CN104928274B - 一种聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法 - Google Patents
一种聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法。方法包括制备磁性微球和荧光素酶的固定。经过本发明的方法处理后，荧光素酶性质非常稳定，效率提高，催化反应过程容易控制，机械强度高，可重复使用，非常适合应用于高通量的基因组测序过程中。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法。
背景技术
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数，它和线条这两种形式主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应；薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学中；酶管机械强度较大，宜用于工业生产。
磁性高分子微球是一类性能优良的功能高分子材料，是以合成高分子或生物高分子为载体，通过吸附和包埋Fe2O3、Fe3O4或其它磁性粒子，形成具有磁性的功能高分子材料。磁性高分子微球是核壳式结构的微小胶囊，制备磁性微球的磁核主要是Fe3O4等金属氧化物，壳层主要由两类物质组成：一类是合成高分子，主要有聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酞胺、聚乙烯醇、硝化纤维及聚乙烯醉缩丁醛等，不可生物降解；另一类是生物高分子，主要有淀粉、明胶、白蛋白、聚乳酸、藻酸钙等，可生物降解。磁性高分子微球的壳层与磁核的结合主要是通过范德华力、氢键、配位键的作用，高分子借助于这些作用力，牢牢地束缚于金属氧化物晶体表面，形成坚实的球状结构，作为固定化酶载体的顺磁性高分子微球。
发明内容
本发明的一个目的是一种聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法，包括以下步骤：
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O和Fe2(SO4)3·9H2O加入反应介质中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至85℃，加入3mol KOH进行反应，反应120分钟以上，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍以上，然后将其分散于有机载体中，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、表面活性剂、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入引发剂反应，时间为200分钟以上；
（6）熟化；
（7）使用磁力架进行磁性分离；
（8）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍以上，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定：
（1）将荧光素酶加入缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为1.5-3g/L，浸泡1小时以上；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）按体积比加入0.1-0.2%tween80、0.1-0.2%tween20、TritonX-100 0.1-0.2%和5-7%固化剂（ N-羟基硫代琥珀酰亚胺），持续搅拌，固化200分钟以上；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用缓冲液冲洗；
（6）真空干燥。
所述有机载体为正己烷和异丙醇的混合物，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3。
所述表面活性剂为CTAB和苯扎溴铵。
所述熟化的温度为75-80℃，时间为3小时以上。
所述引发剂为过硫酸钾，加入0.25‰。
步骤（二）（1）中使用磷酸盐缓冲液，步骤（二）（5）中使用hepes缓冲液冲洗10遍以上。
步骤（二）在温度4-20℃环境中进行。
在步骤（二）过程中加入0.05-0.1%的BSA。
所述真空干燥时压力为30-50Pa。
所述固化剂为三聚磷酸钠、戊二醛和sulfo-NHS（ N-羟基硫代琥珀酰亚胺）中的一种或几种。优选为2%三聚磷酸钠和4.5%sulfo-NHS。
本发明制备的微球生物相容性好，非常适于基因测序的过程中用于酶的固定。本发明的制备方法中的步骤易于操作，原料成本低，能够适应大规模的工业生产。以本发明制备的微球粒径较小而均一，能够顺利的进行核酸测序反应酶的固定，得到的微球质地均匀，有较好的理化稳定性，磁响应性高，还可应用于生物工程中大分子的连接与分离。聚甲基丙烯酸甲酯微球透光率大，便于测序仪的信号读取，使噪点更清晰、测算更精确。经过本发明的方法处理后，荧光素酶性质非常稳定，效率提高，催化反应过程容易控制，机械强度高，可重复使用，适合应用于高通量的基因组测序过程中。
具体实施方式
实施例1
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O 0.1mol和Fe2(SO4)3·9H2O 0.3mol加入1L去离子水和乙二醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至92℃，加入3mol KOH，0.03mol Fe(OH)2，0.09mol Fe(OH)3，反应120分钟，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）按体积比加入占乳液体系重量比0.25‰的过硫酸钾，时间为230分钟；
（6）熟化，75℃，时间为3小时；
（7）使用磁力架进行磁性分离；
（8）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗6遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于12-18℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为2.5g/L，再加入0.08%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）加入0.15%tween80、0.15%tween20、0.2% TritonX-100、2%三聚磷酸钠和4.5%sulfo-NHS，持续搅拌，固化220分钟；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗10遍；
（6）真空干燥压力为40Pa。
实施例2
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O 0.22mol和Fe2(SO4)3·9H2O 0.3mol加入1L去离子水，乙醇和乙二醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至90℃，加入碱溶液进行反应，反应130分钟，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍以上，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入占乳液体系重量比0.25‰的过硫酸钾，时间为210分钟；
（6）熟化，80℃，时间为3.5小时；
（7）使用磁力架进行磁性分离；
（8）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于8-12℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为3g/L，再加入0.1%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）按体积比加入0.1%tween80、0.2%tween20、0.1% TritonX-100和5%sulfo-NHS，持续搅拌，固化200分钟；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗15遍；
（6）真空干燥压力为50Pa。
实施例3
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O 0.15mol和Fe2(SO4)3·9H2O 0.35mol加入1L去离子水，乙醇和乙二醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至85℃，加入碱溶液进行反应，反应120分钟，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入占乳液体系重量比0.25‰的过硫酸钾，时间为200分钟；
（6）熟化，75℃，时间为3小时；
（7）使用磁力架进行磁性分离；
（8）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗8遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于4-8℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为1.5g/L，再加入0.05%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）按体积比加入0.2%tween80、0.1%tween20、0.2% TritonX-100和7%sulfo-NHS，持续搅拌，固化200分钟以上；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗10遍；
（6）真空干燥压力为30Pa。
实施例4
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O 0.25mol和Fe2(SO4)3·9H2O 0.31mol加入1L去离子水和乙醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至92℃，加入3.3mol KOH，反应120分钟，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗15遍，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入占乳液体系重量比0.25‰的过硫酸钾反应，时间为230分钟；
（6）熟化，78℃，时间为4小时；
（7）使用磁力架进行磁性分离；
（8）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗10遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于18-20℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为2.5g/L，再加入0.06%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）按体积比加入0.15%tween80、0.1%tween20、0.2%TritonX-100、1.5%三聚磷酸钠、2%戊二醛和2.5 %sulfo-NHS，持续搅拌，固化230分钟；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗16遍；
（6）真空干燥压力为45Pa。
对比例1
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O 0.1mol和Fe2(SO4)3·9H2O 0.3mol加入1L去离子水和乙二醇的混合液中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至92℃，加入1.5mol KOH，0.04mol Fe(OH)2，0.03mol Fe(OH)3，反应60分钟，然后降至室温；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍，然后将其分散于正己烷和异丙醇中，其中正己烷和异丙醇的体积比为10:1，形成磁流体；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴铵、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）熟化，75℃，时间为1小时；
（6）使用磁力架进行磁性分离；
（7）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗6遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定，于25-28℃环境中：
（1）将荧光素酶加入磷酸盐缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为2.5g/L，再加入0.08%的BSA，浸泡1小时；
（2）加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）加入0.1% TritonX-100和2%sulfo-NHS，持续搅拌，固化100分钟；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用hepes缓冲液冲洗10遍；
（6）真空干燥压力为40Pa。
测定实施例1和实施例2的酶活力和酶活力回收率：
表1
由表1可知，本申请实施例1和实施例2的酶活力分别达到了47.12U/g和46.96U/g，显著优于对比例1的38.63U/g。本发明的酶活力回收率相比于对比例也有非常明显的提高，分别提高了30.07%和29.89%。以上结果表明由本发明得到的酶机械强度高，可重复使用，非常适合应用于高通量的基因组测序过程中。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）制备四氧化三铁磁性微球：
（1）将水合物FeSO4·7H2O和Fe2(SO4)3·9H2O加入反应介质中，通入氮气，搅拌至均相体系；
（2）升温至85℃，加入碱溶液进行反应，反应120分钟以上，然后降至室温；所述碱液为KOH、Fe(OH)2和Fe(OH)3中的两种或三种；
（3）将反应得到的Fe3O4以去离子水冲洗10遍以上，然后将其分散于有机载体中，形成磁流体；所述有机载体为正己烷和异丙醇的混合物，其中正己烷和异丙醇的体积比为2:3；
（4）将步骤（3）得到的磁流体、甲基丙烯酸甲酯、表面活性剂、二乙烯基苯、正己烷、聚乙烯醇、过氧化苯乙酰和去离子水加入反应釜中，在恒温下不断搅拌形成乳液；
（5）加入引发剂反应，时间为200分钟以上；
（6）熟化；
（7）使用磁力架进行磁性分离；
（8）冷却，筛选，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍以上，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球；
（二）荧光素酶的固定：
（1）将荧光素酶加入缓冲液中，使荧光素酶的终浓度为1.5-3g/L，浸泡1小时以上；
（2）加入在步骤（一）（8）得到的聚甲基丙烯酸甲酯微球，搅拌；
（3）按体积比加入0.1-0.2%tween80、0.1-0.2%tween20、TritonX-100 0.1-0.2%和5-7%固化剂，持续搅拌，固化200分钟以上；
（4）使用磁力架进行磁性分离，倒掉上层清液；
（5）使用缓冲液冲洗；
（6）真空干燥；
其中，所述固化剂为三聚磷酸钠、戊二醛和N- 羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或几种。
2.如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为CTAB和苯扎溴铵。
3.如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述熟化的温度为75-80℃，时间为3小时以上。
4.如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述引发剂为过硫酸钾，加入量占乳液体系重量的0.25‰。
5.如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，步骤（二）（1）中使用磷酸盐缓冲液，步骤（二）（5）中使用hepes缓冲液冲洗10遍以上。
6.如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，步骤（二）在温度4-20℃环境中进行。
7.如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述真空干燥时压力为30-50Pa。
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| EP2184356A1 (en) * | 2007-08-28 | 2010-05-12 | Japan Tobacco Inc. | Method of binding protein to support using tamavidin |
| CN102049225A (zh) * | 2009-10-30 | 2011-05-11 | 北京大学深圳研究生院 | 一种超顺磁性聚合物微球的制备方法 |
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