CN104830827B - 一种磁性固定化荧光素酶的制备方法 - Google Patents

一种磁性固定化荧光素酶的制备方法 Download PDF

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本发明涉及一种磁性固定化荧光素酶的制备方法。其制备方法包括以下步骤：（一）制备四氧化三铁磁性微球；（二）荧光素酶的固定。制得的磁性固定化酶具有良好的磁响应性，重复利用依然能够保持高酶活力。本发明的制备方法简单，可操作性强，同时能够节约制备成本，适于推广普及，进行大规模工业应用。

Description

一种磁性固定化荧光素酶的制备方法
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种磁性固定化荧光素酶的制备方法。
背景技术
磁性高分子微球是近年发展起来的一种新型磁性材料，是通过适当方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性复合微球不仅具有普通高分子微球的众多特性还具有磁响应性。目前，磁性复合微球已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等诸多领域。制备磁性高分子微球的高分子材料主要有天然高分子和合成高分子。天然高分子有纤维素、明胶等。合成高分子材料主要有聚苯乙烯、聚丙烯酸及其共聚物、聚酰胺类、和聚苯胺等。主要方法有包埋法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法及原子转移自由基聚合法等。
固定化酶是通过物理的或化学的方法，将酶分子束缚在载体上，在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控等优点。
传统酶的固定化方法虽在一定程度上可以增强生物催化剂的稳定性，但增强幅度有待进一步提高，并且在此过程中，生物催化剂酶催化活力通常损失严重。运用当代高新技术和设计合成新型载体以及两者的有机结合是引人注目的研究动向。因此目前不断地有新的载体和技术引入每的固定化领域，如：无载体固定化、微波/超声辅助的固定化、阳光照射、离子液体，电辅助固定化等等，且固定化生物催化剂的应用也越来越广泛地应用于医疗、生物医药、环境保护、食品工业、化学工业、能源领域等。
发明内容
本发明的一个目的是一种磁性固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O和Fe2(SO4)3·9H2O加入反应介质中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至85℃，加入碱溶液进行反应，反应120分钟以上，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍以上，然后将其分散于有机载体中，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、表面活性剂、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入引发剂反应，时间为200分钟以上；
（6）熟化；
（7）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍以上，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定：
（1）将荧光素酶加入缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为1.5-3g/L，浸泡1小时以上；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）按体积比加入0.1-0.2%tween80、0.1-0.2%tween20、TritonX-1000.1-0.2%和5-7%固化剂，搅拌，固化200分钟以上；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用缓冲液冲洗。
所述有机载体为正己烷和异丙醇的混合物，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3。
所述表面活性剂为CTAB和苯扎溴铵。
所述熟化的温度为75-80℃，时间为3小时以上。
所述引发剂为过硫酸钾，加入0.25‰。
步骤（二）（1）中使用磷酸盐缓冲液，步骤（二）（5）中使用hepes缓冲液冲洗10遍以上。
步骤（二）在温度4-20℃环境中进行。
在步骤（二）过程中加入0.05-0.1%的BSA。
所述固化剂为三聚磷酸钠、戊二醛和sulfo-NHS（N-羟基硫代琥珀酰亚胺）中的一种或几种。优选为三聚磷酸钠和sulfo-NHS。
本发明制备的微球生物相容性好，非常适于基因测序的过程中用于酶的固定。本发明的制备方法中的步骤易于操作，原料成本低，能够适应大规模的工业生产。以本发明制备的微球粒径较小而均一，能够顺利的进行核酸测序反应酶的固定，得到的微球质地均匀，有较好的理化稳定性，磁响应性高，还可应用于生物工程中大分子的连接与分离。聚甲基丙烯酸甲酯微球透光率大，便于测序仪的信号读取，使噪点更清晰、测算更精确。经过本发明的方法处理后，荧光素酶性质非常稳定，效率提高，催化反应过程容易控制，机械强度高，可重复使用，适合应用于高通量的基因组测序过程中。
具体实施方式
实施例1
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O0.1mol和Fe2(SO4)3·9H2O0.3mol加入1L去离子水和乙二醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至92℃，加入3molKOH，0.03molFe(OH)2，0.09molFe(OH)3，反应120分钟，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入占乳液体系重量比0.25‰的过硫酸钾，时间为230分钟；
（6）熟化，75℃，时间为3小时；
（7）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗6遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于12-18℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为2.5g/L，再加入0.08%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）加入0.15%tween80、0.15%tween20、0.2%TritonX-100、2%三聚磷酸钠和4%sulfo-NHS，持续搅拌，固化230分钟；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗10遍；
实施例2
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O0.22mol和Fe2(SO4)3·9H2O0.3mol加入1L去离子水，乙醇和乙二醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至90℃，加入碱溶液进行反应，反应130分钟，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍以上，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入占乳液体系重量比0.25‰的过硫酸钾，时间为210分钟；
（6）熟化，80℃，时间为3.5小时；
（7）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于8-12℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为3g/L，再加入0.1%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）加入0.1%tween80、0.2%tween20、0.1%TritonX-100和5%戊二醛，持续搅拌，固化200分钟；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗15遍；
实施例3
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O0.15mol和Fe2(SO4)3·9H2O0.35mol加入1L去离子水，乙醇和乙二醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至85℃，加入碱溶液进行反应，反应120分钟以上，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入占乳液体系重量比0.25‰的过硫酸钾，时间为200分钟；
（6）熟化，75℃，时间为3小时；
（7）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗8遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于4-8℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为1.5g/L，再加入0.05%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）加入0.2%tween80、0.1%tween20、0.2%TritonX-100和7%sulfo-NHS，持续搅拌，固化200分钟以上；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗10遍；
实施例4
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O0.25mol和Fe2(SO4)3·9H2O0.31mol加入1L去离子水和乙醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至92℃，加入3.3molKOH，反应120分钟，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗15遍，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入占乳液体系重量比0.25‰的过硫酸钾反应，时间为230分钟；
（6）熟化，78℃，时间为4小时；
（7）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗10遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于18-20℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为2.5g/L，再加入0.06%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）加入0.15%tween80、0.1%tween20、0.2%TritonX-100、1%三聚磷酸钠、3%戊二醛和2.5%sulfo-NHS，持续搅拌，固化230分钟；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗16遍；
对比例1
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O0.1mol和Fe2(SO4)3·9H2O0.3mol加入1L去离子水和乙二醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至92℃，加入1.5molKOH，0.04molFe(OH)2，0.03molFe(OH)3，反应60分钟，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为10:1，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）熟化，75℃，时间为1小时；
（6）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗6遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于30-33℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为2.5g/L，再加入0.08%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）加入0.1%TritonX-100和2%戊二醛，持续搅拌，固化100分钟；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗10遍；
测定实施例1和实施例2的酶活力和酶活力回收率：
表1
由表1可知，本申请实施例1和实施例2的酶活力分别达到了46.87U/g和46.36U/g，显著优于对比例1的37.25U/g。本发明的酶活力回收率相比于对比例也有非常明显的提高，分别提高了30.73%和29.31%。表明本发明的酶机械强度高，可重复使用，非常适合应用于高通量的基因组测序过程中。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种磁性固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O和Fe2(SO4)3·9H2O加入反应介质中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至85℃，加入KOH、Fe(OH)2和Fe(OH)3的混合溶液进行反应，反应120分钟以上，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍以上，然后将其分散于体积比为2:3的正己烷和异丙醇中，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入占乳液体系重量比为0.25‰的过硫酸钾，反应时间为200分钟以上；
（6）熟化；
（7）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍以上，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为1.5-3g/L，浸泡1小时以上；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）按体积比加入0.1-0.2%tween80、0.1-0.2%tween20、TritonX-1000.1-0.2%以及总量为5-7%的三聚磷酸钠和sulfo-NHS，搅拌，固化200分钟以上；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗10遍以上。
2.如权利要求1所述的磁性固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述熟化的温度为75-80℃，时间为3小时以上。
3.如权利要求1所述的磁性固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，步骤（二）在温度4-20℃环境中进行。
4.如权利要求1所述的磁性固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，在步骤（二）过程中加入0.05-0.1%的BSA。
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