de fusão de um carre- 5 ador ligado à biotina, a atividade da protelna desejada poderia ser significati- vamente melhorada ao longo do processo onde ela estava ligada por outros métodos.

Embora não deseje estar ligada por teoria, especula-se que a ra- zão seria devido ao efeito da orientação da proteína.

Além disso, quando a ligação foi efetuada por este método, a purificação da proteína e a ligação ao 10 carreador poderiam ser realizadas simultaneamente para que o processo de produção pudesse ser bastante simplificado para realizar uma redução signi- ficativa na mão-de-obra e no custo.

E mais, se a lectina for escolhida como a proteína desejada, ela pode ser imobilizada pelo presente método sem inter- " ferir com a sua atividade, embora as lectinas tenham sido consideradas até : 15 agora difíceis de se fixarem aos carreadores.

Assim, mesmo as proteínas que são dificeis de se fixarem aos carreadores podem ser imobilizadas pelo presente método sem nenhum problema.

Além disso, acredita-se que um carreador de ligação usando um tamavidin como uma protelna ligada à bioti- na tem uma menor extensão de ligação não-específica do que no caso con- 20 vencional onde a avidina é usada e que é mais resistente ao calor do que quando a estreptavidina é usada.

Em adição a isso, quando os tamavidins são usados, são diferentes da avidina e da estreptavidina, pois eles próprios são altamente expressos como uma forma solúvef no E. co/i, então se a pro- teína desejada a ser fundida aos tamavidins for expressa como uma forma 25 solúvel na E. co/i acredita-se também que a proteína de fusão seja expressa como uma forma solúvel no E. coli, portanto, a mão-de-obra e o custo ne- cessário para preparar esta proteína fundida ao tamavidin e o carreador ten- do esta proteína ligada a ele pode ser sensivelmente reduzido.

A força de ligação entre"o tamavidin e a biotina é mais forte do 30 que a de outras ligações, como a ligação supracitada entre os marcadores de histidina e o niquel, assim, após a proteína fundida estar ligada ao dese- jado carreador biotinilado, pode ser feita uma lavagem forte utilizando, por exemplo, um surfactante ou uma concentração de sal elevada, com o resul- tado que a extensão da ligação não específica na qual os biomateriais exce- to a proteína fundida ligada ao carreador pode ser minimizada.

Além do mais, comparado ao niquel, a biotina provoca uma quantidade quase insigni- 5 ficante de ligação não específica com biomateriais.

Estes contribuem para a redução do ruído na placa ELISA, partículas magnéticas ou chips sensores para serem finalmente preparados e para maior detecção de sensibilidade.

Os "tamavidins" como usados aqui significa o tamavidin 1, o ta- mavidin 2, ou variantes dos mesmos.

Especificamente, os tamavidins da 10 presente invenção podem ser tipicamente uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 4, ou uma proteína codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de bases da SEQ ID NO: 1 e da SEQ ID NO: 3. Por outro lado, eles podem ser r

" variantes das proteinas compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ . 15 ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 4, ou da proteína codificada por um ácido nucle- - ico compreendendo a sequência de base da SEQ ID NO: 1 e da SEQ ID NO: 3, desde que eles sejam proteínas que têm a mesma atividade de ligação à biotina como têm o tamavidin 1 ou 2. Doravante, o tamavidin 1, o tamavidin 2 e suas variantes são, às vezes, referidos coletivamente como simplesmente 20 tamavidins.

As variantes do tamavidin 1 ou 2, podem ser proteínas constitu- Ídas de uma sequência de aminoácido com deleção, substituição, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 4 e que tenham a atividade de ligação à 25 biotina como tem o tamavidin 1 ou 2. A substituição pode ser substituição conservadora, o que significa a substituição de um certo resíduo de aminoá- cido por outro resíduo com 'caracteristicas físicas e química semelhantes.

Exemplos não limitantes de substituição conservadora incluem a substituição de um grupo alifático contendo reslduo de aminoácido (por exemplo, lle, Val, 30 Leu Olj Ala) por outro, e a substituição de um resíduo poIar por outro, como entre Lys e Arg, ou Glu e Asp, ou Gln e Asn.

As variantes devido às deleções, substituições, inserções e/ou adições de aminoácidos, podem ser preparadas a partir do DNA codificando a proteína nativa através da aplicação de uma técnica bem conhecida, por exemplo, a mutagênese sÍtio-específico (ver, por exemplo, Nucleic Acid Re- search, vol. 10, N°. 20, p.6487-6500, 1982, que está aqui incorporada por 5 referência em suas totalidade). Conforme usada aqui, a expressão 'um ou mais aminoácidos" significa um número viável de aminoácidos que podem ser eliminados, substituídos, inseridos e/ou adicionados por mutagênese sÍtio-específico.

Também deve ser observado que a expressão "um ou mais aminoácidos" conforme usada neste documento pode, às vezes, significar 10 um ou vários aminoácidos.

A mutagênese sÍtio-específico pode ser realizada como se se- gue usando oligonucleotídeos primers sintéticos que são complementares ao DNA do fago de filamento único para sofrer mutação, exceto por uma in- -- compatibilidade específica que corresponde à mutação desejável.

Para ser : 15 mais específico, os oIigonucleotídeos sintéticos supramencionados são usa- dos como primers para sintetizar um filamento complementar ao fago e uma célula hospedeira é transformada com o DNA de filamento duplo resultante.

A cultura da célula transformada é semeada em ágar e as placas são forma- das das células únicas contendo fago.

Então, teoricamente, 50°6 das novas 20 colônias que contem fagos tendo uma mutação em um filamento único e os restantes 50% têm a sequência original.

As placas obtidas são hibridizadas com uma sonda sintética, marcadas pelo tratamento com quinase, a uma temperatura que permite a hibridização com as colônias que exibem corres- pondência completa com o DNA tendo a mutação desejável supracitada, 25 mas que não permite a hibridação com as colônias tendo o filamento origi- nal.

Subsequentemente, as placas que hibridizam com essa sonda são co- lhidas e cultivadas para recuperação do DNA, Observe que os métodos para a introdução de deleção, substitu- ição, inserção e/ou adição de "um ou mais aminoácidos na sequência de a- 30 minoácido de um peptídeo biologicamente ativo, enquanto retém a sua ativi- dade, inclui não só a mutagênese sÍtio-especÍfico descrita acima, mas tam- bém um método que compreende o tratamento do gene com um mutagêni-

co, bem como um método que compreende a clivagem do gene seletivamen- te, então removendo, substituindo, inserindo ou adicionando os nucleotídeos escolhidos e, finalmente, ligando os fragmentos clivados. Mais preferivel- mente, os tamavidins conforme usados na presente invenção são protelnas 5 constituldas de uma sequência de aminoácido com deleção, substituição, inserção ou a adição de um a dez aminoácidos na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 4 e que têm atividade de ligação da biotina. A variante do tamavidin 1 ou 2 pode ser também uma proteína 10 que compreende uma sequência de aminoácido sendo pelo menos 60% i- dêntica, de preferência pelo menos 65% idêntica, pelo menos 70% idêntica, pelo menos 75% idêntica, pelo menos 80% idêntica, pelo menos 85% idênti- ca, pelo menos 9(J°/o idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, ou pelo menos . 15

F 99% idêntica, e mais preferencialmente pelo menos 99,3% idêntica com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 4 e que tem a atividade de ligação à biotina semelhante como o tamavidin 1 ou 2 tem. A identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada por inspeção visual e cálculo matemático. Alternati- 20 vamente, identidade percentual de duas sequências de proteína pode ser determinada por comparação com informação da sequência usando o pro- grama de computador GAP que é baseado no algoritmo de Needleman, S.B. e Wunsch, C.D. (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970) e que está disponível na University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Os parâme- 25 tros padrão preferido para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de pon- tuação, blosum 62, como descrito por Henikoff, S. e Henikoff, J.G. (Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 1992); (2) um peso do gap de 12, (3) um peso do comprimento do gap de 4, e (4) nenhuma penalidade para gaps finais. 30 Outros programas usados pelos artesãos qualificados para a - comparação de sequência também podem ser usados. A identidade percen- tual pode ser determinada por comparação com informação da sequência usando o programa BLAST descrito, por exemplo, por Altschul et al. (Nucl.

Acids.

Res., 25, p. 3389-3402, 1997). Este programa pode ser acessado pe- la lnternet no site do National Center for Biotechnology lnformation (NCBI) · ou do DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Várias condições (parâmetros) para 5 a busca de identidade pelo programa BLAST são detalhadas nesses sites e parte das configurações pode ser variada conforme o caso, embora a pes- quisa seja normalmente realizada usando valores padrão.

Alternativamente, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser de- terminada por um programa, como o software de processamento de infor- lO mação genética GENETYX versão 7 (Genetyx) ou o algoritmo FASTA.

Neste caso alternativo, a pesquisa pode ser realizada usando os valores padrão.

A identidade percentual de duas sequências de ácido nucleico pode ser determinada por inspeção visual e cálculo matemático, ou mais preferencialmente por comparação com a informação da sequência usando : 15 um programa de computador.

Um programa de computador típico preferido é o pacote de Wisconsin, o programa GAP com versão 10.0, da Genetics Computer Group (GCG; Madison, Estado de Wisconsin) (Devereux et al., Nucl.

Acids Res. 12: 387, 1984). Usando este programa GAP, é possÍvel realizar a comparação não só entre duas sequências de ácidos nucleicos, 20 mas também entre duas sequências de aminoácidos, e entre uma sequência de ácido nucleico e uma sequência de aminoácido.

Aqui, os parâmetros pa- drão preferidos para o programa GAP incluem: (1) implementação de um GCG de uma matriz de comparação unária (com um valor de 1 para identi- dades e 0 para não identidades) de nucleotídeos, e a matriz de comparação 25 de aminoácido ponderada de Gribskov e Burgess, Nucl.

Acids Res. 14:

. 6745, 1986, conforme descrita por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Poly- peptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, " pp. 353-358, 1979, ou outras matrizes de comparação aplicáveis; (2) uma "' penalidade de 30 para cada gap de aminoácido e uma penalidade adicional 30 de 1 para cada símbolo em cada gap, ou uma penalidade de 50 para cada-. gap de uma sequência de nucleotídeos e uma penalidade adicional de 3 pa- ra cada sÍmbolo em cada gap; (3) nenhuma penalidade para gaps finais; e

(4) nenhuma penalidade máxima para gaps longos. Outros programas de comparação de sequências que são usados por especialistas e que podem ser usados na presente invenção incluem o programa BLAST, versão 2.2.7, que pode ser baixado do site da biblioteca nacional americana de medicina 5 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/b|ast/b|2seq/b|s.htm|) ou o algoritmo UW-BLAST 2,0, Configurações de parâmetros padrão para o UW-BLAST 2.0 são descri- tos no seguinte site: http://blast.wustl.edu. Além disso, o algoritmo BLAST usa a matriz de pontuação para aminoácido BLOSUM 62 e os parâmetros de seleção que podem ser usados são os seguintes: (A) a inclusão de um filtro 10 para mascarar os segmentos da sequência de consulta com complexidade composicional baixa (como determinado pelo programa SEG de Wootton e Federhen (Computers and Chemistry, 1993); ver também "Analysis of com- positionally biased regions in sequence databases" in Methods Enzymol., 266: 544-71, 1996), ou para mascarar segmentos compreendendo repeti- - 15

O ções internas de curta periodicidade (como determinado pelo programa XNU de Claverie e States (Computers and Chemistry, 1993)); e (B) probabilidades esperadas de uma combinação que pode ser encontrada meramente por acaso, de acordo com um modelo estatístico de Iimites, ou E-escores (Karlin e Altschul, 1990), de diferenças estatisticamente signifícativas para relatar 20 uma combinação com sequências do banco de dados (se uma diferença es- tatisticamente significativa devido a uma certa combinação for superior a um limite E-escore, a combinação não é relatada); o valor numérico de um limite E-escore preferencial é 0,5, ou em ordem de preferência crescente, 0,25, 0,1, 0,05, 0,01, 0,001, 0,0001, 1e-5, 1e-1O, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e- 25 40,1e-50,1e-75,ou1e-1OO. As variantes do tamavidin são programadas para não causar quaisquer efeitos negativos na atividade de ligação da biotina. É interessante notar que bolsos de biotina para estreptavidina que é uma das proteínas Ii- gadas à biotina já foram desvendados em certa medida. Enquanto a estrep- " 30 tavidina tem apenas cerca de 50% de homologia na sequência de aminoáci- do para o tamavidin 2, os presentes inventores, com o propósito de obter resultados sobre os bolsos de biotina para o tamavidin 2, compararam a se-

quência de aminoácido do tamavidin 2 com a da estreptavidina, colocando- os lado a lado.

Contatou-se que, entre os aminoácidos que formaram os bol- - sos de biotina para estreptavidina, os seguintes resíduos na interação direta com a biotina, ou seja, n23 s27, y43, s45, n49, w79, S88, t90, w92, 5 W108, W120 e D128 (Weber et al- (1989) Science 243: 85-88; e Livnah et al. (1993) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A. 90: 5076-5080), correspondeu a N14, S18, Y34, S36, D40, W69, S76, T78, W80, W96, W108 e D116, respectiva- mente, em TM2 e foram muito bem conservados.

Em particular, quatro resíduos de triptofano (W69, W80, W96, e 10 W108) são considerados a desempenhar um papel importante na estrutura dos bolsos de biotina, então eles são desejavelmente inalteráveis.

Além dis- so, outros aminoácidos que são considerados a participar na Iigação com a biotina, ou seja, os reslduos de aminoácidos em TM2 que são considerados . a interagir diretamente com a biotina (N14, S18, Y34, S36, S76, T78, e - 15 D116) são também desejavelmente inalteráveis.

Alternativamente, se estes resíduos de aminoácidos são para serem alterados, eles são desejavelmen- te alterados para aminoácidos que têm propriedades ou estruturas seme- lhantes para que a ligação à biotina possa ser mantida; em um caso exem- plar da asparagina (N14), uma variante é desejavelmente formada ao alterá- 20 Ia para glutamina (Q) ou para ácido aspártico (D), de preferência para ácido ' aspártico; no caso do ácido aspártico (D40), uma variante é desejavelmente formada ao modificá-lo para asparagina (N); no caso da serina (S18, S36 ou S76), uma variante é desejavelmente formada aomodificá-la para treonina (T) ou de tirosina (Y), de preferência para treonina; no caso da tirosina (Y34), 25 uma variante é desejavelmente formada ao modificá-la para serina (S), treo- nina (T) ou fenilalanina (F), de preferência para fenilalanina; no caso de tre- onina (T78)," uma variante é desejavelmente formada ao modificá-la para serina (S) ou tirosina (Y), de preferência para a serina; no caso de ácido as- pártico (D116), uma variante é desejavelmente formada ao modificá-lo para 30 ácido glutâmico (E) ou asparagina (N), de preferência para asparagina.

A variante do tamavidin 1 ou 2 pode ser também uma proteína que é codificada por um ácido nucleico compreendendo uma sequência de base que hibridiza com um filamento complementar à sequência de base da SEQ ID NO: 1 e da SEQ ID NO: 3 sob condições estritas e que tem a mes- . ma tendo atividade de ligação à biotina que tem o tamavidin 1 ou 2. . A expressão "sob condições estritas" usada aqui significa a hi- 5 bridação sob condições de gravidade moderada ou alta.

Especificamente, as condições de gravidade moderada podem ser facilmente determinadas por aqueles com versados na técnica baseada, por exemplo, no comprimento do DNA.

As condições básicas estão definidas em Sambrook et al.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.

Chapter 6, Cold Spring Harbor Labo- lO ratory Press, 2001, e incluem o uso de: uma solução de pré-lavagem de 5 x SSC, 0,5% SDS e 1,0 mM EDTA (pH 8,0); condições de hibridização de cer- ca de 50% de formamida, 2 x SSC-6 x SSC, de preferência 5-6 x SSC e 0,5% SDS, a cerca de 42°C (ou outras soluções de hibridação semelhantes, . como a solução Stark em 50% de formamida a cerca de 42° C); e condições - 15 de lavagem de cerca de 50-68°C, 0,1-6 x SSC e 0,1°6 SDS.

Preferencial- - mente, as condições de gravidade moderada incluem condições de hibridi- zação de cerca de 50°C, 6 x SSC e 0,5% SDS.

As condições de gravidade alta também podem ser facilmente determinadas pelo especialista baseadas, por exemplo, no comprimento do DNA. 20 Geralmente, essas condições incluem a hibridização em tempe- raturas altas e/ou em baixas concentrações de sal do que as condições de gravidade moderada (por exemplo, hibridização na presença de cerca de 0,5% SDS a cerca de 65° C, com 6 x SSC e 0,2 x SSC, de preferência 6 x SSC, mais preferencialmente 2 x SSC, ainda mais preferencialmente 0,2 x 25 SSC, ou 0,1 x SSC) e/ou lavagem, e podem ser definidas como condições de hibridização do tipo descrito acima, e que envolva a lavagem a cerca de 65-68° C-em 0,2 - 0,1 x SSC e O,i°/o SDS.

Na soIução-tampão para uso na hibridização e lavagem, SSC (1 x SSC consiste em 0,15 M de NaCl e 15 mM de citrato de-sódio) pode ser substituída por SSPE (1 x SSPE consiste" em 30 0,15 1VLde NaCl, 10 mM de NaH,PO, e 1,25 mM de EDTA, pH 7,4),. e a Iava- gem é realizada por aproximadamente de 15 minutos a uma hora após a hibridação ser completa.

Caso desejado, um kit comercial de hibridização pode ser em- pregado que não use uma substância radioativa como sonda.

Um exemplo específico é a hibridação que emprega um sistema de detecção & marcação direta ECL (produto da Amersham). A hibridação severa pode ser realizada 5 a 42° C por 4 horas após um reagente de bloqueio e NaCl serem adiciona- dos em quantidades respectivas de 5% (w/v) e 0,5 M para o tampão de hi- bridação no kit; a Iavagem pode ser realizada duas vezes em 0,4% SDS e 0,5 x SSC por 20 minutos cada a 55° C, então uma vez em 2 x SSC por 5 minutos em temperatura ambiente. 10 A atividade de ligação à biotina das variantes do tamavidin 1 ou 2 pode ser medida por qualquer uma das técnicas conhecidas.

Por exemplo, pode ser determinada por um método baseado na biotina fluorescente, con- forme descrito em Kada et al. (Biochim.

Biophys.

Acta., 1427: 33-43 (1999)). Este método é um sistema de análise que faz uso de tal natureza da biotina . 15 fluorescente que se ela se liga a um sÍtio ligado à biotina em uma proteína . ligada à biotina, sua intensidade de fluorescência torna-se extinta.

Alternati- vamente, a atividade de ligação à biotina das proteinas variantes também pode ser avaliada usando um sensor capaz de medir a ligação proteína- biotina, como um biosensor operando no princípio da ressonância de plás- 20 mons de superflcie.

Em um modo preferido da presente invenção, os tamavidins são selecionados de: (a) uma proteína constitulda de uma sequência de aminoácidos com deleção, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos na SEQ ID 25 NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e tendo atividade de ligação à biotina, ou (b) uma proteína constituída de uma sequência de aminoácido compartilhando uma identidade de 60% ou mais com a SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID"NO: 4 e tendo atividade de ligação à biotina, ou " (C) uma protelna constituída de uma sequência de amirioácido 30 daSEQIDNO:2edaSEQIDNO:4;ou - (d) uma proteína constituída de uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico hibridizável sob condições estritas, com um filamento complementar à sequência de base da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 3 e tendo atividade de ligação à biotina.

Proteína A protelna para ser fundida com os tamavidins não é particular- 5 mente limitada e exemplos incluem anticorpos, proteínas antigênicas, várias enzimas, lectinas, peptídeos ou proteína A, proteína G, proteína L etc, Anti- corpos incluem lgG, assim como fragmentos de anticorpos contendo sÍtios de ligação ao antígeno, como scFv e Fab; proteínas antigênicas incluem as proteínas derivadas de vÍrus da hepatite B ou C, HlV, influenza e outros vÍ- lO rus, proteínas derivadas de bactérias como a Helicobacter py/ori, ou marca- dores tumorais como o CEA e PSA, e hormônios sexuais.

As enzimas inclu- em: oxidorreductases como peroxidase, glicose oxidase, piranose oxidase, citocromo P-450, e catalse; enzimas de desfosforilação, tais como fosfatase alcalina; enzimas fosforiladas corno PPDK; glicosil transferases como sialil - 15 ' transferase; sintetase nucleotklica de açúcar como sintetase CMP-sialil; acila transferase; amino transferase; enzimas proteolíticas como a papaína e a trombina; nucleases, como enzimas de restrição, enzimas de decomposição do lipídio, como PLD; enzimas de decomposição do carboidrato, como a amilase, a lisozima e a l3-ga|actosidase; isomerases como mutase fosfoglice- 20 rato e glicose-6-fosfato isomerase; luciferase; DNNRNA polimerase; enzi- mas sintetizantesl hidrolisantes ATP e outras, Lectinas são protelnas de li- gação ao açúcar e incluem lectinas especlficas de monossacarídeos e lecti- nas específicas de oligossacarídeos, como exemplificadas pelas lectina es- pecífica de manose, lectina específica GalNAc, lectina específ ica de GICNAC, 25 lectina específica de fucose, e lectina específica de ácido siálico, e assim por diante.

Além disso, os peptídeos incluem, mas não estão limitados àqueles compostos de 2-100 aminoácidos, preferivelmente e àqueles 'compostos de 2-50 aminoácidos, e mais preferivelmente àqueles compostos de 2-30 ami- noácidos. . 30 P-rotelna fundida com tamavidin :

A proteína fundida com tamavidin significa as protelnas de fusão dos tamavidins e as proteínas descritas acima.

O método para fornecer a '

protelna fundida com tamavidin não é particularmente Iimitado e pode envol- ver expressão usando técnicas de engenharia genética conhecidas.

Por e- xemplo, uma codificação genética para a proteína de fusão de um tamavidin e uma proteina desejada pode ser expresso usando um sistema de expres- 5 são, tai como a E.

Co// para adquirir a protelna de fusão pretendida.

Na proteína fundida com tamavidin, um tamavidin e uma proteí- na podem ser ligados diretamente; alternativamente, eles podem ser ligados através de um ligador, preferivelmente através de um ligador de aminoáci- dos.

O comprimento deste ligador é suficiente para ser pelo menos um ami- lO noácido, preferivelmente pelo menos cinco aminoácidos, mais preferivelmen- te pelo menos seis aminoácidos.

A fim de melhorar ainda mais a força de ligação entre o tamavidin e a biotina como ligado ao carreador, o ligador pre- ferivelmente consiste em pelo menos 10 aminoácidos, mais preferivelmente em pelo menos 12 aminoácidos, ou de pelo menos 15 aminoácidos ou de - 15 pelo menos 18 aminoácidos, e ainda mais preferivelmente em pelo menos 25 aminoácidos.

Especula-se que tais ligadores também vão melhorar a ati- vidade da proteína fundida ao tamavidin.

Os aminoácidos que compõem o ligador não são particularmente limitados, mas eles consistem preferivelmen- te em repetições de aminoácidos neutros como a glicina, a serina ou a alani- 20 na.

Os exemplos incluem, mas não estão limitados a GGGGS, GGSGG, GASAG, GSGAA, GSGSA, GGGGSG, GGGSGGS, GGSGGGGS, AAA-

. AGSGAA, GGGGSGGGGSGGGGS, , GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ lO NOs: 52-62). O tamavidin pode ser ligado a qualquer lado, N-terminal ou C- 25 terminal, da proteína desejada.

Se o espaço periplásmico da E.

CO// for mais adequado do que seu citoplasma para o propósito de expressar a proteína "desejada, uma sequência líder para atingir o periplasma pode ser emprega- da.

Exemplos de tal sequência Ilder incluem, mas não estão limitados a Pel8 (Lei et al. (1987) J Bacteriol 169: 4379-4383), OmpA (Gentry-Weeks et al. 30 . (1992) J Bacteriol 174: 7729-7742). Caso desejado, um marcador para a purificação e detecção em fases posteriores pode ser ligado, por exemplo, ao C-terminal da proteína de fusão.

Exemplos de tais ma'rcadores, incl'uem um marcadór epítopo c-myc (Munro e Pelham (1986) Cell 46: 291-300) e um marcador de histidina (Ho- chuli et al. (1988) Bio/Technol 6: 1321-1325, e Smith et al. (1988) J BiO! Chem 263: 7211-7215). Se a proteína de fusão tamavidin for obtida de uma fração solú-

. vel, um extrato de protelna bruta pode ser colocado em contato com o carre- ador biotinilado a ser descrito mais tarde, apara que a proteína de fusão seja ligada ao carreador biotinilado.

Lavando de forma subsequente inteiramente o carreador, a proteína de fusão pode ser purificada e fixada ao carreador em uma etapa.

Alternativamente, uma coluna para qual um análogo da bioti- na como a iminobiotina (Hofmann et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 4666-4668) pode ser usada para purificar a proteína de fusão, que é então ligada ao carreador biotinilado.

Se a proteína de fusão for obtida de uma fração Ínsolúvel, técni- cas conhecidas são adotadas, nas quais um sal caotrópico como a ureia ou o hidrocloreto de guanidina é usado para solubilizar a proteína e, posterior- mente, a diálise ou semelhante é empregada para promover o redobramento da proteína enquanto o sal caotrópico é retirado de forma gradual (Sano e Cantor (1991) Bio/Technology 9: 1378-1381, e Sano et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1534-1538). Alternativamente, se a proteína desejada for expressa como uma forma insolúvel na E. co/i, uma proteína Iigada à maltose (Bach et al. (2001) j Mol Biol 312: 79-93), uma tioredoxina (Jurado et al. (2006) J Mol Biol 357: 49-61), uma glutationa S transferase (Tudyka e Skerra (1997) Pro- tein Sci 6: 2180-2187) ou chaperonas, conforme descrito em ldeno et al. (2004) Appl Microbiol Biotechnol 64: 99-105, podem ser coexpressas ou uma proteína de fusão triplex tendo uma chaperona adicionalmente fundida à pro- " teína fundida pode ser preparada. " A proteína de fusão pode ser expressa em ouí'ros sistemas de expressão conhecidos como células de inseto, células vegetais, células de mamíferos, células de levedura, e sistemas de expressão sem célula.

Em particular, se a proteína para a qual os tamavidins devem ser fundidos for de

.

tal tipo que ela é expressa em células vegetais, a proteina de fusão resultan- ) te é também de preferência expressa no sistema de expressão da célula vegetal. Versados na técnica podem selecionar o sistema de expressão a- dequado, considerando a natureza da proteína para qual os tamavidins vão 5 ser fundidos. Carreadores liqados à biotina "Biotina" é o nome genérico para D-[(+)—cis-hexa-hidro-2-oxo- 1H-tieno-(3,4)-imidazol-4-ácido pentanóico]. É uma das vitaminas hidrosso- lúveis classificadas no grupo da vitamina B e também chamadas de vitamina 10 B7, ou às vezes referidas como vitamina H ou coenzima R. A biotina se liga muito fortemente a avidina, uma das glicoproteínas contidas na clara do ovo, e inibe sua absorção. Assim, uma grande ingestão da clara crua é ocasio- nalmente uma causa da deficiência da biotina. "Biotina" conforme usada aqui inclui não só a biotina definida a- , 15 cima, mas também anáiogos da biotina como a iminobiotina (Hofmann como F· et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 4666-4668), a destiobiotina (Hirsch et al. (2002) Anal Biochem 308: 343-357), bem como a biocitina e o sulfóxido de biotina. Os sistemas que usam o complexo biotina-avidina são amp!a- 20 mente usados em tais campos como histoimunologia, análise de DNA, e tes- tes clínicos. O método da presente invenção para ligar as proteínas aos car- readores envolve a preparação de uma proteína de fusão tendo uma proteí- na pretendida ligada a um tamavidin e ligando essa proteína de fusão a um carreador fazendo uso de uma ligação biotina-tamavidin. De acordo com o 25 método da presente invenção, a proteína pode ser permitida a agir com mui- to mais eficiência, sem prejudicar suas funções do que quando a ligação bio- tina-avidina convencional é utilizada. Os materiais que compõem o carreador sólido incluem, mas não - estão limitado a celulose, teflon, nitrocelulose, agarose, "dextrano, quitosana, - 30 poliestireno, poliacrilamida, poliéster, policarbonato, poliamida, polipropileno, nylon, poli (difluoreto de divinilideno), látex, sÍlica, vidro, fibra de vidro, ouro, platina, prata, cobre, ferro, aço inoxidável, ferrite, pastilha de silicio, poIietile-

no, poIietilenoimina, poli (ácido lático), resinas, polissacarídeos, proteínas (por exemplo, albumina), carbono, ou combinações dos mesmos. Materiais - preferidos são aqueles que têm certa força, uma composição estável, e uma extensão pequena de ligação não-específica. 5 O carreador sólido pode assumir várias formas, que incluem, mas não se limitam a grânulos, esferas magnéticas, filmes finos, microtubos, filtros, placas, microplacas, nanotubos de carbono e chips sensores. Carrea- dores sólidos planos, tais como filmes finos e placas podem ser fornecidos com os poços, ranhuras, filtro de fundo ou algo semelhante, como conhecido 10 no campo técnico de interesse. Em um modo da presente invenção, os grânulos podem ter um diâmetro de esfera na faixa de aproximadamente 25 nm a cerca de 1 mm. Em um modo preferido, os grânulos têm um diâmetro na faixa de aproxima- damente 50 nm a cerca de 10 µm. O tamanho dos grânulos é selecionável . 15 de acordo com uma aplicação específica. Alguns esporos bacterianos têm um tamanho da ordem de cerca de 1 µm, então os grânulos preferidos para capturar tais esporos têm um diâmetro superior a 1 µm. Exemplos de microplaca biotinilada que podem ser usados in- cluem, mas não se limitam a placas de poliestireno revestidas com biotina 20 Reacti-Bind® (produto da PIERCE). Exemplos de micropartícula biotinilada que podem ser usados incluem, mas não se lim itam a partículas magnéticas, tais como biotina BIOMAG (produto da Polysciences, lnc.), nanopartículas magnéticas como a biotina D nanomag (marca registrada) e biotina sÍlica nanomag (marca registrada), ambos sendo produtos da COREFRONT 25 CORPORATION, micropartícula de poliestireno como partículas de biotina (produto da Upstate) Beadlyte (marca registrada), agaroses como a Biotina Agarose e 2-iminobiotina-agarose ambos sendo produtos da Sigma-Aldrich, '" e agaroses com alta ligação cruzada como a Biotina-Sepharose (produto da - .Ç ' Biosearch Technologies, lnc.).

- 30 Reagentes biotinilados exemplares que podem ser usados in- cluem, mas não se limitam aos seguintes produtos da PIERCE (as indica- ções em parênteses são para o comprimento do ligador e o grupo reativo

- nessa ordem): EZ-Link (marca registrada) Sulfo-NHS-Biotina (13,5 Â, amina

Z primária); EZ-Link (marca registrada) Sulfo-NHS-LC-Biotina (22,4 Â, amina primária); EZ-Link (marca registrada) Sulfo-NHS-LCLC-Biotina (30,5 Â, ami- na primária), EZ-Link (marca registrada) PFP-biotina (9,6 Â, amina); EZ-Link 5 (marca registrada) ma|eimida-PEO2-Bjotina (29,1 Â, grupo tiol); EZ-Link 0 (marca registrada) Biotina-PEO, Amina (20,4 Â, grupo carboxil); EZ-Link (marca registrada) Biotina-PEO3-LC Amina (22,9 Á, grupo carboxila); EZ- Link (marca registrada) Biotina-Hidrazida (15,7 À, grupo aldeído); EZ-Link (marca registrada) Biotina-LC-Hidrazida (24,7 À, grupo aldeído) e EZ-Link 10 (marca registrada) NHS-lminobiotina (13,5 À, amina primária). Com a ajuda de reagentes biotinilados mencionados acima, a biotina pode ser ligada aos carreadores desejados tais como microplacas, micropartículas ou chips sensores usando métodos conhecidos. Um método exemplar usa carreadores (por exemplo, partículas magnéticas, partlculas - 15 de Sepharose, partículas de agarose, partículas de látex, e placas de micro- titulação), tendo vários grupos funcionais, tais como grupo amino, grupo car- boxil, grupo tiol, grupo tosil, grupo epóxi, grupo maleimida, e ésteres ativa- dos. Se um reagente biotinilado contendo o éster NHS for usado, ele é dis- solvido em um solvente orgânico como o DMSO (dimetj|su|fóxjdo) ou uma 20 solução tampão de fosfato de pH 7-9 e, em seguida, adicionado a um carre- ador de imobilização tendo grupos amino, para que a biotina possa ser liga- da a ele. Se um reagente biotinilado contendo o grupo amino for utilizado, os grupos carboxil no carreador de imobilização são primeiro convertidos para um éster ativado com a ajuda de uma carbodiimida como hidrocloreto de (1- 25 etik3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) EDC e, posteriormente, o reagente biotinilado como dissolvido em uma solução tampão com pH próximo de 5 é adicionado ao carreador de imobilização de modo que a biotina seja ligado a ele. Observe que o carreador de imobilização biotinilado preferivelmente pe- ga grupos funcionais que não reagiram para se tornarem inativos antes de 30 serem bloqueados com BSA ou similares. - No Exemplo 3, a ser descrito posteriormente, o HEL SCFv-TM2 não foi ligado a todas as partículas magnéticas tendo um comprimento do ligador de 13,5 Â, mas 72% do HEL SCFv-TM2 foi ligado a partículas magné- -

ticas com um comprimento do ligador de 22,4 Â e 77% do HEL ScFv-TM2 foi . ligado às partículas magnéticas com um comprimento do ligador de 30,5 Á.

No exemplo 4, uma protelna de fusão do tamavidin 2 e a sialil transferase 5 mostrou ligação específica à biotina quando o comprimento do ligador era de 30,5 Â.

Então, o comprimento do ligador para Iigar o carreador à biotina é preferivelmente não inferior a 13,5 Â, mais preferivelmente em pelo menos 15 Á, de pelo menos 15,7 Â, de pelo menos 17 À, de pelo menos 20 Â, de pelo menos 20,4 À, de pelo menos 22,4 Â, de pelo menos 22,5 À, e ainda 10 mais preferivelmente em pelo menos 30,5 Â.

Método para liqar proteinas ao carreador O método da invenção compreende preparar um carreador liga- do à biotina e uma proteína fundida ao tamavidin, colocando os dois em con- tato e fazendo com que a proteína se ligue ao carreador através de ligações _ 15 tamavidin-biotina.

Carreadores de liqação A presente invenção também fornece um carreador que tem a proteína fundida ao tamavidin ligada a ele pelo método descrito acima da presente invenção para ligar as proteínas aos carreadores.

Resumidamente, 20 o carreador fornecido pela presente invenção é um carreador ligado à prote- Ína de fusão do tamavidin caracterizado em que a protelna de fusão tendo uma proteina ligada ao tamavidin é Iigada ao carreador ligado à biotina atra- vés das ligações tamavidin-biotina.

Vetores de expressão 25 O vetor de expressão para expressar a proteína fundida ao ta- mavidin contém ácidos nucleicos que codificam os tamavidins da presente . invenção.

Os ácidos nucieicos que codificam os tamavidins da presente in- venção não são particularmente Iimitados já que eles codificam as proteínas do tamavidin descritas acima na seção "tamavidins". Por exemplo, eles in- 30 cluem um ácido nucleico consistindo em na sequência de bases da SEQ ID NO: 1 ou 3, ou ácidos nucleicos que hibridizam com os filamentos comple- mentares àquelas sequências de base sob condições severas e que codifi-

cam as proteínas tendo a atividade de ligação à biotina (doravante, todos os ácidos nucleicos são coletivamente referidos "o gene tamavidin"). O gene tamavidin ainda tem, em uma ou ambas.as extremidades dele, uma sequên- cia para inserir um gene que codifica uma proteína desejada a ser fundida 5 aos tamavidins, isto é, um sÍtio de reconhecimento da enzima de restrição, ou alternativamente, uma sequência .usada no sistema Gateway (lnvitrogen) tais como aat81, aatB2 ou aat83, e é posteriormente caracterizado em um promotor que funciona em um hospedeiro desejado é fornecido a montante da unidade consistindo no gene tamavidin e a sequência para a inserção de 10 um gene que codifica a proteína desejada (como exemplificado por uma uni- dade em que a sequência de um sÍtio de restrição da enzima de restrição está presente adjacente à sequência cio gene tamavidin), enquanto que um terminador é fornecido a jusante de uma mesma unidade.

Enquanto o tipo de sÍtio de restrição da enzima de restrição não for particularmente limitado, . 15 é preferivelmente o sÍtio de reconhecimento apenas no vetor de expressão.

O número de sÍtios de reconhecimento também não é particularmente limita- do, e ele é um ou mais, mas de preferência não superior a 10. ObseNe que uma codificação da sequência do ácido nucleico para uma sequência de aminoácido do ligador consistindo em um ou mais 20 aminoácidos, preferivelmente em cinco ou mais aminoácidos, mais preferi- velmente em 10 ou mais aminoácidos, ainda mais preferivelmente em 25 ou mais aminoácidos, mas não mais do que 50 aminoácidos (embora não parti- cularmente limitado, isso pode ser uma sequência comumente usada por versados na técnica, tal como uma sequência rica em glicina ou em serina) 25 podem ser fornecidos entre o sÍtio da enzima de restrição ou da sequência AATB e da sequência do gene tamavidin e, além disso, embora não particu- larmente limitado, uma sequência tal como o Fator Xa que codifica um sÍtio de reconhecimento de protease pode também ser fornecida.

Se, no caso em que um gene do anticorpo, como SCFv ou Fab a ser inserido no vetor de ex- 30 pressão sob consideração, reduzir.as condições dentro do citoplasma não são adequadas para a expressão da proteína de fusão, uma codificação da sequência do ácido nucleico para o peptídeo líder, como exemplificado por

-

um peptídeo sinal ou um sinal de secreção, pode ser contido entre o promo- tor e a unidade consistindo no gene tamavidin e a sequência para inserir o gene da proteína desejada.

Além da unidade de expressão descrita acima, o vetor de ex- 5 pressão sob consideração pode ter uma unidade para habilitar a replicação em um hospedeiro desejado, isto é, uma origem de replicação, bem como um gene marcador da resistência ao fármaco para selecionar células hospe- deiras desejadas.

O hospedeiro não é particularmente limitado, mas é prefe- rivelmente a E. co/i.

Caso desejado, o vetor de expressão sob consideração 10 pode incorporar um sistema de controle de expressão adequado, tal como um sistema repressor de lactose na E. co/i.

Métodos para purificar proteínas As proteinas podem ser convenientemente purificadas usando o vetor de expressão descrito acima.

Primeiro, uma codificação do gene para . 15 uma proteína desejada é incorporada ao vetor descrito acima por uma técni- ca de clonagem habitual e expressada em um hospedeiro desejado.

O hos- pedeiro é preferivelmente um no qual a proteína desejada é expressa.

Se o hospedeiro for a E. co/i, uma célula de inseto, uma célula de mamífero, uma célula vegetal ou uma célula de levedura, a expressão pode ser realizada 20 por meio de cultura, e se o hospedeiro for uma planta, a proteína de fusão pode ser expressa e acumulada no corpo planta.

Subsequentemente, as células ou tecidos vivos nos quais a pro- teína de fusão tem sido expressa são rompidos em uma solução tampão adequada e a proteína é extraída.

Um carreador biotinilado é posto em con- 25 tato com o extrato da proteína obtido e usando a forte ligação entre o tama- vidin na proteína de fusão e a biotina, é formado um complexo consistindo em carreador, biotina, tamavidin, e proteína desejada.

Posteriormente, de- pendendo da natureza do carreador, se ele for uma partícula magnética, um magneto é usado, e caso contrário, a centrifugação pode ser aplicada para ' 30 recuperar o complexo referido acima e a fração no sobrenadante que não foi ligada ao carreador biotinilado é descartada.

Além disso, o complexo referido acima é lavado várias vezes com uma solução tampão adequada (que pode e conter NaCl ou semelhante a uma concentração de aproximadamente 0,5 M

V a 2 M). Finalmente, as ligações biotina-tamavidin são dissociadas por uma solução de biotina, em uma solução tampão baixo de pH (aproximadamente pH 1,5-4), ou tratamento térmico (preferivelmente a cerca de 85°C - 95"C) 5 para purificar a proteína desejada. Como descrito acima, fazendo uso da expressão de alto rendi- mento dos tamavidins em um hospedeiro, como a E. coll, a proteina de fu- são pode ser eficientemente sintetizada na célula hospedeira e, ao mesmo tempo, fazendo uso da forte ligação entre o tamavidin e a biotina, uma ope- lO ração de lavagem pode ser realizada sob condições comparativamente rigo- rosas para permitir a purificação em uma etapa da proteína fundida ao tama- vidin. Observe que, se uma sequência de reconhecimento da protease for fornecida entre um tamavidin e a protelna desejada, a proteína de fusão po- "" de ser tratada com a protease de interesse, através da qual o tamavidin é . 15 isolado para obter apenas a proteína desejada. Neste caso, após a lavãgem do complexo mencionado acima, o tratamento da protease pode ser realiza- do, então o carreador é recuperado e em seguida a purificação da proteína pode ser realizada de forma mais eficiente. Além disso, mesmo um carrea- dor tendo iminobiotina ou outro análogo da biotina ligado a ele pode ser usa- 20 do para purificar a protelna fundida ao tamavidin da mesma forma como descrito acima.

VANTAGENS DA INVENÇÃO Conforme descrito acima, o gene fundido ao tamavidin é cons- truído, um sistema de expressão adequado é usado para expressar a proteí- 25 na de fusão de interesse, e a proteina expressada é purificada e imobilizada simultaneamente usando um carreador tendo a biotina ligada à superfície, com isso produzindo um carreador tendo a protelna de fusão contendo o tamavidin Iigado a ele. Alternativamente, a proteína expressada é purificada usando um análogo da biotina e, depois, é imobilizada em um carreador ten- 30 do a biotina ligada à superfície, com isso produzindo um carreador tendo uma proteína de fusão contendo o tamavidin ligada a ele. Esses carreadores podem imobilizar as proteínas com uma força maior do que quando são i-

mobilizados pelos métodos convencionais e, além disso, os carreadores permitem que as proteínas ajam de modo eficaz sem prejudicar suas fun- ções.

BREVE DESCRIçÃO DOS DESENHOS 5 A figura 1 mostra a expressão de uma proteína de fusão do ta- mavidin 2 e um fragmento scFv de anticorpo; a E. co/i incorporando Pel8- HELscFv-TM2/pTrc99A ou PelB-HELscFv-myc/pTrc99A foi induzida para expressão e uma solução de proteina bruta foi preparada e submetida à análise de western blot. 10 O painel A mostra o resultado para o HELSCFv-TM2, e o painel B para o HELscFv-myc; S se refere à fração solúvel e lS à fração insolúvel; como o anticorpo primário, um anticorpo anti-TM2 foi usado para o HELSCFv- TM2, e um anticorpo anti-c-myc epítopo foi usado para o HELscFv-myc; co- mo o anticorpo secundário, um anticorpo marcado com a fosfatase alcalina _ 15 foi usado; frações similarmente preparadas a partir da E. co/i tendo apenas o vetor de expressão pTrc99A foram usadas como controle.

A Figura 2 mostra a expressão de uma proteína de fusão do ta- mavidin 2 e uma sialil transferase; a E. co/i incorporando o ISH224-2,6ST- linkTM2/pTrc99A foi induzida para expressão e uma solução de proteína bru- 20 ta foi preparada e submetida a SDS-PAGE, seguida de coloração CBB (A) e análise de western blot (B) (linhas 2 e 4). Um anticorpo anti-TM2 foi usado como o anticorpo primário e um anticorpo marcado com a fosfatase alcalina foi usado como o anticorpo secundário; frações similarmente preparadas a partir da E. co/i tendo apenas o vetor de expressão pTrc99A foram usadas 25 como controle (linhas 1 e 3). Bandas da proteína expressada ISH224-2,6ST- IinkTM2 são indicadas pelas setas.

A figura 3 mostra a purificação e a imobilização simplificadas de uma sialil transferase pela fusão com o tamavidin 2; uma proteína fundida ISH224-2,6ST-TM2 foi reagida com as partículas magnéticas biotiniladas e 30 purificada e imobilizada simultaneamente; para examinar o grau de purifica- ção, a proteína de fusão foi tratada com calor (fervida) ou tratada com biotina (Biotina) para ser dissociada das partículas; o painel A mostra o resultado da coloração CBB após SDS-PAGE, e o painel B o resultado da análise de wes- tern blot; pTRC refere-se a uma amostra proveniente cia E. co// tendo apenas o vetor de expressão, S a amostra antes de ligar o lSH224-2,6ST-linkTM2 às partículas, N a fração livre, W a fração lavada, e TM2 o tamavidin 2 purifica- do; X1 e X5 indicam concentrações de uma e cinco vezes respectivamente; a posição da protelna de fusão é indicada pelas setas.

A figura 4 mostra a atividade SBA de uma proteína de fusão do tamavidin 2 e da lectina (SBA); uma solução de proteína bruta foi preparada a partir de células de tabaco BY2 cultivadas na qual o SBA-lxlink-TM2 tinha sido introduzido e as frações parcialmente purificadas foram medidas para sua atividade de aglutinação das hemácias; uma fração parcialmente purifi- cada de células BY2 na qual o pSB24 tinha sido introduzido foi usada como controle.

A figura 5 mostra a purificação simplificada de uma protelna de fusão do tamavidin 2 e da lectina (SBA); a proteína fundida lectina-TM2 foi reagida com agarose D-GalNAc e purificada; o painel A mostra o resultado da coloração CBB após SDS-PAGE , e o painel B o resultado da análise de Western blot; controle refere-se a uma amostra de células BY2 transformada com o vetor pSB24; a posição da proteína de fusão é indicada pelas setas.

A figura 6 mostra a purificação simplificada de uma proteína de fusão do tamavidin 2 e uma proteína A; a proteína fundida spa-TM2 foi rea- gida com lgG sepharoseTM6 Fast Flow (produto da GE Healthcare) e purifi- cada; o painel A mostra o resultado da coloração CBB após SDS-PAGE, e o painel B o resultado da análise de Western blot usando um anticorpo lgG de coelho marcado com a fosfatase alcalina; controle refere-se a uma amostra proveniente da E. cQ/i tendo apenas o vetor de expressão, SA-7 refere-se ao spa(SA)AC-lxlink-TM2, e MW-9 refere-se ao spa(MW)AC-lxlink-TM2; a posi- ção da proteína de fusão é indicada pelas setas. [Figura 7] A figura 7 mostra um mapa do plasmídeo do TM2- lxlink-EK-MCS-His/pTrc99A. [Figura 8] A figura 8 mostra um mapa do plasmídeo do TM2- 3xlink-EM-MCS-His/pTrc99A.

[Figura 9] A figura 9 mostra um mapa do pIasmídeo do TM2- 5xlink-EM-MCS-His/pTrc99A. [Figura 10] A figura 10 mostra um mapa do plasmídeo do His- - MCS-EK-lxlink-TM2/pTrc99A. 5 [Figura 11] A figura 11 mostra um mapa do plasmídeo do His- MCS-EK-3xlink-TM2/pTrc99A. [Figura 12] A figura 12 mostra um mapa do plasmídeo do His- MCS-EK-5xIink-TM2/pTrc99A.

EXEMPLOS 10 A seguir, a presente invenção é explicada especificamente por meio de exemplos, que não pretende de maneira nenhuma Iimitar o âmbito técnico da presente invenção. Qualquer versado na técnica pode facilmente fazer modificações ou alterações à presente invenção a partir das descrições na presente especificação e elas estão incluídas no âmbito técnico da pre- _ 15 sente invenção. Exemplo 1. Proteína de fusão do tamavidin e anticorpo Neste exemplo, uma proteína de fusão do tamavidin 2 e um an- ticorpo (fragmento SCFv do anticorpo HEL) foi expressada na E. co/i e imobi- lizada em uma placa carreadora por ligação tamavidin-biotina. Além disso, a 20 atividade do anticorpo para ligação a um antígeno foi investigada. Como controle, o anticorpo foi imobilizado diretamente na placa por ligação hidro- fóbica. Uma explicação concreta é dada abaixo. 1-1. Fragmento scFv do anticorpo HEL Usando o tamavidin 2 (TM2) e um fragmento SCFV de um anti- 25 corpo (D1.3) de camundongo antilisozima da clara de ovo da galinha(HEL), uma protelna fundida tamavidin-anticorpo foi preparada. O gene do fragmen- to SCFV do anticorpo HEL (D1.3) (lba et al. (1997) Gene 194: 35-46, e ldeno ' et al. (2004) Appl Microbiol Biotechnol 64: 99-105) foi designado pelo Sr. Aki- ra ldeno da SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. .b - 30 A expressão foi realizada na E. co/i e um vetor pTrc99A não - marcado (produtos da Pharmacia) foi usado como um vetor de expressão. Para a expressão única do HELscFV, um marcador epltopo c-myc (sequên-

" cia de aminoácido: EQKLISEEDL; Munro e Pelham (1986) Cell 46: 291 300) foi introduzido no C-terminal do HELSCFV.

A proteína de fusão foi então de- . senhada de modo que o TM2 seria localizado no C-terminal do HELSCFv.

Na ocasião, o ligador (sequência de aminoácido: GGGGSG) entre o TM2 e o 5 HELSCFv foi inserido.

Além disso, para atingir a proteína fundida HELSCFv- myc e a proteína fundida HELSCFV-TM2 ao espaço periplásmico, um peptí- · deo llder Pel8 (Lei et al. (1987) j Bacteriol 169: 4379-4383) foi incorporado no n-terminal de cada uma delas. 1-1-1. Construção de um vetor para expressar a proteína de fu- lO são do tamavidin 2 e o HELscFv e um vetor para expressar o HELSCFv O gene do fragmento SCFv do anticorpo HEL (D1.3) tem uma tal estrutura que um fragmento Vh do gene é fornecido no lado 5' e um fragmen- to VL do gene no lado 3', os dois sendo ligados pela codificação do DNA pa- ra um ligador consistindo em três repetições de GIy-GIy-Gly-Gly-Ser.

Por _ 15 meio do PCR, os genes foram construídos que codificaram uma proteína de fusão (PelB-HELscFv-TM2) (SEQ ID NO: 10) tendo a sequência TM2 ligada ao C-terminal do anticorpo scFv, assim como uma proteína (PelB-HELscFv- myc) (SEQ ID NO: 9) tendo o marcador de epítopo c-myc ligado ao C- terminal do anticorpo sCFv. 20 Desenhando os primers Para construir o gene fundido PelB-HELscFv-TM2, os primers para juntar os dois genes HELSCFv e TM2 através do Iigador (GGGGSG) foram desenhados primeiro.

Especificamente, dois primers foram desenha- dos, um sendo o HELscFvlinkTM2RV que consiste da porção HELscFv no 25 lado 5', o ligador no centro, e a porção TM2 no lado 3', e os outros sendo o HELscFvlinkFVV que consiste no ligador no lado 5' e uma sequência de DNA no lado 3' codificando a porção HELscFv em uma direção inversa.

Subsequentemente, dois primers adicionais foram desenhados, ' um sendo o PêlB-HELscFv-VH-F consistido na porção 5' do gene HELSCFv e "" 30 uma sequência a montante codificando um lado de cIivagem da enzima de restrição BspH I (TCATGA) e a porção do peptídeo líder PelB, e'o outro sen- do o TM2-3' Bam, consistido na porção 3' do gene TM2 e uma sequência a jusante codificando um sÍtio de clivagem da enzima de restrição BamH I

VP (GGATCC). Além disso, para construir o gene PelB-HELscFv-myc, um inici- ador HELscFv-VL-myc-R consistido no PelB-HELscFv-VH-F identificado a- cima, a porção.3' do gene HELSCFv, e uma sequência a jusante codificando 5 o marcador do epltopo c-myc e do lado de clivagem enzima de restrição BamH I (GGATCC) foi desenhada e usada. Os primers respectivos para a construção da proteína de fusão do tamavidin e o anticorpo HELscFv são identificados na Tabela 1. [Tabela 1] 10 Tabela 1. Primers para a construção da proteína de fusão do tamavidim e anticorpo HELscFv Nome Sequência (5'-3') Comprimento PelB-HELscFv-VH-F " AAATCATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGCTTGCTGCTGCT , 15 GGCAGCTCAGC CGGCCATGGCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCA 92mer HELscFv-VL-myc-R

TTTGGATCCTTATAGATCTTCTTCTGAGATCAGC I I I I GTTCTAGGGAAA GCTTGCATGCCT 62mer 20 HELscFvlinkFW ACCGCTGCCACCGCCACCTAGGGAAAGCTTG- CATGCC 37mer HELscFvlinkTM2RV

GGCATGCAAGCTTTCCCTAGGTGGCGGTGGCAGCGGTTCAGACGWCA ATCTTCACTC 58mer 25 TM2 3'Bm I I j I ITGGATCCTTACTTCAACCTCGGTGCG 31mer O sÍtio de reconhecimento da enzima de restrição está subli- nhado. As sequências individuais correspondem a SEQ ID NOS: 11 a 15 conforme contadas a partir do topo. 'V 30 PCR _. Duas etapas do PCR foram realizadas para construir o gene PelB-HELscFv-TM2. Nas primeiras fases do PCR, a porção HELSCFv foi

Y amplificada usando os primers PelB-HELscFv-VH-F e HELscFvIinkFW, com

+ um plasmídeo incorporando o gene do fragmento do anticorpo HEL(D1.3)scFv no vetor pT7 sendo usado como um modelo, e a porção TM2 foi amplificada usando os primers HELscFvlinkTM2RV e TM2 3' Bam, com 5 um plasmídeo incorporando o gene TM2 no vetor pTrc99A (\NO02/072817) sendo usado como um modelo.

As condições de reação do PCR foram as seguintes: para uma solução de reação de 50 µL, 500 ng do DNA modelo, 25 µL de 2 x GC tampão ll (Takara), 4 µL de 2,5 mM de dNTP e 25 pmols de cada um dos primers, e 0,5 µL de 5 U/µL Pyrobest DNA polimerase (produto 10 da Takara) foram adicionados, e usando um sistema de controle modelo programado PC-500 (ASTEK), um ciclo de 96°C x 3 min, 30 ciclos de 96°C x 1min,55°Cx1mine72°Cx2min,eumciclode72"Cx6minforamreali- zados- Como resultado, um produto do PCR de 860 pb foi obtido na porção HELSCFv e outro de 450 pb foram obtidos na porção TM2. Estes produtos do _ 15 PCR foram submetidos à eletroforese de agarose em uma solução tampão TAE usando uma agarose de baixo ponto de fusão (SeaPlaqueGTG). Cada um dos fragmentos de DNA foi excluído junto com o gel e após adicionar 200 mlVl de NaCl em uma quantidade igual ao do gel, o tratamento foi reali- zado a 70°C por 10 min para fundir o gel.

A amostra resultante foi extraída 20 com fenol, fenol / clorofórmio e clorofórmio, cada extração reaiizada uma vez, e permitiu a precipitação em etanol para recuperar dois fragmentos de 'DNA, uma para a porção HELscFv e outra para a porção TM2. Com estes dois fragmentos usados como modelos, a segunda etapa de PCR foi realizada usando os primers PelB-HELscFv-VH-F e TM2 25 3'Bam.

As condições de reação foram as mesmas que na primeira fase.

Como resultado, cerca de 1300 pb do produto de PCR (fragmento do gene PelB-HELscFv-TM2) (SEQ ID NO: 7) foi obtido.

Subsequentemente," para construir o gene PelB-HELscFv-myc, o PCR foi realizado nas mesmas con- dições como descrito acima, exceto que o modelo foi um plasmldeo tendo'o 30 gene do fragmento de anticorpo HEL (D1.3) ScFv incorporado no vetor pT7 e que os primers PelB-HELscFv-VH-F e HELscFv-VL-myc-R foram usados.

Como resultado, cerca de 880 pb do produto de PCR (fragmento do gene

4'

~ PelB-HELscFv-myc) (SEQ ID NO: 6) foi obtido.

Clonaqem T O fragmento do gene PelB-HELscFv-TM2 e o fragmento do ge- ne PeIB-HELscFv-myc, ambos obtidos por PCR, foram clonados no vetor 5 pCR4 Blunt TOPO (produto da lnvitrogen). A reação de ligação foi de acordo com as. instruções contidas no kit do vetor.

O DNA foi transferido para a E.

CO// TBI por eletroporação e o DNA plasmidial foi extraído de acordo com o método habitual (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory ma- nual, 2" edição). Os clones verificados para ter inserções foram tratados da 10 seguinte forma: usando o iniciador M13 (Takara), a sequência de base do produto de PCR foi determinada de ambas as suas extremidades com um sequenciador fluorescente ABI PRISM (modelo 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer) para confirmar que não houve mutação do gene original.

O plasmí- deo incorporando os genes de interesse foi digerido em dobro com BspH I e . 15 BamH I e a purificação em gel foi realizada pelo método supracitado para recuperar um fragmento de DNA.

O fragmento de DNA recuperado foi ligado por um kit de ligação (produto da Takara) ao vetor de expressão na E. co/i pTrc99A que havia sido preliminarmente digerido com NCOI e BamH I.

O produto de ligação foi transformado na E.

CO// TBI e o DNA plasmidial foi 20 extraído e submetido à análise com enzima de restrição, de acordo com o método habitual para verificar a presença dos genes inseridos; isso levou a conclusão do PelB-HELscFv-TM2/pTrc99A, ou um vetor para expressar a proteína de fusão do tamavidin 2 e do HELscFv, bem como o PelB- HELscFv-myc/pTrc99A, ou um vetor para expressar o HELSCFv. 25 1-1-2. Expressão e purificação bruta da proteina fundida do ta- mavidin 2-HELScFv e HELSCFV Para investigar o efeito da imobilização do anticorpo sCFv em um substrato por meio de fusão ao tamavidin 2, a proteína fundida do'tama- vidin 2-HELSCFV e HELSCFv foram primeiro expressados na E. co/i e parci- 30 almente purificadas. ?

Expressão na E. co// Dois lotes da E. coli, um transformado com PelB-HELscFv-

t i TM2/pTrc99A e outro com pelB-HELscFv-myc/pTrc99A, foram inoculados : em 6 mL de meio LB contendo o antibiótico ampicilina (concentração final: 100 µg/ml) e cultivados sob agitação a 37°C até que a absorvância a OD600 atingiu 0,5. Posteriormente, 1 mM IPTG foi adicionado e outra cultura sob

5 agitação foi realizada durante a noite a 37°C.

A E. colifoi colhida de 1 mL do caldo de cultura por centrifugação e suspensa em 400 µL de uma solução tampão de 20 mM de fosfato (pH 7); posteriormente, as células foram rompi- das por sonicação.

A solução contendo as células rompidas foi centrifugada (15000 rpm) e o sobrenadante foi coletado como uma fração solúvel.

Além

10 disso, o precipitado foi suspenso em 400 µL de uma solução tampão de 20 mM de fosfato (pH 7) contendo 8 M de ureia e rompido novamente por soni- cação; o precipitado rompido foi coletado como uma fração insolúvel.

As frações solúveis e insolúveis de cada um HELscFv-TM2 e HELscFv-myc foram submetidos à análise por Western blotting.

Como o an-

. 15 ticorpo primário, um anticorpo de coelho anti-TM2 (ver "Purificação de anti- corpos de coelho anti-TM2" abaixo) foi usado para HELSCFV-TM2 e um anti- corpo de coelho anti-c-myc epítopo (produto da BETHYL) para HELSCFv- myc . Além disso, um anticorpo de coelho anti lgG marcado com fosfatase alcalina (produto da Bio-Rad) foi usado como anticorpo secundário.

Os resul-

20 tados são mostrados na figura 1. Do HELscFv-TM2 expressando a E. co/i, uma banda foi detectada nas proximidades de 40 kDa, e do HELscFv-myc expressando a E. co/i, uma banda foi detectada nas proximidades de 27 kDa.

Estes tamanhos estavam de acordo substancial com as massas mole- culares previsível das sequências de aminoácido do HELScFv-TM2 e

25 HELscFv-myc (ou seja, 43 kDa e 29 kDa respectivamente). Além disso, a proteína solubilizada representou cerca de 40% do HELSCFv-TM2 e HELscFv-myc que foram expressados na E. cO/i e a quantidade da proteína solúvel-que foi expressada por litro do caldo de cultura foi de 120 µg para o HELSCFv'TM2 e 128 µg para o HELscFv-myc.

As sequências de aminoácido

30 do HELSCFv-TM2 e do HELscFv-myc são representadas pela SEQ ID NOs: 10 e 9 respectivamente.

Purificação dos anticorpos de coelho anti-TM2

" A proteína do tamavidin 2 (TM2) expressada na E. co/i foi purifi- e.

W " cada em uma coluna de iminobiotina (tamavidin 2 era um tetrâmero) para fazer um antígeno; para fazer um outro antígeno, o TM2 purificado foi sub- metido a eletroforese SDS-PAGE e posteriormente extirpado do gel e purifi- 5 cado (tamavidin 2 era um monômero); os coelhos foram imunizados com esses antlgenos para preparar dois tipos de anticorpos. O limite de detecção de qualquer tipo de antígeno pelo método de Western utilizando o anticorpo anti-lgG marcado com a fosfatase alcalina foi de aproximadamente 0,5 ng para um espécime do tamavidin 2 recombinante purificado. Desse resultado, 10 concluiu-se que os anticorpos que eram altos em especificidade e título ti- nham sido completados. ObseNe que a reação cruzada entre o anticorpo anti-tamavidin 2 e tamavidin 1 foi detectada, embora em nível baixo (cerca de 1/20 do nível para o antígeno inerente). O anticorpo anti-TM2 (como preparado do antlgeno purificado _ 15 apenas por meio da coluna de iminobiotina) foi posteriormente purificado como descrito abaixo. O TM2 (40 µg) foi separado por SDS-PAGE usando duas folhas de 15% do gel de acrilamida e a proteína foi transferida para duas membranas de nitrocelulose (81o-Rad). O bloqueio foi realizado por agitação das membranas em uma solução tampão TBS contendo BSA em 20 temperatura ambiente por uma hora. Subsequentemente, o TM2 reagiu du- rante a noite em temperatura ambiente com o anticorpo anti-TM2 (como pre- - parado do antígeno purificado apenas por meio da coIuna de iminobiotina; diluído 1000 vezes) e, posteriormente, os sítios para os quais o TM2 haviam sido transferidos foram excluídos e agitados em uma solução tampão de elu- 25 ição (0,2 M de glicina, 1 mM de EDTA, pH 2,8) à temperatura ambiente por 20 min para eluição dos anticorpos para fora das membranas. Os anticorpos purificados foram neutralizados numa solucão 1 M Tris, cujo volume foi de » um-·décimo do volurne da solução tampão de eluição; depois, a mesma -quantidade de uma solução tampão de 10 x TBS foi adicionado para o ar- 30 mazenamento a 4°C. . Atividade de liqação do antíqeno das proteínas expressadas As duas proteínas, HELScFv-TM2 e HELscFv-Myc, que haviam sido expressas na E. co/i foram averiguadas quanto aos seus títulos de anti- corpo contra uma lisozima da clara de ovo da galinha(HEL) como descrito abaixo.

Uma lisozima da clara de ovo da galinha (50 µg/mL, produto da SEl- KAGAKU CORPORATION) foi carregada em uma microplaca em alíquotas 5 de 100 µ1 e deixada em repouso durante a noite a 4°C até ter se transforma- . do em uma fase sólida.

Os poços foram lavados três vezes com 250 µ1 de uma solução tampão TBS (10 mM Tris (pH 7,4) e 150 mM de NaCl) conten- do 0,1% de Tween20 (TTBS) e, posteriormente, 250 µ1 de 0,5% BSA con- tendo TTBS foram adicionados e a mistura foi deixada em repouso em tem- IO peratura ambiente por uma hora para com isso realizar o bloqueio; outra la- vagem com 250 µ1 de TTBS foi realizada três vezes.

Em uma etapa separa- da, um protocolo de choque osmótico (Ausubel et al., 1989) foi seguido para preparar uma fração periplasmática das células da E. cO// na qual o HELSCFv-TM2 ou o HELscFv-myc foram expressados.

Uma diiuição de 10 , 15 vezes da fração foi colocada na placa supracitada com HEL imobilizado e a reação foi realizada em temperatura ambiente por 3 horas.

Para uso em um teste controle, uma fração periplasmática também foi preparada a partir da E. co/i na qual apenas o vetor pTrc99A tinha sido incorporado.

Depois de carregar as respectivas frações periplasmáticas, as 20 pIacas foram lavadas três vezes com 250 µ1 de TTBS; depois, o anticorpo de coelho anti-TM2 (para HELscFv-TM2) e anticorpo de coelho anti-c-myc epí-

- topo (produto de BETHYL; para HELscFv-myc) foram diluídos 1000 vezes, com 0,5°'o de BSA contendo TTBS e 100 µ1 de cada diluição foi carregada nas placas, que foram deixadas em repouso em temperatura ambiente por 25 uma hora para a realização da reação.

Após três lavagens adicionais com 250 µ1 de TTBS, 100 µ1 de um anticorpo de coelho anti lgG marcado com -fosfatase alcalina (produto da BIO-RAD) que havia sido diluído 1.000 vezes com 0,5% de BSA contendo TTBS foi carregado nas placas, que foram submetidas a reação em temperatura arnbiente por Uma ho'ía.

Após mais 30 três lavagens com 250 µ1 de TTBS, 100 µ1 de 1-Step"PNPP (produto de Pl- ERCE) foi carregado nas placas para a formação de cor que continuou por 30 minutos em temperatura ambiente.

A reação foi interrompida pela adição de 100 µ1 de 2N de NaOH e a absorbância a 405 nm foi medida. por uma placa leitora lnfinite M200 (produto de TECAN). Como resultado, o HELScFv-TM2 contendo a fração e o HELscFv-myc contendo a fração, cada um sendo diluído 10' vezes de 100, 5 viu um aumento significativo da titulação de anticorpos no extrato da E. co/i

. na qual só o vetor pTrc99A tinha sido incorporado.

Purificação bruta No lugar seguinte, a cromatografia em coluna foi conduzida para obter a purificação bruta do HELSCFv-TM2 e do HELscFv-myc das frações 10 soIúveis cada obtida de 300 mL do caldo de cultura.

As células obtidas de 300 mL do caldo de cultura foram suspensas em 18 mL de uma solução tampão de 50 mM Tris (pH 8) contendo 50 mM de NaCl e, posteriormente, rompidas por sonicação.

A solução contendo as células rompidas foi centri- ' fugada (9.000 rpm) e 75°'o de sulfato de amônio saturado foi adicionado ao , 15 sobrenadante; o precipitado resultante foi dialisado durante a noite em uma solução tampão de 50 mM Tris (pH 9) contendo 50 mM de NaCl para fazer uma amostra da proteína bruta.

A amostra foi carregada em uma coluna de troca iônica MonoQ HR1O/1O (produto da Amersham-Pharmacia). Depois de equilibrar a coluna com uma solução tampão de 50 mM Tris (pH 9) contendo 20 50 mM de NaCl, a amostra foi aplicada e a eluição foi conduzida com uma solução tampão de 50 mlVl Tris (pH 9) contendo 50 mM de NaCl.

A taxa de fluxo foi estabelecida em 3 mljmin e a proteina foi recuperada nas alíquotas de 1-mL.

As proteínas purificadas foram verificadas pela análise de western blotting da mesma forma como descrito acima.

Seis frações em que a banda 25 do HELSCFv-TM2 ou do HELscFv-myc foram detectadas foram recuperadas e 75% de sulfato de amônio saturado foi adicionado ao precipitar a proteína " de interesse.

O precipitado foi re-suspenso em 500 µL de uma solução tam- · pão de 20 mM de fosfato (pH 7) e dialisado durante a noite na mesma solu- "ção tampão.

Essa série de operações permitiu que o HELscFv-TM2 e o .30 HELscFv-rhyc fossem recuperados em quantidades respectivas'de 1,5 µg e 6,3 µg- O rendimento da recuperação foi de 4% para o HELSCFv-TM2 e 16% para q HELscFv-Myc; o grau de purificação foi de cerca de 1O°/, para ambos o HELScFv-TM2 e o HELscFv-myc.

Como um controle para análise ELISA para ser realizada poste- riormente, a E. coli incorporando apenas o vetor pTrc99A foi submetida à indução de expressão da mesma forma como descrito acima para preparar 5 uma fração solúvel, que foi purificada por MonoQ; as frações eluindo ao mesmo tempo como HELSCFv-TM2 e HELscFv-myc (seis frações para cada proteína) foram recuperadas; as frações foram precipitadas pelo tratamento com sulfato de amônio e dialisadas da mesma forma como descrito acima para preparar amostras controle. 10 1-1-3. lmobilização da proteína fundida do tamavidin 2-HELSCFv e HELSCFv, e análises comparativas das suas atividades por ELISA Para investigar o efeito da imobilização do anticorpo ScFv em um substrato por meio de fusão ao tamavidin 2, a proteína fundida do tama- vidin 2-HELscFv (HELSCFV-TM2) preparada em 1-1-2 e o controle HELscFv- , 15 myc foram imobilizados em microplacas e submetidos à análise ELISA, com a sensibilidade de detecção da lisozima da clara de ovo sendo usada como um Índice.

Purificação de anticorpos Antes da análise ELISA, os anticorpos antilisozima a serem utili- 20 zados nessa análise foram primeiro purificados.

Uma lisozima da clara de ovo (40 µg) foi separada por SDS-PAGE usando duas folhas de 15% de gel de acrilamida e a proteína foi transferida para duas membranas de nitrocelu- iose (produto da B1O-RAD). As membranas foram submetidas ao bloqueio em uma solução tampão TBS contendo 3% de BSA (10 mM Tris (pH 7,4) e 25 150 mM de NaCl), em temperatura ambiente durante uma hora.

Subsequen- temente, a reação foi realizada durante a noite em temperatura ambiente com um anticorpo de coelho antilisozima da cIara de ovo da galinha (produto -' de Rockland) que havia sido diluída 1.000 vezes, com uma solução tampão "-- TBS contendo 3°/, de BSA e, depois, os sÍtios para os quais a lisozima da

.. 30 clara de ovo tinham sido transferidos foram excluídos e agitados de uma so- lução tampão de eluição (0,2 M de glicina, 1 mM de EDTA, pH 2,8), em tem- peratura ambiente por 20 min para eluição dos antico.rpQs. .Os anticorpos eluídos foram neutralizados com uma solução de 1 M Tris, cujo volume foi um décimo do volume da solução tampão de eluição; depois, a mesma quantidade de uma solução tampão de 10 x TBS foi adicionada para o ar- mazenamento a 4°C. 5 Análise ELISA A análise ELISA foi subsequentemente realizada.

O HELSCFv- TM2 e o HELscFv-myc parcialmente purificados foram condicionados cada um com solução tampão de 20 mlVl de fosfato (pH 7) para dar uma concen- tração de 3 µg/mL e cada preparação foi carregada em uma microplaca de 10 96 poços em alíquotas de 50 µL.

A placa biotinilada (Modelo n° 15.151, pro- duto de PIERCE) foi usado para o HELscFv-TM2 e uma placa hidrofóbica (Modelo n° 2592; produto da Corning) foi usada para o HELscFv-myc; as respectivas placas foram deixadas em repouso durante a noite em tempera- tura ambiente para realizar a imobilização de proteínas pela ligação tamavi- , 15 din-biotina no primeiro caso, e pela ligação hidrofóbica no último caso.

Pos- teriormente, os poços individuais em cada placa foram lavados três vezes com um 0,1% de Tween 20 con'tendo soIução tampão TBS (TTBS); então 0,5% de BSA contendo TTBS foi adicionado em uma quantidade de 300 µL e a mistura foi deixada em repouso em temperatura ambiente por uma hora 20 para realizar o bloqueio.

Depois de realizar outra lavagem 3 vezes com TTBS, as soluções de lisozima diluídas com TTBS de 50 ng/µL a 5 pg/µL foram carregadas em alíquotas 50 µL.

Depois de deixar as placas em repou- so em temperatura ambiente por uma hora a firn de realizar uma reação com o HELSCFv-TM2 ou o HELscFv-myc imobilizados nelas, as placas foram Ia- 25 vadas três vezes com TTBS.

Subsequentemente, para a detecção de Iisozima, uma solução preparada adicionando 5.040 µL de 0,5% BSA contendo TTBS a 960 µL da

" lisozima de coelho anticlara do ovo de galinha que havia sido purificada co- ^ mo descrito anteriormente foi colocada sobre as placas em uma quantidade 30 de 50 µL e a reação foi realizada em temperatura ambiente por uma hora; depois disso, as placas foram lavadas três vezes com TTBS e, subsequen- temente, uma reação com um anticorpo anti-coelho marcado com fosfatase alcalina (produto da BIO-RAD) que havia sido diluida 1.000 vezes com 0,5% de BSA contendo TTBS foi realizada em temperatura ambiente por uma ho- ra.

Após mais três lavagens com TTBS, 50 µL de l-Step" PNPP (produto de

PIERCE) foi carregado nas placas; quando uma formação da cor foi reco- 5 nhecida como tendo ocorrido, 50 µL de 2 N de NaOH foi adicionado para interromper a reação e a absorbância a 405 nm foi medida por uma placa . leitora lnfinite M200 (produto de TECAN). Os valores dos dados aplicáveis foram obtidos pelo seguinte procedimento: em cada uma das faixas de con- centração do HELscFv-TM2 e do HELscFv-myc, a concentração relevante 10 de cada amostra controle para o HELSCFv-TM2 e o HELscFv-myc (a fração MonoQ preparada da E. co/i tendo um vetor de expressão vazio, tal como descrito acima) também foi medido e o valor de absorbância para aquele controle foi subtraído da absorbância para cada uma das faixas de concen- tração do HELSCFv-TM2 e do HELscFv-myc. . 15 Como resultado, a placa contendo o HELscFv-TM2-imobilizado através da ligação tamavidin-biotina teve uma sensibilidacle de detecção maior da lisozima do que a placa contendo HELscFv-myc renderizada em uma fase sólida, por ligação hidrofóbica.

Em outras palavras, constatou-se que preparando uma proteína de fusão do anticorpo scFv e do tamavidin e, 20 em seguida, ligando-os a um substrato biotinilado permitiu uma sensibilidade de detecção maior a ser alcançada do que quando o SCFv foi imobilizado em um substrato por ligação hidrofóbica.

Análise da atividade de liqação à biotina da proteína de fusão do tamavidin 2 e do HELSCFV 25 O Biacore 3000 (produto da BIACORE) foi usado para analisar a capacidade de ligação da biotina da proteina fundida HELSCFv-TM2. A HELscFv-TM2 secretada no meio de um caldo de cultura foi parcialmente

" purificada por coluna cromatografia e as frações resultantes foram usadas " como as amostras a serem analisadas.

Para ser mais específico, o filamento 30 da E.

Co// TBI foi transformada com PelB-HELscFV-TM2/pTrc99A para a expressão da proteína e a proteína contida no médio foi precipitada com 75% de sulfato de amônio saturado.

O precipitado resultante foi dialisado durante a noite em uma so- lução tampão de 50 mM Tris (pH 9) contendo 50 mM de NaCl e carregado em uma coluna de troca iônica MonoQ HR5/5 (produto da Amersham- Pharmacia). A solução tampão de equihbrio foi uma solução tampão de 50 5 mM Tris (pH 9) contendo 50 mM de NaCl e a solução tampão de eluição foi uma solução tampão de 50 mM Tris (pH 9) contendo 500 mM de NaCl; u- sando estas soluções, a proteina foi recuperada em alíquotas de 0,5 ml a uma taxa de fluxo de 1 mljmin.

Os frações eluídas foram submetidas a SDS-PAGE e, em seguida, para o western blotting usando o anticorpo anti- lO TM2, para assim detectar frações contendo a proteína de fusão; ainda, do nível do sinal derivado da proteína de fusão, a quantidade de HELsCFV-TM2 foi computada e utilizada na análise Biacore.

O grau de purificação foi de aproximadamente 20%. Em um chip sensor CM5 (produto da Biacore), uma -" albumina de soro bovino (BSA) biotinilado com o EZ-Link (marca registrada) . 15 NHS-LCLC-Biotina (30,5 Â) (produto de PIERCE; o valor entre parênteses representa o comprimento do ligador entre biotina e o NHS) foi fixado pelo método de acoplamento com aminas.

Usando HBS-EP (produto da Biacore) como a solução tampão de corrida, o HELSCFV-TM2 foi injetado a uma taxa de fluxo de 20 µl/min em alíquotas de 40 µ1 (2 min). Do sensorgrama resul- 20 tante, a taxa constante de ligação (ka), a taxa constante de dissociação (kd) e a constante de dissociação (KD) foram computadas com o auxílio do soft- ware de análise Biaevaluation versão 4.1. O resultado é mostrado na Tabela 2. Como foi constatado, o HELSCFv-TM2 interagiu com a biotina especificamente e tinha um KD muito 25 baixo na ordem de 10"', indicando a sua forte ligação à biotina. [Tabela 2] Tablela 2 m'. Nome da amostra Ka Kd KD " HELSCFv-TM2 2,7 x 10' 1,4X1O"'5,3x1O"' 30 Exemplo 2. Proteína de fusão do tamavidin e da enzima

. Neste exemplo, uma proteína de fusão do tamavidin 2 e uma enzima (a2,6 sialil transferase) foi expressada na E. co/i e imobilizada em partículas magnéticas carreadoras por ligação tamavidin-biotina.

Além disso, a atividade enzimática da proteína de fusão foi investigada.

Como controle, a enzima foi imobilizada nas partículas por ligação covalente.

Uma explicação concreta é dada abaixo. 5 2-1. Proteína fundida da glicosil transferase Como um exemplo da proteína fundida tamavidin-enzima, o ta- mavidin 2 (TM2) e uma sialil transferase, ou seja, uma espécie de glicosil transferase, foram usados.

Como a sialil transferase, a |3-galactoside-a2,6- sialil transferase derivada de uma bactéria do gênero Photobacterium 10 (PCT/JP2006/304993) foi usada.

Observe que uma codificação genética pa- ra um tipo de proteína que tinha os aminoácidos na porção deletada do pep- tídeo sinal (ISH224-2,6STN1CO,PCT/JP2006/304993) foi usada como o ge- ne da sialil transferase. ' 2-1-1, A construção de vetores para expressar as proteínas de fusão do ta- 15 mavidin 2 e da sialil transferase Desenhando os primers Para construir os três ácidos nucleicos seguintes por PCR, ou seja, um ácido nucleico (ISH224-2,6ST-linkTM2) que codifica uma proteína consistindo no tamavidin 2 fundido a |SH224-2,6STN1C0 através de um li- 20 gador (GGGGSG), um ácido nucleico (lSH224-2,6ST-3XlinkTM2) que codifi- ca uma proteína com a junção feita por um ligador de 15 aminoácidos con- sistindo em três repetições de GGGGS, e um ácido nucleico (ISH224-2,6ST- 5XlinkTM2) que codifica uma protelna com a junção feita por um ligador de 25 aminoácidos consistindo em cinco repetições de GGGGS, três primers 25 foram desenhados, ou seja, um iniciador para unir os dois genes ISH224- 2,6ST e TM2 através de GGGGSG, e um iniciador para uni-los através de 15 aminoácidos consistindo em três repetições de GGGGS e um iniciador para uni-los através de 25 aminoácidos consistindo em cinco repetições de . GGGGS, foram desenhados.

Especificamente, três primers foram desenha-

· 30 dos, ou seja, 224-26ST-linkTM2RV, 224-26ST-3XlinkTM2RV, e 224-26st- 5XlinkTM2RV que cada consistia na porção ISH224-2,6ST do lado 5', o liga- dor no centro, e a porção TM2 no lado 3', além disso, outro iniciador 224-

Z6ST-|inkF\N fo'i desenhado consistindo no ligador no lado 5' e uma sequên- cia de DNA no lado 3' codificando a porção 1ST224-2,6ST em uma direção inversa. Observe que, para a clonagem da porção IST224-2,6ST, um inicia- dor 224-26ST- Nl-Pcil (PCT/JP2006/304993) tendo uma porção codificando 5 o N-terminal do mesmo gene, com o peptldeo sinal excluído, e uma sequên- cia de codificação a montante para um sÍtio de reconhecimento da enzima de restrição Pcil foi usada. Os respectivos primers para a construção da pro- teína de fusão do tamavidin e da sialil transferase são identificados na Tabe- la 3. 10 [Tabela 3] Tabela 3. Primers para a construção da proteína de fusão do tamavidin e da sialil transferase Nome Sequência (5'-3') ComDrimento ' 224-26ST-N1-PCÍI CTTGTAACATGTCAGAAGAAMTACACAATC 31 mer . 15 224-26ST-linkTM2RV

CAGGTGTTTGTATTGCAGTCGGTGGCGGTGGCAGCGGTTCAGACGWC AATCTTCACTC 59mer 224-26ST-3XlinkTM2FW

GGTGTTTGTATTGCAGTCGGTGGCGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAG 20 CGGTGGCGGTGGC AGCTCAGACGTTCAATCTTCA 81mer 224-26ST-linkFW ACCGCTGCCACCGCCACCGACTGCAATACAAA- CACCTG 38mer 224-26ST-5XlinkTM2RV 25 CAGGTGTTTGTATTGCAGTCGGTGGCGGTGGCAGCGGTGGCGGTGG

AGCGGTGGCGGTGGCAG

CGGTGGCGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCTCAGACGTTCAATCT CACTC 116mer TM2 3' Bam I i l I ITGGATCCTTACTTCAACCTCGGTGCG 30 31mer As sequências individuais correspondem a SEQ ID NOS: 16-17, 23, 18 e 21-22 contados a partir do topo.

PCR O PCR de duas etapas foi realizado para construir uma codifica- ção de ácido nucleico para a proteína fundida ISH224-2,6ST-TM2 (o ácido nucleico é doravante referido como "gene fundido ISH224-2,6ST-TM2"). Na 5 primeira etapa do PCR, a porção ISH224-2,6ST foi amplificada usando os primers 224-26ST-NI-Pc1I e 224-26ST-linkFW, com um plasmídeo incorpo- rando o gene do ISH224-2,6STN1CO ao vetor pTrc99A (ver PCT/JP2006/304993) sendo usado como um modelo, e a porção TM2 foi amplificada com os primers 224-26ST-linkTM2RV e TM2 3' Bam (como des- IO crito acima), ou 224-26ST-3XlinkTM2FW e TM2 3' Bam, ou mesmo 224- 26ST-5XlinkTM2RV e TM2 3' Bam, com um pIasmídeo incorporando ao ge- ne TM2 ao vetor pTrc99A (ver WO 02/072817) a ser utilizado como um mo- delo. As condições de reação do PCR foram as seguintes: para uma

N 15 solução de reação de 50 µL, 500 ng do DNA modelo, 5 µL de tampão 10 x " Pyrobest ll (Takara), 4 µ.L de 2,5 mM de dNTP, 50 pmols de cada um dos primers, e 0,5 µL de 5 U/µL Pyrobest DNA polimerase (produto da Takara) foram adicionados, e usando um sistema de controle modelo programado PC-700 (ASTEK), um ciclo de 96°C x 3 min, 10 ciclos de 96°C x 1 min, 55°C 20 x 1 min e 72°C x 2 min, e um ciclo de 72°C x 6 min foram realizados. Como resultado, um produto do PCR de 1530 pb foi obtido na porção ISH224- 2,6ST e outro de 420 pb foi obtido na porção TM2. Estes produtos do PCR foram submetidos à eletroforese de agarose em solução tampão TAE usan- do uma agarose de baixo ponto de fusão (SeaPlaqueGTG). 25 Cada um dos fragmentos de DNA foi excluído junto com o gel e após adicionar 200 mM de NaCl em uma quantidade igual ao do gel, o tra- tamento foi conduzido a 70°C por 10 min para fundir o gel. A amostra resul- tante foi extraída com fenol, fenol / clorofórmio e clorofórmio, cada extração realizada uma vez, e permitiu a pre"cipitação em etanol para recuperar dois 30 fragmentos de DNA, um para a porção scFv e outro para a porção TM2. Com estes dois fragmentos usados como modelos, a segunda etapa do PCR foi realizada utilizando os primers 224-26ST-NL-PC1I e TM2 3'Bam. As condi-

ções de reação foram as mesmas que na primeira fase.

Como resultado, cerca de 1950 pb do produto do PCR (lSH224-2,6ST-linkTM2) (SEQ ID NO: 5), cerca de 1970 pb do produto do PCR (ISH224-2, 6ST-3XiinkTM2) (SEQ ID NO: 24) e mesmo cerca de 1990 pb do produto do PCR (ISH224-2, 6ST- 5 5XlinkTM2) (SEQ ID NO: 19) foram obtidos.

Da 1" a 1.494" base na SEQ ID NO: 5 corresponde ao ISH224-2,6ST, enquanto que da 1513" a 1935" cor- responde ao TM2. Da 1" a 1494" base em SEQ ID NO: 24 corresponde ao ISH224-2,6 ST enquanto que da 1540" a 1962" base corresponde ao TM2. Além disso, da 1" a 1494" base em SEQ ID NO: 19 corresponde ao ISH224- 10 2,6ST enqaunto que da 1570" a 1992" base corresponde ao TM2. Clonaqem O gene fundido ISH224-2.6ST-TM2 obtido por PCR foi clonado no vetor pCR4 Blunt Topo (produto da lnvitrogen). A reação de Iigação foi em conformidade com as instruções do kit de vetor.

O DNA foi transferido na , 15 E. co/i TBI por eletroporação e o DNA plasmidial foi extraído de acordo com o método habitual (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2' edição). Os cIones averiguados quanto às inserções foram trata- dos da seguinte forma: usando o iniciador M13 (Takara), um iniciador de se- quenciamento (5'- I Í I I i I GGA TCC CTA GAC TGC AAT ACA AAC ACC- 20 3'), e outro iniciador de sequenciamento 2 (5'- GCC CAT ACA GTC GTA CCT GTA A-3'), a sequência de base do produto do PCR foi determinada de ambas de suas extremidades com um sequenciador de fluorescência ABI PRISM (Modelo 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer) para confirmar que não tinha nenhuma mutação do gene original.

O plasmídeo incorporando de ge- 25 nes de interesse foi digerido duas vezes com Pcil e BamH I e a purificação do gel foi realizada pelo método referido acima para recuperar um fragmento de DNA.

O fragmento de DNA recuperado foi ligado por um kit de ligação (produto da Takara) ao vetor de expressão pTrc99A na E. co/i que havia sido preliminarmente digerido com Ncol e BamH I.

O produto de ligação foi trans- 30 formado na E.

CO// TBI e o DNA pIasmidial foi extraldo e submetido a análise por enzimas de restrição, de acordo com o método habitual para verificar a presença dos genes inseridos; isto levou ao término do ISH224-2,6ST-

linkTM2/pTrc99A, ISH224-2,6ST-3XlinkTM2/pTrc99A e ISH224-2,6ST- 5XlinkTM2/pTrc99A como vetores para expressar a proteina de fusão do tamavidin 2 e da sialil transferase. 2-1 -2. Expressão da proteína fundida tamavidin2-glicosil transfe- 5 rase na E. co/i Para investigar o aumento da sensibilidade em função da imobi- lização e orientação da glicosil transferase em um substrato por meio de fu- são do tamavidin 2, a proteína fundida do tamavidin 2 glicosil transferase foi expressa na E, co/i. 10 Expressão na E. co/i Três lotes do filamento TBI da E. co/i, um transformado com ISH224-2,6ST-linkTM2/pTrc99A, outro com ISH224-2,6ST- 3XlinkTM2/pTrc99A e o outro com ISH224-2,6ST-5XlinkTM2/pTrc99A foram inoculados em um meio de caldo Luria (LB) contendo o antibiótico ampicilina , 15 (concentração final: 100 µg/ml) e a cultura agitada a 30° C até A600 = 0,5 foi alcançado.

Após isso, 1 mM de isopropil-l -tio-b-D- galactopiranosldeo (IPTG) foi adicionado e a cultura agitada foi realizada durante a noite a 30°C.

A E. colifoi colhida de 1 ml do caldo de cultura por centrifugação e suspensa em 400 µ1 da solução tampão 81sTris 20 mM (pH 6,0); depois, as células fo- 20 ram rompidas por sonicação.

A solução contendo as células rompidas foi centrifugada (15000 rpm) e o sobrenadante resultante foi coIetado como um extrato bruto.

Os extratos brutos assim obtidos foram submetidos a SDS- eletroforese de poliacrilamida (SDS-PAGE) e manchado com Coomassie 25 Azul Brilhante (CBB). Como resultado, em todos os extratos brutos, uma banda que não foi encontrada na E. co/i transformada apenas com pTrc99A foi detectada em uma posição de cerca de 70 kDa.

Os resultados para I- SH224-2,6ST-linkTM2 são· mostrados na figura 2A.

Como a massa molecu- Iar dp ISH224-2,6ST NlCO é cerca de 55 kDa e do tamavidin 2 é de cerca 30 de 15 kDa, a massa molecular da proteína fundida ISH224-2,6ST-TM2 pres- supõe-se ser cerca de 70 kDa, então é de tamanho substancialmente igual \

ao valor teórico; uma verificação foi feita por análise western blotting e banda de interesse foi detectada especificamente para o anticorpo anti-TM2 (des- crito acima). Os resultados para lSH224-2,6ST-linkTM2 são mostrados na figura 2B.

O nível de expressão da proteína de fusão foi estimado ser cerca . de 80 mg/L de cultura.

A partir deste foi confirmada alta expressão de rendi- 5 mento da proteína fundida ISH224-2,6ST-TM2 na E. co/i.

A sequência de aminoácidos desta proteína é retratada em SEQ ID NO: 8. . A atividade de transferência da sialil do extrato da proteína bruta descrita acima foi medida de acordo com uma versão modificada do método descrito no Yamamoto et al. (1996) J.

Biochem 120: 104-110; a atividade 10 específica da protelna fundida lSH224-2,6ST-linkTM2 para a transferência da sialil foi computada para ter 9,8 U/mg de proteína.

Falando da proteína ISH224-2,6ST NlCO para ser usada como controle, ela foi expressada e purificada pelo método descrito em uma paten- te (PCT/JP2006/304993), desde que a enzima purificada foi finalmente diali- . 15 sada durante a noite em solução tampão de 50 mM MES (pH 5,0) a 4°C.

A - atividade da sialil transferase foi medida e o resultado foi de 9,3 U/mg de proteína.

Posteriormente, as atividades de ligação da biotina fluorescente dos extratos da proteína bruta do ISH224-2,6ST-TM2, ISH224-2,6ST- 20 3XlinkTM2 e lSH224-2,6ST-5XlinkTM2 foram medidos pelo método a seguir para verificar as atividades de ligação à biotina dessas proteínas de fusão.

Especificamente, a medição da atividade de Iigação à biotina conduzida de acordo com o método de Kada et al. (Biochim.

Biophys.

Acta., 1427: 33-43 (1999)). O extrato da proteína bruta do ISH224-2,6ST-TM2, |- 25 SH224-2,6ST-3XlinkTM2, ou lSH224-2,6ST-5XlinkTM2 foi tão condicionado que estaria contido em concentrações de série em 200 µL de um tampão de ensaio (50 mM de NaH,PO,, 100 mM de NaCl e 1 mM de EDTA (pH 7,5)). A solução resultante foi misturada com uma solução de biotina fluorescente de ' 20 pniol/µL (biotina-4-fluoresceÍna: Sonda Molecular), em uma quantidade " 30 de 50 µL (1 nmol) e.a mistura foi deixada em repouso em temperatura ambi- -· 4 ente por 10 min, seguida pela medição da intensidade da fluorescência por uma placa leitora lnfinite M200 (produto de TECAN). Como resultado, os extratos da proteína bruta de ISH224-2,6ST-TM2, lSH224-2,6ST-3XlinkTM2 e lSH224-2,6ST-5XlinkTM2 demonstrou ter altas atividades de ligação da biotina fluorescente. Por outro lado, nenhuma atividade de ligação à biotina foi detec- 5 tada no extrato da proteína bruta preparada a partir da E. CO// tendo apenas pTrc99A e usado como controle. A partir do exposto, ficou claro que a prote7 Ína fundida ISH224-2,6ST-TM2 tinha tanto a atividade de ligação à biotina quanto a sialil transferase. 2-1-3. Purificação simplificada da proteína de fusão do tamavidin 10 2 e da glicosil transferase por meio do carreador fase sólido da biotina e sua imobilização no carreador Para investigar o efeito da imobilização da proteína em um substrato utilizando a fusão ao tamavidin 2, a proteína de fusão do tamavidin 2 e a glicosil transferase e foram submetidas a purificação simplificada e a , 15 imobilização por um carreador de fase sólida da biotina. Liqação da proteína fundida ISH224-2,6ST-TM2 às partículas lííEFW' W

F Quatrocentos microlitros de partículas magnéticas biotinilado (BIOMAG Biotina, produto da Polysciences lnc.; o comprimento do ligador 20 entre a biotina e uma partícula magnética foi de 22,4 À) foram lavados com 400 µ1 de uma solução tampão de 20 mM 81sTris (pH 6,0). Às partículas magnéticas biotiniladas, um extrato da E. Co/i transformado com o gene fun- dido lSH224-2,6ST-linkTM2 (veja acima) foi adicionado e a mistura foi incu- bada sob agitação a 4°C por 2 horas, por meio do qual o ÍSH224-2,6ST- 25 linkTM2 foi ligado às partículas magnéticas por ligação tamavidin-biotina. As partículas magnéticas foram recuperadas por um magneto (Adem-Mag SV, produto da Ademtech SA) e após a remoção do sobrenadante (fração Iivre), " as partículas magnéticas foram lavadas duas vezes com 400 µ1 de uma so- lução tampão de 20 mM Tris (pH 6,0) contendo 1 M de cloreto sódio. Poste- "' 30 riormente, as partículas magnéticos foram suspensas em 400 µ1 de uma SOt ' lução tampão de 20 mM Tris (pH 6,0) para completar as partículas magnéti- ca ISH224-2,6ST-TM2 ou partículas magnéticas para as quais a proteína fundida foi ligada através da ligação tamavidin-biotina.

Liçjando o ISH224-2,6ST NlCO às partículas magnéticas Duzentos microlitros de esferas magnéticas revestidas com gru- pos carboxil em suas superfícies (ácido carboxílico Dynabeads M-270, pro- duto da Dynal) foram lavados com 200 µ1 de 0,01 N de hidróxido de sódio por 10 minutos, então posteriormente lavados três vezes com 200 µ1 de á- gua MilliQ (produto da Millipore), cada vez por 10 minutos.

Para as partículas magnéticas lavadas, 1-eti|-3-(3-dimeti|aminopropi|)hidroc|oridrato de carbodi- imida (EDC) (produto de PÍERCE) como dissolvido em água MilliQ foi adi- lO cionado para dar uma concentração final de 0,2 M e a mistura foi incubada sob agitação em temperatura ambiente por 30 min.

Posteriormente, as partí- culas magnéticas foram lavadas com 400 µ1 de MilliCj fria, em seguida, com 400 µ1 de uma solução tampão de 50 mM MES (pH 5,0). A proteína purifica- da ISH224-2,6STNiCO (PCT/JP2006/304993) foi acondicionada em uma solução tampão de 50 mM MES (pH 5,0) para ter uma concentração de 0,6 mg/ml.

Para 400 µ1 da solução da proteína resultante (240 µg em termos da enzima purificada), as supracitadas partículas magnéticas foram adiciona- das.

A mistura foi agitada a 4°C por 2 horas para que o ISH224-2,6STN1CO se ligasse às partículas magnéticas por ligação covalente.

As partículas magnéticas foram recuperadas por um magneto e o sobrenadante (fração livre) foi removido.

Subsequentemente, 200 µ1 de uma solução tampão de 50 mM Tris (pH 7,0) foi adicionado às partlculas para inativar os grupos carboxil que não reagiram e, posteriormente, as partículas magnéticas Toram bloque- adas com 200 µ1 de uma solução tampão PBS (10 mM de fosfato de sódio e 150 mM de NaCl) contendo 0,5% BSA e 0,1% Tween 20. As partículas mag- néticas foram ressuspensas em 200 µ1 de uma solução tampão PBS para completar as esferas magnéticas ISH224-2,6ST para as quais a enzima tem sido ligada através da ligação covalente entre os grupos amino na enzima e" os grupos carboxil nas partículas magnéticas.

W'

Medição das .quantidades do lSH224-2,6ST-linkTM2 e do ISH224-2,6ST en- quanto liqados às partlculas maqnéticas e o qrau de suas purificações 'As quantidades do lSH224-2,6ST-linkTM2 e do ISH224-2,6ST enquanto ligados às esferas magnéticas foram calculadas cada uma como a diferença entre a quantidade da protelna antes dela ser ligada às partículas magnéticas e a quantidade da proteína livre.

A proteína na fração antes da ligação com as partículas e a proteína na fração livre foram fracionadas por

5 SDS-PAGE e detectadas pela coloração CBB.

Uma banda do ISH224- 2,6ST-linkTM2 foi detectada nas proximidades de 70 kDa e uma banda do ISH224-2,6ST nas proximidades de 55 kDa.

Um analisador de imagem Las3000 (produto da Fuji Film) foi usado para construir uma cuNa de cali- bração da concentração de uma banda para um marcador de peso molecu-

lO lar (kit marcador LMW; produto da Pharmacia) com uma massa proteica pre- liminarmente conhecida e as bandas das frações que ainda serão ligadas e as livres foram quantificadas.

No próximo local, o grau de purificação do ISH224-2,6ST - ' linkTM2 foi verificado.

Para começar, a proteína ligada às partículas magné- _ 15 ticas foi dissociada pelo calor.

Especificamente, as partículas magnéticas às - quais o ISH224-2,6ST-linkTM2 havia sido ligado foram Iavadas com PBS e, posteriormente, suspensas em uma quantidade igual de tampão de amostra de 2 x SDS (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 12% de 2-mercaptoetanol, 2% de SDS e 2O°/, de glicerol) e tratadas com calor a 95°C por 40 min.

As partículas

20 magnéticas foram recuperadas por um magneto e o sobrenadante resultante foi submetido a SDS-PAGE, coloração CBB e análise de western blotting.

Um anticorpo anti-TM2 foi usado como o anticorpo principal e um anticorpo lde coelho anti gG marcado com fosfatase alcalina foi usado como o anticor- po secundário. 25 Subsequentemente, um teste foi conduzido para dissociar o ]- SH224-2,6ST-linkTM2 das partículas magnéticas por meio da biotina.

A 200 µL das partículas magnéticas contendo o lSH224-2,6ST-linkTM2 ligádo a elas, 16 nmoles da D-biotina (produto da Sigma) foi adicionado e misturado com inversão na em temperatura ambiente por 2 horas.

A quantidade de

30 biotina foi 500 vezes superior ao número de bolsos de biotina, calculado a ' partir do nível de expressão da proteína de fusão.

As partículas magnéticas foram recuperadas por um magneto e o sobrenadante resultante foi subme-

tido a SDS-PAGE e a coloração da CBB.

Parte do sobrenadante foi concen- trada 5 vezes pelo método de precipitação por ácido tricloroacético.

Especifi- camente, 10 µL de 1OO°/o w/v do ácido tricloroacético foi adicionado a 100 µL do sobrenadante contendo como a protelna associadas às esferas, e a mis- 5 tura foi deixada em repouso no gelo por 20 min e, posteriormente, centrifu- gada a 15.000 rpm por 20 min a 4°C.

O sobrenadante foi removido e o pre- cipitado foi Iavado com 500 µL de acetona e, depois, recentrifugado a 15.000 rpm durante 20 minutos a 4°C.

O precipitado foi seco e dissolvido no tampão de amostra 1 x SDS. 10 A fração antes de ligar o lSH224-2,6ST-linkTM2 às proteínas magnéticas biotiniladas, a fração livre, a fração lavada, e a fração dissociada obtida por tratamento térmico ou tratamento com biotina cada uma foi sub- metida à análise SDS-PAGE-CBB ou à análise de western blotting, e os re- ·' sultados são mostrados na figura 3. Na coloração CBB, a amostra do extrato 15 de proteína bruto do lSH224-2,6ST-linkTM2 expressando a E. co/i resultou em uma banda densa de ca. 70 kDa que esteve ausente do pTrc99A ex- pressando a E. co/i; já que essa banda foi detectada especificamente para o anticorpo anti-TM2, foi demonstrado ter derivado da proteína ISH224-2,6ST- linkTM2. Aproximadamente 40% desta proteína de fusão está ligada às par- 20 tículas magnéticas biotiniladas.

Além disso, a proteína de fusão, uma vez ligada às partículas magnéticas biotiniladas, exibe uma força de ligação forte e não se dissociou com 1 M de cloreto de sódio e somente cerca de um dé- cimo dela dissociou sob tratamento a 95°C por 40 min na presença de 1°/, de SDS ou mesmo quando um excesso de biotina foi adicionado.

Em colora- 25 ção CBB após tratamento por calor, não só a faixa de aproximadamente 70 kDa, mas também bandas nas proximidades de 60 kDa, 40 kDa e 25 kDa foram observadas, entre estas bandas adicionais, as de 60 kDa e" 40 kDa foram reconhecidas pelo anticorpo anti-TM2. Então foi sugerido que" essas bandas eram moléculas resultantes da protelna da fusão.

A origem da banda 30 nas proximidades de 25 kDa é desconhecida, mas se for feita uma suposi-" ção de que ela não é derivada da proteina de fusão, o grau de purificação da proteína lSH224-2,6ST-linkTM2 ligada às partículas mag'néticas biotiniladas é de aproximadamente 5O°/,. Por outro lado, quando um excesso de biotina foi adicionado nenhuma espécie molecular adicional ocorreu diferentemente no caso do tratamento térmico e apenas a banda de 70 kDa foi detectada.

Do èxposto acima, foi mostrado que o uso de partículas magné- 5 ticas biotiniladas permitiu com sucesso que a proteína fundida ao tamavidin fosse purificada e imobilizada nas partículas simultaneamente. . 2-1-4. Análise comparativa das atividades da proteína de fusão do tamavidin 2 e da glicosil transferase conforme imobilizadas no carreador de fase sólida de biotina e a glicosil transferase conforme imobilizada no car- lO reador por Iigação covalente Para investigar o efeito da imobilização da glicosil transferase fazendo uso da fusão ao tamavidin 2, a atividade da protelna de fusão do tamavidin 2 e da glicosil transferase conforme imobilizadas no carreador fi- xado em biotina foi analisada. , 15 Análise comparativa das atividades das partículas magnéticas do ISH224- 2,6ST-linkTM2 e das partículas maqnéticas do ISH224-2,6ST Para comparar a atividade enzimática das esferas magnéticas fendo o lSH224-2,6ST-linkTM2 ligado através de tamavidin 2-biotina com as partículas magnéticas tendo o 1SH224-2,6ST ligado covalentemente através 20 dos resíduos de aminoácido no próprio ISH224-2,6ST, na fração ainda a ser ligada (solução lSH224-2,6ST-linkTM2 ou ISH224-2,6ST que ainda estava por reagir com as partículas magnéticas) e a fração da partícula magnética (as esferas magnéticas as quais o lSH224-2,6ST-linkTM2 ou o ISH224- 2,6ST foram ligados) foram medidos para a sialil transferase. 25 A atividade de transferência da sialil foi medida pelo método descrito em Yamamoto et al. (1996) J Biochem 120: 104-110. Uma reação enzimática foi realizada usando 30 µ1 de uma solução de reação contendo 70 nmol CMP-NeuAc (contendo ca. 20000 cpm de CMP-NeuAc tendo o NeuAc marcado com 14C; o NeuAc representa o ácido N-acetilneuramínico) 30 como um substrato doador de açúcar, 1,25 µmol de lactose como substrato do receptor de açúcar, e a fração supracitada de 0,5 M de NaCl.

A reação enzimática foi conduzida a 30°C por 5 min.

Após o término da reação, 1,9 mL de uma solução tampão de 5 mM de fosfato (pH 6,8) foi adicionado à solução de reação, que foi então carregada em um Dowex 1 x 8 (formulário PO-43, 0,2 x 2 cm; BIO-RAD). A radioatividade contida na sialil lactose, ou o produto da reação contido no eluldo da coluna, foi medida para computar a 5 atividade enzimática.

Uma unidade de enzima (1 U) é a quantidade da enzi- ma que transfere 1 µmol de ácido siálico em um minuto.

As atividades enzi- máticas por miligrama das proteínas lSH224-2,6ST-linkTM2 e ISH224-2,6ST como ligadas às partículas magnéticas foram computadas para comparar a força da atividade enzimática dependendo do modo de ligação.

Os resulta- IO dos são mostrados na tabela 4. [Tabela 4] Tabela 4. Atividades da enzima imobilizada no substrato fazen- do uso da proteina fundida ao tamavidin.

Proteína ISH224-2.6ST(A) ISH224-2,6ST-linkTM2(B) B/A Ítem

Atividade enzimática antes de ligar às partículas

(U/mg proteína) 9-3 9.8 1

Atividade enzimática Iigada às particulas (U/mg proteína) 0.9 10.7 12 Massa proteica por unidade de área de superfície

- " das partículas (mg/m') 48 48 1 Atividade enzimática por unidade de área de superfície das particulas (U/m') 43 519 12

Quando a sialil transferase foi ligada às partículas magnéticas por meio de ligação covalente com a ajuda dos grupos funcionais nas parti- culas e aqueles dentro da enzima, a atividade específica da enzima caiu pa- ra cerca de um décimo do valor inicial.

Por outro lado, quando a sialil transfe- -rase foi fundida ao tamavidin e ligada às partículas magnéticas através da ligação tamavidin-biotina, a atividade enzimática antes da ligação às partícu- Ias foi mantida intacta.

Neste contexto, as partículas magnéticas que eram usadas com o lSH224-2,6ST-linkTM2 (que tinha um tamanho médio da par- tícula de 1 µm) eram diferentes das usadas com o ISH224-2,6ST (que tinha .um tamanho médio da partícula de 2,8 µm), então suas áreas de superfície foram determinaclas a partir desses tamanhos médios das partículas e, além 5 disso, as quantidades das proteínas ligadas às partlculas foram divididas

- pelas áreas de superfície obtidas para determinar as atividades enzimáticas por unidade de superfície da área das partículas.

Estes resultados também mostram que a imobilização no substrato através de tamavidin-biotina exibi- ram uma atividade de mais de 10 vezes o valor para a imobilização por liga- 1O ção covalente.

Observe também que, considerando o fato de que a proteína do ISH224-2,6ST tem uma massa molecular de ca. 55 kDa, enquanto a pro- teína fundida do ISH224-2,6ST-TM2 (monômero) tem uma massa molecular de ca, 70 kDa, a diferença de atividade por molécula da proteína atual que é previsto para ser ainda maior. , 15 As partlculas magnéticas nas quais a proteína fundida do |- SH224-2,6ST-TM2 foi imobilizada foram armazenadas a 4°C por 3 semanas e suas atividades enzimáticas foram medidas; ao que se constatou, não ha- via quase nenhuma queda na atividade.

Portanto, a ligação da proteína fun- dida à biotina era muito forte e a atividade da enzima imobilizada também foi 20 estável. r

Exemplo 3. Liqação da proteína fundida do HELSCFv-TM2 às partículas maqnéticas Neste exemplo, o HELscFv-TM2 preparado no exemplo 1, foi li- gado às partículas magnéticas biotiniladas e uma investigação foi feita para 25 ver se o comprimento do ligador entre uma particula magnética e a biotina causaria qualquer efeito na ligação para a partícula.

Especificamente, o EZ-Link (marca registrada) NHS-Biotina ·(13,5 À), o EZ-Link (marca registrada) LC-8iotina (22,4 À), e o EZ-Link (mar- ca" registrada) NHS-LCLC-Biotina (30,5 À), cada um sendo "um produto de 30- PIERCE, foram condicionados com DMSO (dimetilsulfóxido) para 10 mM.

Estes foram acrescentados em uma quantidade de 200 µL (2 µM) a 200 µL de Dynabeads M-270 Amine (produto de PIERCE) e permitiu reagir à tempe-

ratura ambiente por 30 minutos, por meio do qual cada um dos reagentes biotinilados estava ligado às partículas magnéticas.

Subsequentemente, as partlculas foram lavadas duas vezes si- . multaneamente bloqueadas com 400 µL de uma solução tampão PBS (10 5 mM de fosfato de sódio e 150 mM de NaCl, pH 7,4) contendo 0,1% de BSA

- e O,Oi°/j de Tween 20. Finalmente, as partículas foram suspensas em solu- ção tampão de 200 µL de PBS para preparar três lotes de partlculas magné- ticas biotiniladas tendo comprimentos do ligador das partícuias magnéticas- biotina de 13,5 Â, 22,4 À e 30,5 Á.

As partículas magnéticas biotiniladas pre- IO paradas foram medidas para a eficiência de biotinilação pelo HABA: método Avidin e as partículas magnéticas modificadas com 200 pmol de biotina fo- ram usadas para a ligação ao HELSCFv-TM2. Cem microgramas do HELSCFv-TM2 secretado em um caldo de cultura da E. co/i foi reagido com o 200 pmol de partículas magnéticas bioti- , 15 niladas em temperatura ambiente por uma hora e, posteriormente, as partí- culas magnéticas foram coletadas com um magneto e o sobrenadante resul- tante, ou seja, a fração HELscFv-TM2 não ligada à biotina (fração Iivre) foi recuperada.

A fração que ainda vai reagir com as partículas e a fração livre foram submetidas à análise de Western blotting e a quantidade de HELsCFv- ' 20 TM2 em cada fração foi medida para computar a quantidade de HELscFv- TM2 ligado às partículas magnéticas biotiniladas.

Um anticorpo anti-TM2 de camundongo foi usado como anticorpo primário e um anticorpo lgG de cabra anti-camundongo marcado com fosfatase alcalina foi usado como anticorpo secundário. 25 Como resultado, 72% do HELsCFv-TM2 ligado às partículas magnéticas com um comprimento do ligador de 22,4 À e 77°4 do HELScFv-

" TM2 ligado às partículas magnéticas com um ligador de comprimento 30,5 · Â.

Por outro lado, o HELscFv-TM2 não se Iiga de forma alguma às partículas '-magnéticas com um ligador de comprimento 13,5 Â.

A partir dessas obser- .- 30 vações, ficou claro que a ligação entre a proteína fundida do HELSCFv-TM2 e a biotina seria afetada ocasionalmente pelo comprimento do ligador entre o carreador e a biotina e que o seu comprimento deve ser superior a, pelo me-

nos, 13,5 Â. Exemplo 4. Análise das atividades de liqação da biotina das proteínas de fusão do Tamavidin 2 e da Sialil Transferase Neste exemplo, usando Biacore 3000 (produto da BIACORE), 5 um teste para a ligação à biotina das proteínas fundidas do ISH224-2,6ST- TM2 do exemplo 2 foi realizado para verificar se o comprimento do ligador de aminoácido entre o tamavidin e a proteína (neste caso, uma enzima) afe- taria a ligação. Enquanto o ISH224-2,6ST fundido as protelnas TM2 ao, foram 10 usados os lSH224-2,6ST-linkTM2, lSH224-2,6ST-3XlinkTM2 e ISH224- 2,6ST-5XlinkTM2. Os vetores de expressão ISH224-2,6ST-linkTM2/pTrc99A, ISH224-2,6ST-3XlinkTM2/pTrc99A e ISH224-2,6ST-5XlinkTM2/pTrc99A fo- ram transformados em fiiamento TBI da E. co/i e a expressão da proteína foi realizada. As células foram suspensas em uma solução tampão de 50 mM

P 15 Tris (pH 8) contendo 50 mM de NaCl e, posteriormente, elas foram rompidas por sonicação para extrair a proteína. A solução contendo as células rompi- das foi centrifugado (150.000 rpm) e o sobrenadante resultante foi carregado em uma coluna de troca iônica Q-Sepharose ou MonoQ HR5/5 (produto da Amersham-Pharmacia). A solução tampão de equihbrio foi uma solução 20 tampão de 50 mM Tris (pH 8) contendo 50 mM de NaCl e a solução tampão de eluição foi uma soIução tampão de 50 mM Tris (pH 8) contendo 500 mM de NaCl; usando essas soluções tampão, a proteína foi recuperada em alí- quotas de 0,5 ml a uma taxa de fluxo de 1 mljmin. As frações eluldas foram submetidas a SDS-PAGE para a detecção e quantificação das proteínas de 25 fusão do ISH224-2,6ST-TM2 e, posteriormente usadas na análise da Biaco- re. O grau de purificação de cada proteína foi de aproximadamente 5O°/,. Em um chip sensor CM5 (produto da Biacore), a albumina de soro bovino (BSA) biotinilada com EZ-Link (marca registrada) NHS-Biotina . " (13,5 Â) ou EZ-Link (marca registrada) NHS-LCLC-Biotina (30,5 Á), cada um -. 30 ·sendo um produto de PIERCE e os números entre parênteses representam o comprimento do ligador entre a biotina e o NHS, foi corrigido pelo método de acoplamento com aminas. Usando HBS-PE (produto da Biacore) como a solução tampão de corrida, lSH224-2,6ST-linkTM2, ISH224-2,6ST- 3XlinkTM2 e ISH224-2,6ST-5XIinkTM2 foram injetados em uma taxa de fluxo de 20 µl/min em alíquotas de 40 µ1 (por 2 min) a 25°C. Dos sensorgramas resultantes, a taxa constante de ligação (ka), a taxa constante de dissocia- 5 ção (kd) e a constante de dissociação (KD) foram computadas com o auxilio do software de análise BlAevaluation versão 4.1. Os resultados são mostra- dos nas tabelas 5-7. Os números entre parênteses representam os valores que estão fora do intervalo de medição pela Biacore 3000.

Quando o comprimento do ligador entre a biotina e o BSA foi de 10 13,5 À, nenhuma Iigação entre a proteína fundida e a biotina foi detectada; no entanto, quando o comprimento do ligador foi de 22,4Â, cada um dos três tipos de proteína fundida mostrou uma ligação especifica à biotina (Tabela 6). A KD deles foi baixa na ordem de 10"' a 10"', o menor valor sendo exibi- do por lSH224-2,6ST-5XlinkTM2. Quando o comprimen'to do ligador foi de . 15 30,5Â, cada um dos três tipos da proteína fundida também mostrou uma li- gação específica à biotina (Tabela 7). Mesmo o KD da ISH224-2,6ST- linkTM2 foi baixa na ordem de 10"8, indicando a forte ligação entre a proteína fundida e a biotina. A lSH224-2,6ST-3XlinkTM2 e a ISH224-2,6ST- 5XlinkTM2 que tinham a ISH224-2,6ST e o TM2 fundidos juntos por ligado- 20 res mais compridos, exibiram uma ligação ainda mais forte e, em particular, suas taxas constante de dissociação kd diminuiu abaixo da detecção limite da Biacore 3000 (> 5 x 10"') da ordem de 10"' e 10"'. Assim, foi demonstrado praticamente que a lSH224-2,6ST-3XlinkTM2 e a ISH224-2,6ST-5XlinkTM2, uma vez ligadas à biotina, seriam dificilmente dissociadas dela. Eles tiveram 25 valores extremamente baixos de dissociação constante KD, que estavam nas ordens de 1Ojq e 10"" respectivamente.

[Tabela 5] ^ BSA-Biotina {j3,5 À)

4.

.- 30" ISH224-2,6-ST-linkTM2 Sem liqação Sem liqaçãó Sem liqação [Tabela 6] NQme da amostra ka kd Kd

BSA-LC-Biotina (22,4 Â) ISH224-2,6ST-TM2 2,3x1o' 6,6x1o"' 2,7x1o"' lSH224-2,6ST3XlinkTM2 2,5x1o' 2,ox1o^ 7,8x1o" lSH224-2,6ST5XlinkTM2 2,3x1o' 1,6x1o"' 6,9x1o"' 5 [Tabela 7] Nome da amQstra ka kd KD BSA-LCLC-Biotina L30,5 Â) ISH224-2,6ST-linkTM2 1,ox1o' 1,9x1o" 1,8x1o" lSH224-2,6ST3XlinkTM2 2,7x1o' (4,2x1o"') 1,6X1O"'° 10 lSH224-2,6ST-5XlinkTM2 4.8x1o' (7,8x1o"') (1,6x1o"")

3.ox1o' (9,3x1o"') (3,1x1o") Exemplo 5. Proteínas de fusão do tarnavidin e da lectina Neste exemplo, as proteínas de fusão do tamavidin 2 e da lecti- na foram expressadas em células cultivadas de tabaco BY2 e as atividades 15 da lectina e as atividades de ligação à biotina das proteínas de fusão foram m investigadas. Um experimento de imobilização também foi conduzido.

Genes da lectina Como exemplo da proteína fundida tamavidin-lectina, o tamavi- din 2 (doravante às vezes denominado "TM2") e a lectina de soja (SBA) ou a 20 lectina de germe de trigo (WGA), cada uma sendo uma espécie de lectina, foram usadas. O gene codificando a aglutinina de soja (NCBI: KO0821) foi utilizado como SBA considerando que cada um dos genes codificando a a- glutinina de germe de trigo isolectina A (WGA-A) (NCBI: M25536) e a agluti- nina de gérmen de trigo isolectina D (WGA-D) (NCBI: M25537) foram usadas 25 como WGA.

As proteínas de fusão foram desenhadas de tal forma que o TM2 seria localizado no C-terminal da lectina. No mesmo Iugar, um ligador (sequência de aminoácidos lxlink: GGGGSG, ou 5xlink: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) foi inserido entre a lectina e o ·30 TM2. O peptídeo de sinal da lectina para fazer com que as proteínas fundi- das lectina-TM2 fossem secretadas no meio era inerente a lectina. A expres- são foi realizada em células cultivadas de tabaco BY2 e o pSB24 (Komari et al. 1996) foi usado como um vetor de expressão. 5-1. Construção de vetores para expressar as proteínas de fusão do tamavi- din 2 e da lectina Os três ácidos nucleicos seguintes foram construídos: um ácido 5 nucleico (SBA-lxlink-TM2) codificando uma proteína que consiste em tama- vidin 2 fundido ao SBA através de um ligador (GGGGSG), bem como os áci- dos nucleicos (WGA-A-5xlink-TM2 e WGA-D-5xlink-TM2) cada um codifi- cando uma proteína consistindo em tamavidin 2 fundido ao WGA através de um 5xlinker(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGgS) (as sequências das 10 respectivas bases: SEQ ID NOs: 63, 65 e 67; as sequências de aminoácido codificadas pelas sequências de base respectivas: SEQ ID NOS: 64, 66 e 68). Desenhando os primers Para construir os genes fundidos lectina-TM2, os primers para 15 juntar a lectina e os genes TM2 através de um ligador {Ixlink: GGGGSG, ou 5xlink: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) foram desenhandos.

Es- pecificamente, três primers (SBA-link-TM2-FW, WGA-A-5xlink-TM2-F, e WGA-D-5xlink-TM2-F) foram desenhados, cada um consistindo no sÍtio C- terminal da lectina do lado 5', o ligador no centro, e a porção TM2 no lado 3'; 20 três primers adicionais (SBA-link-TM2-RV, WGA-A-5xlink-TM2-R, e WGA-D- 5xlink-TM2-R) também foram desenhados, cada um consistindo no sítio N- terminal do TM2 no Iado 5', o ligador, e uma sequência de DNA no lado 3' codificando o sitio C-terminal da lectina em uma direção inversa.

Subsequentemente, mais três primers (S8A5'Xbal, WGA- 25 A5'Xbal, e WGA-D5'Xbal) foram desenhados, cada um consistindo na por- ção 5', incluindo o sÍtio da sequência sinal da lectina e uma sequência de codificação a montante para um sÍtio de clivagem da enzima de restrição Xba | (TCTAGA); além disso, havia desenhado um iniciador (TM2CtermSacl) ' consistindo na porção 3' do gene TM2 e uma sequência a jusante codifican- 30 do um sÍtio de clivagem da enzima de restrição Sac I (GAGCTC). Os respec- tivos primers para a construção das protelnas de fusão do tamavidin e da lectina são identificados na tabela 8.

[Tabela 8-1] Tabela 8. Primers para construir as proteínas de fusão do tama- vidin e da lectina Nome Sequência (5'-3') Comprimento 5 S8A5'Xbal AAATCTAGAATGGCTACTTCAAAGTTGAAAAC 32mer SBA-Iink-TM2-RV TGAAGATTGAACGTCTGAaccgctgccaccgccaccGATGGCCTCATGCAACAC 54mer sBA-|ink-TM2-m GTGTTGCATGAGGCCATCggtggcggtggcagcggtTCAGACGTTCAATCTTCA 54mer TM2CtermSac AAAGAGCTCTTACTTCAACCTCGGTGCG 28mer WGA-A5'Xbal AAATCTAGAATGAAGATGATGAGCACCAG 29mer WGA-A-5xlink-TM2-R TGAAGATTGAACGTCTGAgctgccaccgccaccgctgccaccgccaccgctgccaccgcc accgctgccaccgccaccgctgccaccgccaccTTCTTGGAGAAgAgTggA 111mer WGA-A-5xlink-TM2-F TCCACTCTTCTCCAAGAAggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcggtggcggtggc agcggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcTCAGACGTTCAATCTTCA 111mer WGA-D5'XbalAAATCTAGAATGAGAAAGATGATGAGCAC 29mer WGA-D-5xlink-TM2-R TGAAGATTGAACGTCTGAgctgccaccgccaccgctgccaccgccaccgctgccaccgcc accgctgccaccgccaccgctgccaccgccaccTTCTGCGAGAAGAGTGgA 111mer [Tabela 8-2] \NGA-D-5xlink-TM2-F TCCACTCTTCTCGCAGAAggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcggggcggtggc agcggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcTCAGACGTTCAATCTTCA lllmer Os sÍtios de reconhecimento da enzima de restrição estão subli- nhados. As sequências do ligador estão escritas em letras minúsculas. As sequências individuais correspondem a SEQ ID NOS: 26-35 contados a partir do topo.

PCR

O PCR de duas etapas foi realizado para construir os genes lec- tina-TM2. Na primeira etapa do PCR, o sítio da lectina foi amplificado usando os primers SBA5' Xbal e SBA-link-TM2-RV, ou os primers WGA-A5' Xbal e \NGA-A-5xlink-TM2-R, ou os primers WGA-D5' Xbal e WGA-D-5xlink-TM2-R, com o DNA genômico da soja ou do trigo sendo usado como um modelo, e o sÍtio do TM2 foi amplificado usando os primers SBA-link-TM2-FW e TM2CtermSac, ou os primers WGA-A-5xIink-TM2-F e TM2CtermSac, ou os primers WGA-D-5xlink-TM2-F e TM2CtermSac, com um plasm Ídeo incorpo- rando o gene TM2 no vetor pTrc99A (ver WO02/072817) sendo usado como um modelo.

As condições de reação do PCR foram as seguintes: para uma solução de reação 20 µ1, 500 ng do DNA modelo, 2 µ1 do tampão 10 X Ex- Taq ll (Takara) no caso do lxlink ou 10 µ1 do tampão 2 X GC (Takara) no ca- so do 5xlink, 1,6 µ1 de 2,5 mlVl de dNTP, 10 pmols de cada um dos primers, e 5 U/µl Ex Taq em 0,1 µ1 (XX U) foram adicionados, e usando o GeneAmp PCR System 9600 (PERKIN ELMER), um ciclo de 96°C x 3 min, 25 ciclos de 95°Cx1rnin,60°Cx1mine72°Cx2min,eumciclode72"Cx6minfo- ram realizados.

Como resultado, três produtos do PCR foram obtidos na porção lectina, com tamanhos respectivos de 900 bp no caso do SBA-lxlink- TM2, 663 pb no caso do WGA-A-5xlink-TM2, e 666 pb, no caso do WGA-D- 5xlink-TM2. Na porção TM2, três produtos do PCR também foram obtidos, com tamanhos respectivos de 468 bp no caso do SBA-lxlink-TM2 e 525 pb em cada um dos casos do WGA-A-5x1ink-TM2 e WGA-D-5xlink-TM2. Estes produtos do PCR foram fracionados por eletroforese em gel de agarose em uma solução tampão TAE.

Cada um dos fragmentos de DNA foi excluido junto com o gel e recuperado usando um kit de extração de gel QIAEX Il (Qiagen). O método de extração foi de acordo com as instru- ções do kit.

Com esses fragmentos usados como modelos, a segunda etapa do PCR foi realizada usando os primers S8A5'Xbal e TM2CtermSac no caso do SBA-lxlink-TM2 (os modelos foram as porções SBA e TM2 do supracitado SBA-lxlink-TM2), ou os primers WGA-A5'Xbal e TM2CtermSac no caso do

WGA-A-5xlink-TM2 (os modelos foram as porções WGA-A e TM2 do supra- citado WGA-A-5xlink-TM2), ou os primers WGA-05'Xbal e TM2CtermSac no caso do WGA-D-5xlink-TM2 (OS modelos foram as porções WGA-D e TM2 do supramencionado \NGA-D-5xlink-TM2). As condições de reação foram as mesmas da primeira fase.

Como resultado, três produtos do PCR foram ob- tidos, com os tamanhos respectivos de 1314 pb no caso do SBA-Ixlink-TM2, 1152 pb no caso do WGA-A-5xlink-TM2 e 1155 pb no caso do WGA-D- 5xlink-TM2. Clonaqem Os fragmentos gênicos lectina-TM2 obtidos por PCR foram clo- nados no vetor pCR4 TOPO (produto da lnvitrogen). A reação de ligação foi de acordo com as instruções contidas no kit do vetor.

O DNA foi transferido para a E. co/i TBI por eletroporação e o DNA plasmidial foi extraído de acor- do com o método habitual (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A labo- ratory manual, 2" edição). Os clones averiguados quanto às inserções foram tratados da seguinte forma: usando o iniciador M13 (TakaRa), a sequência de base de cada produto do PCR foi determinada de ambas suas extremidades com um sequenciador de fluorescência ABI PRISM (modelo 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer ) para confirmar que não houve nenhuma mutação do gene original.

O plasmídeo incorporando os genes de interesse foi digerido duas vezes com Xbal e Sacl e a purificação do ge! foi realizada pelo método su- pramencionado para recuperar um fragmento de DNA.

O fragmento de DNA recuperado foi ligado por um kit de ligação (produto da TakaRa) para o vetor para plantas pSB24 (Komari et al. 1996 Usina J) que havia sido preliminarmente digerido com Xbal e Sacl para re- mover o gene GUS.

O produto de ligação foi transformado na E. co/i TBI e as colônias da E. cO/i resultantes foram submetidas à análise de amplifica- ção dos sÍtioS gênicos inseridos por PCR, nas condições supramencionadas usando os primers S8A5'Xbal e TM2CtermSac no caso do uso do SBA- lxlink-TM2 como um modelo, ou os primers WGA-Xbal A5 e TM2CtermSac no caso de usar o WGA-A-5xlink-TM2 como um modelo, ou os primers

WGA-A5'Xbal e TM2CtermSac no caso de usar o WGA-D-5xlink-TM2 como um modelo; verificando a presença dos genes inseridos, os vetores para ex- pressar as proteínas de fusão do tamavidin 2 e da lectina, ou seja, SBA-link- TM2/pSB24, WGA-A-5xlink-TM2/pSB24 e WGA-D-5xlink-TM2/pSB24 foram 5 concluídos.

Usando os vetores assim construídos, os genes da proteína fun- dida Iectina-TM2 foram transferidos para as células cultivadas de tabaco BY2 usando o método de Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231. 5-2. Expressão e análise funcional das proteínas de fusão do tamavidin 2 e da lectina 10 Para investigar a atividade da Iectina como fundida ao tamavidin 2, a proteína de fusão do tamavidin 2 e da lectina foi expressa pela primeira vez nas células cultivadas de tabaco BY2 e parcialmente purificada.

Expressão nas células cultivadas de tabaco BY2 As células cultivadas de tabaco BY2, transformadas com SBA- . 15 lxlink-TM2, foram cultivadas por 7 dias e, posteriormente, uma fração da cé- Iula foi separada de uma fração do meio por filtração por sucção.

Para 3 g das células recuperadas, 4 ml de 50 mM de HEPES/KOH (pH 7,4) foi adicio- nado e, após a mistura ser moída em um pilão, as células foram rompidas por sonicação.

A solução contendo as células rompidas foi centrifugada 20 (1 5.000 rpm) e o sobrenadante resultante foi coletado em uma fração solú- vel.

Quanto à fração do meio, o sulfato de amônio foi adicionado para dar 70% de saturação; uma incubação durante a noite a 4°C foi seguida por cen- trifugação (14.500 rpm) para precipitar as protelnas contidas no meio.

O pre- cipitado resultante foi suspenso novamente em 1 mL de 50 mM de HE- 25 PES/KOH (pH 7,4) e dialisado em 100 mL de 0,1 M de HEPES/KOH (pH 7,4); a fração resultante foi usada como uma fração do meio enriquecida.

A fração solúvel e a fração do meio enriquecida do S8A-lxlink- TM2 foram submetidas à análise por Western blotting.

Para detecção, um anticorpo de coelho anti-TM2 foi usado como anticorpo primário e um anti- 30 corpo lgG anti-coelho marcado com fosfàtase alcalina (produto da 81o-Rad) foi usado como anticorpo secundário.

Como resultado, uma banda foi detec- tada das células BY2 transferidas do SBA-lxlink-TM2 apenas na fração solú-

vel nas proximidades de 45 kDa.

Este tamanho foi substancialmente de a- cordo com a massa molecular (43 kDa) obtida após a clivagem do peptldeo sinal do SBA-lxlink-TM2. Medição da atividade da lectina da protelna de fusão (reação de aqlutinação 5 de hemácias) Para investigar a atividade da lectina da proteína fundida tama- - vidin2-SBA, a atividade de aglutinação de hemácias foi investigada usando o SBA-lxlink-TM2 parcialmente purificado.

Dez mililitros de PBS foi adicionado a 2 ml de uma amostra de 10 sangue de coelho armazenada (COSMO BlO) e após a centrifugação, o so- brenadante foi retirado para produzir uma fração de hemácias.

A fração da hemácia resultante foi lavada três vezes com 10 ml de PBS e, posteriormen- te, uma solução de 5% de tripsina foi adicionada em uma quantidade igual a ' da fração de hemácia, seguido de incubação sob agitação suave a 37°C du-

., 15 rante uma hora.

A fração de hemácia tripsinizada foi lavada novamente três vezes com 10 ml de PBS e depois diluída com PBS para preparar uma sus- pensão de hemácia de 2% (v/v). A proteína foi extraída de células cultivadas de tabaco expres- sando o SBA-lxlink-TM2 e parcialmente purificada em uma coluna de imino- 20 biotina.

O tampão de ligação da coluna que consistia em 50 mM de CAPS pH 11 e 50 mM de NaCl; a solução de lavagem consistiu em 50 mM de CAPS pH 11 e 500 mM de NaCl; e o tampão de eluição foi de 50 mM de NH4OAC pH 4. Como controle, a proteína foi extraída das células cultivadas de tabaco tendo o pSB24 e parcialmente purificada em uma coluna de imi- 25 nobiotina de forma semelhante.

Então, para a medição atividade, a soIução SBA (J-OIL MILLS) diluída a 1 µg/µl, 10 ng/µl e 0,1 ng/µl, a solução TM2, e a solução S8A-lxlink- TM2 parcialmente purificada foram carregadas em uma placa de 96 poços; como controle, uma solução"de proteinas parcialmente purificadas de células 30 BY2 na qual o vetor pSB24 (expressando o gene GUS) foi introduzido tam- -. bém foi coIocado na placa; cada amostra foi diluída em série por um fator 2. Para cada diluição, uma suspensão de hemácias de 2% (v/v) foi adicionada em uma quantidade igual e após incubação em temperatura ambiente duran- te uma hora, as amostras foram testadas para a ocorrência de aglutinação de hemácias.

Como resultado, uma reação de aglutinação das hemácias tam- 5 bém foi obseNada no SBA-lxlink-TM2 parcialmente purificado, indicando que o SBA fundido ao tamavidin 2 reteve a atividade da lectina (SBA) (Fig. 4). - Purificação parcial e a atividade de liqação do açúcar da proteína expressa- 9a Na próxima etapa, um lote da cultura de 7 dias das células culti- lO vadas de tabaco BY2 transformado com SBA-lxlink-TM2 foi submetido à cromatografia em coluna para a purificação bruta.

Frações solúveis prepara- das a partir de 15g de células do lote da cultura de 7 dias pelo mesmo méto- do, como descrito acima, foram utilizadas diretamente como amostras de ' proteína bruta.

Essas amostras foram misturadas com D-GalNAc agarose , 15 (produto da SIGMA) equilibradas com 50 mM de HEPES/KOH (pH 7,4) e incubadas em temperatura ambiente por uma hora antes de preparar uma coluna aberta.

Para eluição, um tampão de eluição (50 mM de HEPES/KOH (pH 7,4), 0,1"/, de Nonidet P40 e 20 mM de GalNAc) foi usado, A protelna purificada foi detectada pela coloração CBB após 20 SDS-PAGE (Figura 5A), bem como pela análise de Western blotting em que, como descrito acima, um anticorpo anti-TM2 de coelho foi usado como anti- corpo primário e um anticorpo lgG anti-coelho marcado com fosfatase alcali- na (produto da 81o-Rad) foi usado como anticorpo secundário (Figura 5B). Como resultado, o SBA-lxlink-TM2 foi detectado em uma fração eluída (indi- 25 cado por setas nas Figuras 5A e 5B). Assim, o SBA-lxlink-TM2 foi encontra- do para se ligar a D-GalNAc agarose, indicando que o SBA fundido ao tama- vidin 2 reteve a atividade de ligação da cadeia de açúcar.

Subsequentemen- '" te, a solução da proteina purificada da qual a banda do SBA-lxlink-TM2 foi " detectada foi dialisada em 50 mM de HEPES/KOH (pH 7,4). Com esta ope- 30 ração, 7,5 µg de SBA-lxlink-TM2 foi recuperado.

O grau de purificação foi de -- ' 26%. Análise da atividade de liqação da biotina da proteína de fusão do tamavidin

2 e da lectina A capacidade de ligação da biotina da proteina fundida SBA- lxlink-TM2 foi analisada usando o Biacore 3000 (produto da BIACORE). Fra- ções parcialmente purificadas de cerca de um lote da cultura de 7 dias das 5 células cultivadas de tabaco BY2 transformado com SBA-lxlink-TM2 pelo método referido.acima eram usadas como amostras a serem analisadas.

Em um chip sensor CM5 (produto da BIACORE), uma albumina de soro bovino (BSA) biotinilada com o EZ-Link®NHS-LCLC-Biotina (30,5 À) (produto de PIERCE e os valores entre parênteses representam o compri- lO mento do ligador entre a biotina e o NHS) foi fixada pelo método de acopla- mento da amina.

Usando o HBS-PE (produto da BIACORE) como a solução tampão de corrida, o SBA-lxlink-TM2 foi injetado em uma taxa fluxo de 20 µI/min em allquotas de 40 µ1 (por 2 min) a uma temperatura de 25°C.

Do sensorgrama resultante, a taxa constante de ligação (ka), a taxa constante 15 de dissociação (kd) e a constante de dissociação (KD) foram computadas e com o auxílio do software de análise Biaevaluation versão 4.1. O resultado é mostrado na Tabeía 9. O SBA-Íxlink-TM2 interagiu especificamente com a biotina e seus KD foram baixos na ordem de 10"', indicando a forte ligação à biotina. 20 Do exposto acima, pode-se dizer que a proteína de fusão da lec- tina e do tamavidin 2 foi expressada com sucesso em células vegetais, en- quanto reteve tanto a atividade de ligação do açúcar da lectina e atividade de Iigação da biotina do tamavidin 2. [Tabela 9] 25 Tabela 9. Resultado da análise da Biacore Nome da amostra ka kd KD SBA-lxlink-TM2 " 3,8 x 10' 5,9x1O"' 1,5x1O"' Exemplo 6. Proteínas de Fusão do tamavidin e da proteína A NeSte exemplo, as proteínas de fusão do tamavidin 2 e da prote- "' 30 Ína A foram expressas na E. co/i e as proteínas de fusão conforme purifica- das foram imobilizadas em placas de biotina pela ligação tamavidin-biotina.

As placas da proteína A assim preparadas reagiram com um anticorpo poli-

clonal, que foi imobilizado fazendo uso de sua afinidade com a protelna A e sua atividade de ligação do antígeno foi investigada. Como controle, foi usa- do o anticorpo policlonal diretamente imobilizado na placa pela ligação hidro- fóbica. Detalhes são dados abaixo. 5 As estruturas do Aene da proteína A e as proteinas de fusão A protelna A derivada do Staphy/ococcus aureus foi usada. O gene da proteína A Staphy/ococcus aureus (SPA) foi determinado do Centro de Recursos Biológicos do Instituto Nacional de Avaliação Tecnológica (N- BRC), Agência Administrativa lncorporada. O NBRC distribui clones de DNA 10 genômicos derivados de dois filamentos do Staphy/ococcus aureus, N315 e MW2, e os genes spa desses dois filamentos, NBRC G04-000-249 (ORF ID: SAO107) e NBRC G05-000-311 (ORF ID: MWO084 ) foram usados. As proteínas de fusão foram então desenhadas de forma que o tamavidin 2 (que é doravante às vezes escrito como "TM2") seria localizado 15 no C-terminal do spa. Na ocasião, um ligador (sequência de aminoácidos a lxlink: GGGGSG, ou 5xlink: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) foi inserido entre o spa e o TM2. Para fazer com que as proteínas fundidas spa- TM2 fossem secretadas no meio, o peptídeo sinal do spa foi usado como tal. Além disso, o domínio de ligação da parede celular presente no C-terminal 20 do spa (Uhlen et al. (1984) j. Biol. Chem. 259: 1695-1702) foi removido. A expressão foi realizada na E. CO// e um pTrc99A não marcado (produto da Pharmacia) foi usado como um vetor de expressão. 6-1. Construção de vetores para expressar as protelnas de fu- são do tamavidin 2 e da proteína A 25 O gene spa tem uma estrutura tal que consiste em, na ordem, N-terminal, peptídeo sinal, cinco domínios de ligação da lgG, e domínio de ligação da parede celular. Usando o PCR, quatro genes foram construídos que codificaram as proteínas fundidas tendo a sequência do TM2 unida ao C-terminal-dos domínios de ligação da lgG no spa. 30 .--1. spa(SA)AC-lxlink-TM2 (sequência de base 69, sequência de aminoácidos 70)

2. spa(MW)AC-lxlink-TM2 (sequência de base 71, sequência de aminoácidos 72)

3. spa(SA)AC-5xlink-TM2 (sequência de base 73, sequência de aminoácidos 74)

4. spa(MW)AC-5xlink-TM2 (sequência de base 75, sequência de 5 aminoácidos 76) Desenhando os primers Para construir os genes fundidos spa-TM2, os primers para jun- tar o spa e o TM2 genes através de um ligador (lxlink: GGGGSG, ou 5xlink: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) foram desenhados. Especifica- lO mente, dois primers (spaAC-lxlink-TM2-F e spaAC-5xlink-TM2-F) foram de- senhados, cada uma consistindo no sÍtio de ligação IgG spa no lado 5', o Iigador no centro, e a porção TM2 no lado 3'; e dois primers adicionais (spaâC-lxlink-TM2R e spaAC-5xlink-TM2-R) também foram desenhados, cada um consistindo no sÍtio N-terminal TM2 no lado 5', o ligador, e uma se- , 15 quência de DNA no lado 3' codificando o sÍtio de ligação IgG spa no sentido inverso. Subsequentemente, mais dois primers (sp-spa 5' NCOI-F e TM2CtermBam) foram desenhados, o primeiro consistindo na porção 5' in- cluindo o sÍtio da sequência sinal do spa e uma sequência a montante codifi- 20 cando um sÍtio de clivagem Nco I da enzima de restrição (CCATGG) e o se- gundo consistindo na porção 3' do gene TM2 e uma sequência a jusante co- dificando um sítio de clivagem BamH I da enzima de restrição (GGATCC). Os respectivos primers para construir as proteínas de fusão do tamavidin e do spa são identificados na Tabela 10. 25 [Tabela 10] Tabela 10. Primers para construir as proteínas de fusão do tamavidin e da proteína A Nome " Seguência (5'-3') Comprimento sp-spa 5'NCOI-F AAACCATGGCCATGAAAAAGAAAAACA I I IAT 32mer 30 spMC-1xlink-TM2-R TGAAGATTGAACGTCTGAaccgctgccaccgccacc I j i IGGTGCTTGTGCATC 54mer spaAC-5xlink-TM2-R

TGAAGATTGAACGTCTGAgctgccaccgccaccgctgccaccgccaccgçtgccaccgcc accgctgccaccgccaccgctgccaccgccacc I I I | GGTGCTTGTGCATC 111mer spaAC-1xlink-TM2-F GATGCACAAGCACCAAAAggtggcggtggcagcggtTCAGACGTTCAATCTTCA 54mer spaAC-5xlink-TM2-F GATGCACAAGCACCAAAAggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcggtggcggtggc .- agcggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcTCAGACGTTCAATCTTCA 111mer TM2CtermBam i i I GGATCCTTACTTCAACCTCGGTGCG 28mer Os sÍtios de reconhecimento da enzima de restrição estão subli- nhados. As sequências do ligador estão escritas em letras minúsculas. As sequências individuais correspondem a SEQ ID NOS: 36-41 contados a partir do topo.

PCR O PCR de duas etapas foi realizado para construir os genes spa-TM2. Na primeira etapa do PCR, o sítio de ligação lgG spa foi amplifica- do usando os primers sp-spa5'NcoI-F e spaAC-lxlink-TM2-R ou spaAC- 5xlink-TM2-R, com um plasmídio incorporando de um DNA genômico codifi- cando o spa em um vetor pUC18 sendo usado como um modelo, e o sÍtio TM2 foi amplificado usando os primers spaÂC-lxlink-TM2-F ou spaAC-5xIink- TM2-F e TM2CtermBam, com um plasmídeo incorporando o gene TM2 no vetor pTrc99A (ver WO02/072817) sendo usado como um modelo. As condições de reação do PCR foram as seguintes: para uma solução de reação de 20 µ1, 500 ng do DNA modelo, 2 µ.1 do tampão 10 X ExTaq ll (TakaRa) no caso do lxlink ou 10 µ1 do tampão 2 X GC (TakaRa) no caso do 5xlink, 1,6 µ.1 de 2,5 mM de dNTP, 10 pmols de cada um dos pri- mers, e 0,1 µ1 de 5 U/µL Ex Taq foram adicionados, e usando o GeneAmp PCR System 9600 (PERKIN ELMER), um ciclo de 96°C x 3 min, 25 ciclos de 95°Cx1min,60"Cx1mine72°Cx2min,eumciclode72°C-x6minfo- ram realizados. Como resultado, dois produtos do PCR foram obtidos na porção spa, com tamanhos de 854 bp e 912 bp nos respectivos casos do lxlink e do 5xlink-TM2; na porção TM2, dois produtos do PCR também foram obtidos, com tamanhos de 468 bp e 525 pb, nos respectivos casos do lxlink e do 5xlink. Estes produtos do PCR foram fracionados por eletroforese em 5 gel de agarose em uma solução tampão TAE. Cada um dos fragmentos de DNA foi excluldo junto com o gel e recuperado usando um kit de extração de gel QIAEX ll (Qiagen). O método de extração foi de acordo com as instru- ções do kit. Com esses fragmentos usados como modelos, a segunda etapa 10 do PCR foi realizado usando os primers sp-spa 5'NCOI-F e TM2CtermBam. As condições de reação foram as mesmas que na primeira fase. Como re- sultado, dois produtos do PCR foram obtidos, com tamanhos respectivos de

1.268 pb e 1.325 pb nos respectivos casos do lxlink e do 5xlink.

[0187] Clonaqem 15 Os fragmentos do gene spa-TM2 obtidos por PCR foram clona- . dos no vetor pCR4 TOPO (produto da lnvitrogen). A reação de ligação foi de acordo com as instruções contidas no kit do vetor. O DNA foi transferido pa- ra a E. CO/l" TBI por eletroporação e o DNA plasmidial foi extraído de acordo com o método habitual (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Labora- 20 tory Manual, 2" edição). Os clones verificados para ter inserções foram tra- tados da seguinte forma: usando o iniciador M13 (TakaRa), a sequência de base de cada produto do PCR foi determinada de ambas suas extremidades com um sequenciador de fluorescência ABI PRISM (modelo 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer) para confirmar que ela não tinha nenhuma mutação 25 do gene original. O plasmldeo incorporando os genes de interesse foi digeri- do em dobro com Ncol e BamHl e a purificação do gel foi realizada pelo mé- todo supramencionado para recuperar um fragmento de DNA. Este fragmen- to foi ligado por um kit de ligação (produto da TakaRa) ao vetor pTrc99A para expressão na E. co/i que foi preliminarmente digerida com Ncol e Ba- 30 mHl. O produto de ligação foi transformado na E. co/i BL21 e as colô- nias da E. co/i resultantes foram submetidas à análise de amplificação dos sÍtios genéticos inseridos por PCR, nas condições supracitadas utilizando sp-spa5'NcoI-F e TM2CtermBam como modelos; verificando a presença dos genes inseridos, os vetores para expressar as proteínas de fusão do tamavi- din 2 e do spa, ou seja, spa(SA)AC-lxjink-TM2/pTrc99A, spa(MW)AC-lxlink- 5 TM2/pTrc99A, spa(SA)AC-5xlink-TM2/pTrc99A e spa(MW)AC-5xlink- -TM2/pTrc99A, foram concluídos. 6-2. Expressão e purificação parcial das proteínas de fusão do tamavidin 2 e do spa Para investigar o efeito de imobilização da proteína A no subs- lO trato por meio de fusão ao tamavidin 2, as proteínas de fusão do tamavidin 2 e do spa foram primeiro expressas na E.

CO/i e parcialmente purificadas.

Expressão na E. co/i e a atividade de liqação da lqG das proteínas expres- sadas Dois lotes da E. co/i BL21, um transformado com spa(SA)^C-

. m 15 Ixlink-TM2/pTrc99A e o outro com spa(MW)AC-IxIink-TM2/pTrc99A, foram inoculados em 50 mL de um meio LB contendo o antibiótico ampicilina (con- centração final: 100 µg/mL) e cultivados sob agitação a 30°C até que a ab- sorbância a OD60o atingiu 0,5. Posteriormente, 1 mM de IPTG foi adicionado e a agitação da cultura foi realizada por mais 5 horas a 30°C.

O caldo de cul- 20 tura (50 mL) foi separado em uma fração da E. co/i e uma fração do meio por centrifugação.

A fração da E.

CO// foi suspensa em 3 mL de 0,1 M HE- PES/KOH (pH 7,4) e as células foram rompidas por sonicação.

A solução contendo as células rompidas foi centrifugada (15.000 rpm) e o sobrenadan- te resultante foi coletado em uma fração solúvel.

O precipitado foi suspenso 25 em 3 mL de 0,1 M HEPES/KOH (pH 7,4) contendo 8 M de ureia e, posteri- ormente, submetido a uma outra ruptura por sonicação para coletar uma fra- ção insolúvel.

Quanto à fração do meio, o sulfato de amônio foi adicionado para dar 70% de saturação; uma incubação durante a noite a'4°C, foi segui- da por centrifugação (14.500 rpm) para precipitar a proteína contida no meio. 30 O precipitado resultante foi ressuspenso em 1 mL de 0,1 M HEPES/KOH (pH 7,4) e dialisado em 100 mL de 0,1 M HEPES/KOH (pH 7,4); a fração resul- tante foi usada como uma fração do meio enriquecida.

A fração solúvel e a fração do meio enriquecida de cada um do spa(SA)ÂC-lxlink-TM2 e do spa(MW)AC-lxlink-TM2 foram submetidos à aná- . lise por Western blotting.

Para a detecção, um anticorpo lgG de coelho mar- cado com fosfatase alcalina (produto da 81o-Rad) foi usado.

Como resultado, 5 uma banda foi detectada a partir do spa(SA)AC-|x]ink-TM2 e do spa(MW)AC- Ixlink-TM2 expressando a E. co/i em ambas as frações solúveis e a fração do meio enriquecida nas proximidades de 40 kDa.

Esse tamanho foi substanci- almente de acordo com a massa molecular (42 kDa) obtida após clivagem do peptídeo sinal do spa(SA)AC-lxlink-TM2 e do spa(MW)AC-lx|ink-TM2. E 10 mais, uma vez que a detecção foi possÍvel usando o anticorpo lgG de coelho marcado com fosfatase alcalina sozinho (este anticorpo é normalmente em- pregado como anticorpo secundário), o spa fundido ao tamavidin 2 foi averi- guado para reter a atividade de ligação da lgG.

Purificação parcial 15 Na próxima etapa, 50 mL de cada um dos caldos de cultura da . E. co/i transformada com spa(SA)AC-Ixlink-TM2/pTrc99A e com spa(MW)AC- lxlink-TM2/pTrc99A foi submetido a cromatografia em coIuna para a purifica- ção parcial do spa (SA)AC-lxlink-TM2 e do spa(MW)ÂC-lxlink-TM2. As fra- ções do meio da E. co/i induzidas para expressão pelo mesmo método como 20 descrito acima foram diretamente usadas como amostras de protelna bruta.

Essas amostras foram misturadas com lgG sepharose®6FastF|ow (produto da GE Healthcare) equilibradas com uma solução de TST (solução tampão de 50 mM Tris, 150 mM de NaCl e 0,05% de Tween 20, pH 7,6) e incubadas em temperatura ambiente por uma hora antes de preparar uma coluna aber- 25 ta.

Para eluição, uma solução de 0,5 M de ácido acético (pH 3,4) foi usada.

Da mesma maneira conforme descrito acima, as protelnas puri- ficadas foram analisadas por coloração SDS-PAGE-CBB (Figura 6A), bem 'como pela análise de Western blotting usando um anticorpo lgG de coelho

. marcado com fosfatase alcalina (Figura 6B). ObseNe que, neste último caso, 30 a fim de examinar o estado da associacão da proteína, as amostras de pro- . teína foram adicionadas a um tampão redutor de amostra sem SDS e sub- metidas à SDS-PAGE sem aquecimento.

Como resultado, ambas as proteí-

nas de fusão foram purificados por lgG sepharose, indicando que o spa fun- dido ao tamavidin 2 reteve a atividade de ligação da lgG.

Especificamente, no experimento de coloração SDS-PAGE-CBB, duas bandas foram detecta- das nas frações solúveis nas proximidades de 40 kDa (como indicado por 5 uma seta na Figura 6A). Estas bandas foram consideradas serem as proteí-

· nas de fusão devido a sua massa molecular.

Na análise de Western, as pro- teínas de fusão foram detectadas nas frações solúveis ambas como um mo- nômero (em duas bandas) e como um tetrâmero (em várias bandas) (Figura 6B)- As bandas de monômero eram do mesmo tamanho como detectadas no 10 supracitado SDS-PAGE.

Das frações do meio enriquecido, uma única banda foi detectada em cada um dos tamanhos monômero e tetrâmero (Figura 6B). Observe também que na análise de Western sob consideração, a detecção foi possÍvel usando o anticorpo lgG de coelho marcado com fosfatase alcali- na sozinho, como no caso descrito acima, então o spa fundido ao tamavidin 15 2 foi mostrado para reter a atividade de ligação da lgG.

As soluções de proteína purificada das quais as bandas de spa(SA)^C-lx|ink-TM2 e spa(MW)AC-lxlink-TM2 foram detectadas (frações do meio de SA-7 e MW-9 na Figura 6B) foram liofilizados.

A série de opera- ções descrita acima permitiu que o spa(SA)AC-lxlink-TM2 e o spa(M\N)AC- 20 lxlink-TM2 fossem recuperados em quantidades respectivas de 10,8 µg e 12,6 µg. 6-3. lmobilização das proteínas fundidas do tamavidin 2-spa do spa, e análises comparativas das suas actividades por ELISA Para investigar o efeito da imobilização da proteína A spa em 25 um substrato por meio de fusão ao tamavidin 2, o spa(SA)L\C-lxlink-TM2 e o spa(MW)L\C-lxlink-TM2 parcialmen'tè purificados foram imobilizados em mi- " croplacas, seguidos por imobilização de um anticorpo de lectina de soja, e ·- submetidos à análise ELISA, com a sensibilidade de detecção da lectina de soja sendo usada como um Índice. -. 30 Análise ELISA O spa(SA)AC-lxlink-TM2 e o spa(MW)ÀC-lxlink-TM2 parcialmen- te purificados foram cada um condicionados com PBS (137 mM de NaCl,

2,68 mM de KCl, 8,1 mM de Na2HPO4 e 1,47 mM de KH2PO4) para dar uma concentração de 20 ng/µL e cada preparação foi carregada em alíquotas de 100 µL em uma microplaca biotinilada com 96 poços (Modelo N°. 15151; produto de PIERCE). As respectivas placas foram deixadas em repouso por 5 30 minutos em temperatura ambiente para imobilizar as proteinas de fusão

- pela ligação tamavidin-biotina.

Posteriormente, os poços individuais em cada placa foram lavados três vezes com uma solução tampão TBS contendo 0,1% de Tween 20 (TTBS). Então a imobilização do anticorpo foi realizada da seguinte forma: um anticorpo de coelho anti-SBA (produto de EY LABO- lO RATORIES) foi condicionado com PBS para dar uma concentração de 50 ng/µl e carregado em alíquotas de 100 µ1 nas placas nas quais as proteínas de fusão foram preliminarmente fixadas, bem como em placas controle, ou seja, placas hidrofóbicas (Modelo N°. 15031; produto de PIERCE) e as pla- cas revestidas com proteína A [conforme preparada pela diluição da proteína , 15 A (nacalai tesque) com PBS para dar uma concentração de 5 ng/µl, em se- guida, carregando-as em aliquotas de 50 µ1 em placas hidrofóbicas (Modelo N°. 15031; produto de PIERCE), deixando as placas em repouso durante a noite em temperatura ambiente e, posteriormente, lavando os poços indivi- duais em cada placa três vezes com uma solução tampão TBS contendo 20 O,i°/o de Tween 20 (TTBS)]; as respectivas placas foram, então, deixadas em repouso durante a noite em temperatura ambiente.

As placas biotiniladas e as placas revestidas com proteína A cada uma tinha o anticorpo de coelho anti-SBA imobilizado por uma ligação proteína A-lgG, considerando que as placas hidrofóbicas alcançaram o mesmo efeito pela ligação hidrofóbica. 25 Subsequentemente, essas placas foram lavadas três vezes com TTBS e após a adição de 300 µ1 de TTBS contendo 0,5% de BSA, as placas foram deixadas em repouso em temperatura ambiente por uma hora para

"" realizar o bloqueio.

Depois de executar outra lavagem três vezes com TTBS, soluções SBA marcadas com a peroxidase de rábano silvestre (J-OIL MIL- 30 LS) diluídas em série com TTBS de 100 ng/µl a 0,1 pg/µl foram carregadas em alíquotas de 100 µL.

Como controles, soluções SBA marcadas com a peroxidase de rábano silvestre diluída de forma semelhante foram carrega-

das em placas biotiniladas a qual o anticorpo de coelho anti-SBA não foi fi- xado e em placas hidrofóbicas.

Após a adição do SBA marcado com a pero- xidase, as respectivas placas foram deixadas em repouso em temperatura ambiente por uma hora, a fim de realizar uma reação com o anticorpo de 5 coelho anti-SBA imobilizado nelas.

Após mais três lavagens com TTBS, 100 µ1 de 1-Step"Ultra TMB- ELISA foi adicionado para detectar o SBA marcado .. com a peroxidase de rábano silvestre ligado aos poços individuais; quando uma formação de cor foi reconhecida como tendo ocorrido, 100 µ1 de 2 M de ácido sulfúrico foi adicionado para interromper a reação e a absorbância a 10 450 nm foi medida por uma placa leitora lnfinite M200 (produto da TECAN). Os valores dos dados aplicáveis foram obtidos pelo seguinte procedimento: em cada uma das faixas de concentração do SBA marcado com a peroxidase de rábano silvestre, as absorbâncias relevantes das a- : mostras controle em cada placa (que não estava imobilizada, mas na qual só 15 o SBA marcado com a peroxidase de rábano silvestre foi adicionado) tam- ' bém foram medidas e os valores de absorbância para esses controles foram subtraídos da absorbância de cada uma das faixas de concentração na qual o anticorpo de coelho anti-SBA foi imobilizado.

Além disso, a quantidade de anticorpos imobilizados através da proteína fundida spa-TM2, a quantidade 20 de anticorpos diretamente imobilizados por ligação hidrofóbica, e a quanti- dade de anticorpos imobilizados através da protelna A imobilizada por liga- . ção hidrofóbica foi quantificada para computar a quantidade de SBA marca- do com a peroxidase de rábano silvestre conforme detectado por unidade de quantidade de anticorpos imobilizados. 25 Na próxima fase, a sensibilidade de detecção do anticorpo de coelho anti-SBA usando SBA marcado com a peroxidase de rábano silvestre (SBA-HRP) foi medida.

A quantidade de SBA-HRP ligado a 1 ng do anticor- " po de coelho anti-SBA foi calculado e como foi constado, em comparação com o caso em que o anticorpo foi ligado à placa de ligação hidrofóbica, o

-. 30 antígeno SBA-HRP foi ligado em quantidades 2,3 a 4,5 vezes maiores do que quando o anticorpo foi ligado após a proteína fundida tamavidin-proteína A ser ligada à placa biotinilada (Tabela 11). A partir deste fato, foi demons-

trado que, quando o anticorpo policlonal (anticorpo lgG) foi imobiíizado no

P substrato através da proteina fundida proteína A-tamavidin, a sensibilidade 4 ò de detecção foi de aproximadamente 2-4 vezes maior do que quando foi i- mobilizada por ligação hidrofóbica. Constatou-se também que a sensibilida- 5 de foi de cerca de 2 a 3 vezes maior do que quando o anticorpo foi imobili- zado na placa na qual a proteína A foi diretamente fixada pela ligação hidro- fóbica (ver os dados para 10 pg/µl e 1 pg/µl como a concentração do SBA- HRP adicionado na Tabela 11).

[Tabela 11] 10 Tabela 11. Quantidade de SBA-HRP ligado a 1 ng de anticorpo de coelho anti-SBA Concentração de Ligação hidrofóbica spa(SA)AC- spa(SA)AC- ProteinA SBA-HRP adicionado(pg/µl) 1xlink-TM2 1xIink-TM2 100 1 4,3 4,5 3,9 _ 15 10 1 3,1 2,3 1,2 1 1 2,9 3,0 0,9 Em respectivas concentrações de SBA-HRP, os dados são mos- trados como valores relativos, com a quantidade de Iigação por ligação hi- drofóbica sendo tomada como unidade.

20 6-4. Análise das atividades de liqação da biotina das oroteínas de fusão do tamavidin 2 e do spa O Biacore 3000 (produto da BIACORE) foi usado para analisar a capacidade de ligação da biotina das proteínas fundidas spa-TM2. A protel- na de fusão, spa-TM2, secretada no meio de um caldo de cultura foi parci- 25 almente purificada pelo método descrito acima e as frações resultantes fo- ram usadas como amostras a serem analisadas.

Em um chip sensor CM5 (produto da BIACORE), uma albumina de soro bovino (BSA) biotinilada com o EZ-Link"NHS-LCLC-Biotina (30,5 Â) (produto de PIERCE e valor entre parênteses representa o comprimento do 30 ligador entre a biotina e o NHS) foi fixada pelo método de acoplamento com aminas. Usando HBS-PE (produto da BIACORE) como a solução tampão de corrida, o spa(SA)AC-|x|jnk-TM2 e o spa(MW)AC-lxlink-TM2 foram injetados

- a uma taxa de fluxo de 20 µl/min em alíquotas de 40 µ1 (por 2 min) a uma + temperatura de 25"C.

Do sensorgrama resultante, a taxa constante de liga-

v ção (Ka), a taxa constante de dissociação (Kd) e a constante de dissociação (KD) foram computadas com o auxílio do software de análise Biaevaluation 5 versão 4.1. Os resultados são mostrados na tabela 12. As proteínas de fu- são, spa(SA)AC-lxlink-TM2 e spa(MW)AC-lxlink-TM2, interagiram especifi- camente com a biotina e seus valores KD foram baixos na ordem de jj8, indicando a forte ligação à biotina. [Tabela 12] 10 Tabela 12 Resultados das análises Biacore Nome da amostra ka kd KD spa(SA)^C-|x|ink-TM2 7,6 x 10' 2,Ox1O"' 2,7x1O"' spa(MW)AC-lxlink-TM2 1,6 x 10' 1,8x1O"' 1,2x1O"' Exemplo 7. Proteína fundida do tamavidin expressando vetores 15 Neste exemplo, os vetores de expressão para expressar as pro- teinas fundidas do tarnavidin 2 na E. co/i foram construídos.

Dois vetores de expressão foram construídos, um para permitir que o tamavidin 2 fosse fun- dido ao N-terminal de uma proteína desejada, e outra para permitir que o tamavidin 2 fosse fundido ao C-terminal.

Uma explicação específica é dada 20 abaixo. 7-1. Construção de vetores para expressar proteínas fundidas do tamavidin 2 Os vetores para expressar as proteínas fundidas ao tamavidin 2 (doravante às vezes escrito como "TM2") têm tal estrutura que compreende 25 o pTrc99A (produto da Pharmacia) como uma espinha dorsal, e que entre dois sítios de reconhecimento pelas enzimas de restrição Ncol e Hindlll, TM2, um sÍtio de ligação para fundir o TM2 a uma proteína desejada, um sÍtio de clonagem múltiplo ("SCM") para incorporar o gene que codifica a proteina desejada, uma sequência para o sítio de reconhecimento por uma 30 enteroquinase ("EK") que remove a sequência TM2 depois que a protelna desejada foi expressa, e uma sequência do marcador His foi incorporada na ordem indicada abaixo.

No caso do vetor para fundir o tamavidin 2 ao N-terminal da pro- telna desejada, o gene TM2, um ligador (lxlink: GGGGSG;

V 3xlink:GGGGSGGGGSGGGGS; ou 5xlink:GGGGSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGS), a sequência do sÍtio de reconhecimento EK, MCS com a dispo- 5 sição dos sÍtios de reconhecimento da enzima de restrição na ordem de E- coR I, Sac I, Kpn ], Sma I, BamH l,.Xho ] e Not I, e uma sequência do mar- cador HlS consistindo em seis histidinas foram inseridas a jusante do sÍtio de reconhecimento da enzima de restrição Nco I em pTrc99A. Mapas vetoriais detalhados são mostrados nas Figuras 7-9. No caso do vetor para fundir o 10 tamavidin 2 ao C-terminal da proteína desejada, uma sequência do marca- dor His consistindo em seis histidinas, MCS com a disposição dos sÍtios de reconhecimento da enzima de restrição na ordem de ECOR I, Sac I, Kpn I , Sma I, BamH I, Xho I e Not I, a sequência do SÍtiO de reconhecimento EK, um ligador (lxlink: GGGGSG; 3xlink: GGGGSGGGGSGGGGS; ou 5xiink: 15 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS), e o gene TM2 foram inseridos a jusante do sÍtio de reconhecimento da enzima de restrição Nco I em p- Trc99A. Mapas vetoriais detalhados são mostrados nas Figuras 10-12. Desenhando os primers Para construir os vetores de expressão da proteína de fusão 20 TM-2, os primers para ocasionar um Iigador, sÍtio de reconhecimento EK, sÍtio MCS, sequência do marcador His, e uma sequência de codificação para o sÍtio de clivagem Nco I da enzima de restrição (CCATGG) ou o sÍtio de clivagem Hind Ill da enzima de restrição (AAGCTT) a serem unidos, quer seja a montante ou a jusante do gene TM2, foram desenhados. Especifica- 25 mente, dois primers (His-MCS-EK-lxlink-TM2-F e His-MCS-EK-3xlink-TM2-F) foram desenhados, cada um consistindo no sitio de clivagem Nco I da enzi- ma de restrição, da sequência do marcador His, sÍtio MCS, sÍtio de reconhe- cimento EK, e ligador no Iado 5' e o sÍtio N-terminal do TM2 no lado 3'; dois primers adicionais (TM2-lxlink-EK-MCS-His-R e TM2-3xlink-EK-MCS-HÍs-R) 30 também foram desenhados, cada um consistindo no SÍtio de clivagem Hind lll da enzima de restrição, sequência do marcador His, sÍtio MCS, sÍtio de reconhecimento EK, e ligador no lado 5' e uma sequência de DNA no lado 3'

codificação o sÍtio C-terminal do TM2 no sentido inverso. ObseNe que no caso em que a sequência do ligador foi o 5xjink, o comprimento do iniciador foi tão grande quanto 180mer que dois primers foram desenhados, um deles © sendo um lado 5' de 11Omer e o outro um lado 3' de 11Omer, conforme iden- 5 tificado por His-MCS-EK-5xlink-TM2-F1, His-MCS-EK-5xlink-TM2-F2, TM2- 5xlink-EK-MCS-His-R1 e TM2-5xlink-EK-MCS-His-R2.

Subsequentemente, mais dois primers foram desenhados, um sendo o TM2NtermNcoI-F e consistindo na porção 5' do TM2 e uma sequên- cia de codificação a montante para o SÍtio de clivagem Nco I da enzima de 10 restrição, e o outro sendo o TM2CtermHindlll-R e consistindo na porção 3' do TM2 e uma sequência de codificação a jusante do sítio de clivagem Hind lll da enzima de restrição em uma direção inversa. Os respectivos primers para construir os vetores de expressão da proteína fundida ao tamavidin são identificados na Tabela 13.

15 [Tabela 13-1] Tabela 13. Primers para construir os vetores de expressão da proteína fun- dida ao tamavidin Nome Sequência (5'-3') - ComprimentQ TM2NtermNotl-F AAACCATGGGCTCAGACGTTCAATCTTCA 29mer 20 TM2-1xlink-EK-MCS-His-R gnTAAgcTTTcATcAgccgTggTgATggTgATggTggcccgcggccgcTcgAggATc cc GGGTACCGAGCTCGAATTCCGGCTTATCGTCATCGTçaccgctgccaccgccaccCTTCA ACCTCGGTGCGCG 133mer 25 TM2-3xlink-EK-MCS-His-R gTTTAAgcmrcATcAgccATggTgATggTgATggTggcccgcggccgcTcgAggATc cc GGGTACCGAGCTCGAATTCCGGmATCGTCATçGTCgctgccaccgccaccgctgccac cgccaccgctgccaccgccaccCTTCAACCTCGGTgCgCg 160mer 30 TM2-5xlink-EK-MCS-His-R1 GGç_[ATçGmATCmgctgccaccgccaccgctgccaccgccaccgctgccaccgcca ccgctgccaccgccaccgctgccaccgccaccCTTCAACCTCGGTGCGCG 11Omer

TM2-5xlink-EK-MCS-His-R2 g i i IAAGC i i i CATCAGCCATGGTGATGGTGATGGTGgcccgcggccgctcgaggatccc . gggtaccgagctcgaattccggçTTATTCGIçgctgccaccgcca 11Omer His-MCS-EK-1xlink-TM2-F 5 CAAACCATGGCCCACCATCACCATCACCATGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGATCC

TC GAGCGGCCGCGGGACGATGAçGATAAGggtggcggtggcagcggtTCAGACGTTCAATCT TCA 123mer [Tabela 13-2] 10 His-MCS-EK-3xlink-TM2-F

CAAACCATGGCCCACCATCACCATCACCATGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGATCC

TC GAGCGGCCGCGGGAC(àATGAÇGATAAGggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcggt : ggcggtggcagcTCAGACGTTCAATCTTCA 150mer 15 HIs-MCS-EK-5xlink-TM2-F1 GGGACGATGAÇGAIA&àggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcggtggcggtggca gcggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcTCAGACGTTCAATCTTCA ' llOmer His-MCS-EK-5xlink-TM2-F2

CAAACCATGGCCCACCATCACCATCACCATGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGATCC 20 TC GAGCGGCCGCGGGAÇGATGACGATAAGggtggcggtggcagcggtggcgg llOmer TM2çtermHinçj||l-R GTTTAAGC i I i i ACTTçAAççTçGGTGçGCG 3Wer Os sÍtios de reconhecimento da enzima de restrição estão subli- nhados por linhas sólidas.

25 As sequências do marcador His estão sublinhadas por linhas pontilhadas. Os sÍtios que codificam a sequência de reconhecimento EK es- tão sublinhados por linhas onduladas. As sequências de ligação estão escritas em letras minúsculas. 30 As sequências individuais correspondem a SEQ ID NOS: 42-51 contados a partir do topo.

PCR

Para construir os vetores de expressão da proteína fundida ao TM2, PCR de uma fase foi realizado quando o comprimento do ligador foi

0 lxlink ou 3xlink, considerando que o PCR de duas fases foi realizado no ca- so do 5xlink.

Quando o comprimento do ligador foi lxlink ou 3xlink, uma se- 5 quência compreendendo um ligador, sequência de reconhecimento EK, sÍtio MCS, e sequência do marcador His, quer seja a montante ou a jusante do gene TM2 foi amplificado utilizando os primers TM2NtermNotl-F e TM2- lxlink-EK-MCS-His-R ou TM2-3xlink-EK-MCS-His-R, ou os primers HÍS-MCS- Ek-lxlink-TM2-F ou His-MCS-EK-3xlink-TM2-F e TM2CtermHindlll-R, com 10 um pIasmídeo incorporando o gene TM2 no vetor pTrc99A (ver WO02/072817) sendo usado como um modelo.

Quando o comprimento do Iigador foi 5xlink, uma sequência compreendendo um ligador, uma sequên- cia de reconhecimento EK, e parte do sÍtio MCS, quer seja a montante ou a jusante do gene TM2, foi amplificado usando os primers TM2NtermNotl-F e 15 TM2-5xlink-EK-MCS-HÍs-R1 ou os primers HÍs-MCS-EK-5xlink-TM2-F1 e TM2CtermHindll(-R, com um plasmideo incorporando o gene TM2 no vetor pTrc99A (ver WO02/072817) sendo usado como um modelo.

As condições de reação do PCR foram as seguintes: para uma solução de reação de 20 µ1, 500 ng do DNA modelo, 10 µ1 do tampão 2 X 20 GC ll (TakaRa), 1,6 µ1 de 2,5 mM dNTP, 10 pmols de cada um dos primers, e 0,1 µ1 de 5 U/µl Pyrobest foram adicionados, e usando GeneAmp PCR System 9600 (PERKIN ELMER), um ciclo de 96°C x 3 min, 25 ciclos de 95° Cx1min,60°Cx1mine72°Cx2min,eumciclode72°Cx6minforam realizados.

Como resultado, três produtos do PCR foram obtidos para a se- 25 quência em qual o TM2 foi fundido ao N-terminal, com respectivos tamanhos de 546 bp no caso de lxlink, 573 pb no caso de 3xlink, e 523 pb no caso de 5xlink; três produtos de PCR adicionais foram obtidos para a sequência em que o TM2 foi fundido ao C-terminal, com respectivos tamanhos de 538 bp no caso de lxlink, 565 pb no caso de 3xIink e 525 pb no caso de 5xIink . Os 30 produtos do PCR obtidos no caso de 5xlink foram submetidos à eletroforese de agarose em uma solução tampão TAE usando agarose (Agarose Tipo ll: SIGMA).

Cada um dos fragmentos de DNA foi excluído junto com o gel e recuperado usando um kit de extração de gel QIAEX ll (QIAGEN). O método

. de extração foi de acordo com as instruções do kit.

Com os fragmentos de 5xlink usados como modelos, a segunda fase do PCR foi realizada usando 5 os primers TM2NtermNotl-F e TM2-5xlink-EK-MCS-His-R2 no caso da se- quência em que o TM2 foi fundido ao N-terminal e os primers H1S-MCS-EK- . 5xlink-TM2-F2 e TM2CtermHindlll-R no caso da sequência em que o TM2 foi fundido ao C-termina!. As condições de reação foram as mesmas que na primeira fase.

Como resultado, dois produtos do PCR foram obtidos, com os 10 respectivos tamanhos de 603 bp no caso da sequência em que o TM2 foi fundido ao N-terminal e 595 pb no caso da sequência em que o TM2 foi fun- dido ao C-terminal.

Clonaqem Os fragmentos obtidos por PCR, que continha o ligador, se-

, 15 quência de reconhecimento EK, sÍtio MCS, e sequência do marcador His, quer seja a montante ou a jusante do gene TM2, foram clonados no vetor pCR4 blunt TOPO (produto da lnvitrogen). A reação de ligação foi de acordo com as instruções contidas no kit do vetor.

O DNA foi transferido para a E. co/i TBI por eletroporação e o DNA plasmidial foi extraído de acordo com o 20 método habitual (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory ma- nual, 2" edição). Os clones verificados para terem inserções foram tratados da seguinte forma: usando o iniciador M13 (TakaRa), a sequência de base de cada produto do PCR foi determinada a partir de ambas as suas extremi- dades com um sequenciador de fluorescência ABI PRISM (modelo 310 Ge- 25 netic Analyzer, Perkin Elmer) para confirmar que não tinha nenhuma muta- ção do gene original.

O plasmídeo incorporando os genes de interesse foi digerido em dobro com Nco I e Hind lll e a purificação do gel foi realizada pelo método supramencionado para recuperar um fragmento de DNA.

O " fragmento de DNA recuperado foi ligado por um kit de ligação (produto da 30 TakaRa) ao vetor de expressão pTrc99A da E. co/i que havia sido prelimi- . narmente digerido com Nco I e Hind lll.

O produto de ligação foi transformado em E. co/i TBI e DNA plasmidial foi extraído e analisado por enzimas de restrição de acordo com o . método habitual para verificar a presença dos genes inseridos, no qual os

J seguintes vetores de expressão das protelnas fundidas ao tamavidin 2 foram completados: TM2-lxlink-EK-MCS-His/pTrc99A (Figura 7), TM2-3xlink-EK- 5 MCS-His/pTrc99A (Figura 8), TM2-5xIink-EK-MCS-His/pTrc99A (Figura 9) , His-MCS-EK-lx|inkTTM2/pTrc99A (figura 10), H1s-MCS-EK-3xlink- TM2/pTrc99A (figura 11), e H1s-MCS-EK-5xlink-TM2/pTrc99A (figura 12), que são respectivamente retratados nas SEQ ID NOS: 77-82.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para ligar uma protelna a um carreador, que com- preende: preparar um carreador ligado à biotina; preparar uma protelna de fusão tendo a proteína ligada a um tamavidin; e ligar a proteína ao carreador através de ligações tamavidin- biotina.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o tamavi- lO din é selecionado de: (a) uma proteína constituída de uma sequência de aminoácidos com deleção, substituição ou adição de um ou mais aminoácido na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e tendo atividade de ligação à biotina, ou (b) uma proteína constituída de uma sequência de aminoácido compat1ilhando uma identidade de 60% ou mais com a SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NO: 4 e tendo atividade de ligação à biotina, ou (C) uma proteína constituída de uma sequência de aminoácido daSEQIDNO:2edaSEQIDNO:4;ou (d) uma proteína constituída de uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico hibridizável sob condições estritas, com um filamento complementar à sequência de base da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 3 e tendo atividade de ligação à biotina.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, em que a proteína é selecionada do grupo constituído de anticorpos ou fragmentos do mesmo, proteínas antigênicas, enzimas, lectinas, peptídeos, proteína A, proteína G e proteína L.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que o carreador é selecionado do grupo constituído de grânulos, ' partículas magnéticas, filmes finos, microtubos, filtros, placas, microplacas, " nanotubos de carbono e chips sensores.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o tamavidin e a proteína são ligados através de um ligador para constituir a proteína de fusão. >

6. Modo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o tamavidin e a proteína são ligados através de um ligador, - constituído de seis ou mais aminoácidos para formar a proteina de fusão. 5

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a proteína de fusão tem ainda uma ligação da sequência IÍ- der.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, em que a biotina e o carreador estão ligados através de um ligador 10 superior a 13,5 À de comprimento.

9, Carreador da proteína de ligação fundido ao tamavidin no qual uma proteína de fusão tendo uma proteína ligada a um tamavidin é li- gada a um carreador ligado à biotina através de ligações tamavidin-biotina.

10. Vetor de expressão para expressar uma proteína de fusão 15 do tamavidin que compreende uma codificação do ácido nucleico para uma proteína de fusão tendo um tamavidin ligado a uma proteína através de um ligador.