CN103357359A - 一种复合免疫磁微粒及其制备方法 - Google Patents

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张捷李
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Abstract

本发明公开了一种复合免疫磁微粒及其制备方法。本发明的复合免疫磁微粒包括磁性四氧化三铁纳米内核,还包括二氧化硅壳层,在该二氧化硅壳层表面修饰有氨基,该氨基偶联需富集的目标生物分子的抗体。本发明的复合免疫磁微粒的制备方法简便易行,无需高温高压条件和特殊仪器设备,能大量制备,且重复性好,适合工业化应用。

Description

一种复合免疫磁微粒及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于免疫技术领域,具体涉及一种复合免疫磁微粒及其制备方法。

背景技术

[0002] 免疫磁微粒是指兼具磁性和免疫活性,粒径处于纳米或微米尺度的颗粒。由于粒径很小使得悬浮性好,且比表面积很大,再结合其内核的顺磁性和表层的免疫活性,即可在外加磁场中快速、高效地分离、富集目标生物分子,因此在病毒检测、细胞分选、靶向药物、微生物分离与富集等领域具有简便快捷、灵敏度高、特异性好等特点,有着广泛的应用前

旦 [0003] 目前免疫磁微粒(Imuunomagtetic Microparticles, IMMP)的制备方法和形态结构有多种。公开号分别为 CN101241130A、CN101183589A、CN100573747C 和 CN1667413A 的中国发明专利均为包覆聚苯乙烯等有机高分子聚合物的结构,公开号分别为CN1015196482B和CN1872028A的中国发明专利是通过修饰和活化羧基制备出免疫磁性微粒。目前这些磁微粒的制备技术尚存在的主要问题是工艺条件要求较高、制备过程繁琐、涉及有机毒性物质、需要大型仪器设备、批间重复性差、难以大量稳定制备、生物活性分子偶联效率低等,因此在工业化应用上还是 受到一定限制。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷,提供一种复合免疫磁微粒。

[0005] 本发明的另一目的在于提供该复合免疫磁微粒的制备方法。

[0006] 本发明的技术方案如下:

[0007] 一种复合免疫磁微粒,包括磁性四氧化三铁纳米内核,还包括二氧化硅壳层,在该二氧化硅壳层表面修饰有氨基,该氨基偶联需富集的目标生物分子的抗体。

[0008] 本发明的另一技术方案如下:

[0009] 一种上述复合免疫磁微粒的制备方法,包括如下步骤:

[0010] (I)制备磁性四氧化三铁纳米内核;

[0011] (2)通过化学反应在步骤(I)制得的磁性四氧化三铁纳米内核外包覆二氧化硅壳层,得具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒;

[0012] (3)在上述二氧化硅壳层表面通过水解反应修饰上氨基,得修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒;

[0013] (4)在上述氨基上偶联需富集的目标生物分子的抗体,即得所述复合免疫磁微粒。

[0014] 在本发明的一个优选实施方案中,所述步骤(I)具体为:将三价铁离子和二价铁离子溶于水中,室温下搅拌溶解后加入氨水,继续搅拌反应40-70分钟,反应结束后用水洗涤,即得磁性四氧化三铁纳米内核。其中优选的,上述三价铁离子的终浓度为15-30mmol/L,二价铁离子的终浓度为7.5-20mmol/L,氨水的终浓度为0.5-2.5%。

[0015] 在本发明的一个优选实施方案中,所述步骤(2)具体为:将步骤(I)所制得的磁性四氧化三铁纳米内核用乙醇溶解,加入聚乙二醇、氨水和正硅酸乙酯,室温下搅拌反应11小时以上,反应结束后用水洗涤,即得具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。其中优选的,乙醇为50-95%的乙醇,聚乙二醇的终浓度为0.5-4%,氨水的终浓度为0.1-0.5%,正硅酸乙酯的终浓度为0.1-0.5%。

[0016] 在本发明的一个优选实施方案中,所述步骤(3 )具体为:将步骤(2 )制备的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒溶于乙醇中,加入氨水、四甲基氢氧化铵(TMA)和Y-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMOS),室温下搅拌反应24小时以上,反应完成后用水清洗,即得修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。其中优选的,乙醇为50-80%的乙醇,氨水终浓度为0.05-0.5%,四甲基氢氧化铵的终浓度为0.5-2.0%,Y -氨丙基三甲氧基硅烷的终浓度为

2.5-10.0%。

[0017] 在本发明的一个优选实施方案中,所述步骤(4)具体为:将步骤(3)制得的修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒用活化缓冲液清洗后,加入四甲基氢氧化铵和戊二醛,室温震荡反应0.5-1小时,再用偶联缓冲液清洗,加入需富集的目标生物分子的抗体,室温震荡进行偶联反应I小时以上,PBS清洗一遍,封闭0.5小时以上后重悬于保存液中,即得所述复合免疫磁微粒。其中优选的,所述活化缓冲液包括MES缓冲液和PBS缓冲液,所述偶联缓冲液包括MES缓冲液、Tris-Cl缓冲液、PBS缓冲液和碳酸盐缓冲液,所述保存液为包括1%BSA、0.5%酪蛋白和1%甘氨酸的PBS (磷酸盐)缓冲液;所述四甲基氢氧化铵的终浓度为0.1-0.5%,所述戊二醛的终浓度为2.5-10%。

[0018] 本发明的有益效果是:

[0019] 1、本发明的复合免疫磁微粒,包括磁性四氧化三铁纳米内核,还包括二氧化硅壳层,在该二氧化硅壳层表面修饰有氨基,该氨基偶联需富集的目标生物分子的抗体,生物活性分子偶联效率高,可在外加磁场中快速、高效地分离、富集目标生物分子,因此在病毒检测、细胞分选、靶向药物、微生物分离与富集等领域具有简便快捷、灵敏度高、特异性好等特点,有着广泛的应用前景;

[0020] 2、本发明的复合免疫磁微粒的制备方法简便易行,无需高温高压条件和特殊仪器设备,能大量制备,且重复性好,适合工业化应用。

具体实施方式

[0021] 以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

[0022] 实施例1

[0023] 乙肝表面抗原(HBsAg)免疫磁微粒的制备

[0024] (I)制备磁性四氧化三铁纳米内核:称取20mmol/L的Fe3+和10.0mmoI/L的Fe2+于150ml纯水中,室温以600rpm速度进行磁力搅拌,溶解后加入1.25%的氨水,继续磁力搅拌反应I小时,反应结束后用纯水洗涤5次,即得所述磁性四氧化三铁纳米内核。

[0025] (2)制备具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒:将步骤I制备的四氧化三铁纳米磁核分散于150ml80%乙醇中,加入2%的PEG4000、0.25%的氨水和0.2%的TE0S,室温下磁力搅拌反应16小时,反应结束后用纯水清洗5遍,即得所述具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。

[0026] (3)制备修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒:将步骤2制备的二氧化硅磁微粒分散于150ml60%乙醇中,加入0.1%的氨水、0.1%的TMA、5%的APTMOS,室温磁力搅拌反应20h。反应结束后用纯水清洗5遍,清洗后分散于150ml纯水中,即得所述修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。

[0027] (4)制备复合免疫磁微粒:将步骤3的氨基化二氧化硅磁微粒用IOm PBS缓冲液清洗3遍,加入0.25%TMA和5%的戊二醛,室温振荡混匀45min,用20mM Tris-HCl缓冲液清洗2遍,加入20ug/mL的sAg抗体,室温振荡反应30min, IOmM PBS清洗I遍,加入0.5%BSA封闭lh,重悬于保存液,即得所述复合免疫磁微粒。

[0028] 实施例2

[0029] 甲胎蛋白(AFP)免疫磁微粒的制备

[0030] (I)制备磁性四氧化三铁纳米内核:称取30mmol/L的Fe3+和20mmol/L的Fe2+于150ml纯水中,室温下以600rpm速度进行磁力搅拌,加入2.5%的氨水,继续磁力搅拌反应2小时,纯水洗涤5次,即得所述磁性四氧化三铁纳米内核。

[0031] (2)制备具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒:将步骤I制备的四氧化三铁纳米磁核分散于150ml95%乙醇中,加入4%的PEG4000、0.5%的氨水和0.5%的TE0S,室温下磁力搅拌反应24小时,反应结束后用纯水清洗5遍,即得所述具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。

[0032] (3)制备修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒:将步骤2制备的二氧化硅磁微粒分散于150ml80%乙醇中,加入0.5%的氨水、2%的TMA、10%的APTM0S,室温磁力搅拌反应24h。反应结束后用纯水清洗5遍,清洗后分散于150ml纯水中,即得所述修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。

[0033] (4)制备复合免疫磁微粒:将步骤3的氨基化二氧化硅磁微粒用50mMMES缓冲液清洗3遍,加入0.5%TMA和10%戊二醒,室温振荡混匀反应60min,用50mM碳酸盐缓冲液清洗2遍,加入10ug/mL的AFP抗体,室温振荡反应2h,IOmM PBS清洗I遍,加入1%BSA封闭2h,重悬于保存液,即得所述复合免疫磁微粒。

[0034] 实施例3

[0035] 甲状腺素(T4)免疫磁微粒的制备

[0036] (I)制备磁性四氧化三铁纳米内核:称取15mmol/L的Fe3+和7.5mmol/L的Fe2+于150ml纯水中,室温下以600rpm速度进行磁力搅拌,溶解后加入0.5%的氨水,继续磁力搅拌反应4小时,纯水洗涤5次,即得所述磁性四氧化三铁纳米内核。

[0037] (2)制备具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒:将步骤I制备的四氧化三铁纳米磁核分散于150ml50%乙醇中,加入0.5%的PEG4000、0.1%的氨水和0.1%的TE0S,室温磁力搅拌反应12小时,反应结束后用纯水清洗5遍,即得所述具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。

[0038] (3)制备修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒:将步骤2制备的二氧化硅磁微粒分散于150ml50%乙醇中,加入0..05%的氨水、0.5%的TMA、2.5%的APTM0S,室温磁力搅拌反应16h。反应结束后用纯水清洗5遍,清洗后分散于150ml纯水中,即得所述修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。

[0039] (4)制备复合免疫磁微粒:将步骤3的氨基化二氧化硅磁微粒用IOm PBS缓冲液清洗3遍,加入0.P/oTMA和2.5%的戊二醛,室温振荡混匀反应30min,用50mM碳酸盐缓冲液清洗2遍,加入5ug/mL的T4抗体,室温振荡反应lh, IOmM PBS清洗I遍,加入0.1%BSA封闭lh,重悬于保存液,即得所述复合免疫磁微粒。[0040] 以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,gp依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种复合免疫磁微粒,包括磁性四氧化三铁纳米内核,其特征在于:还包括二氧化娃壳层,在该二氧化娃壳层表面修饰有氨基,该氨基偶联需富集的目标生物分子的抗体。
2.—种权利要求1所述的复合免疫磁微粒的制备方法,其特征在于:包括如下步骤: (I)制备磁性四氧化三铁纳米内核; (2 )通过化学反应在步骤(I)制得的磁性四氧化三铁纳米内核外包覆二氧化硅壳层,得具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒; (3)在上述二氧化硅壳层表面通过水解反应修饰上氨基,得修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒; (4)在上述氨基上偶联需富集的目标生物分子的抗体,即得所述复合免疫磁微粒。
3.如权利要求2所述的一种复合免疫磁微粒的制备方法,其特征在于:所述步骤(I)具体为:将三价铁离子和二价铁离子溶于水中,室温下搅拌溶解后加入氨水,继续搅拌反应40-70分钟,反应结束后用水洗涤,即得磁性四氧化三铁纳米内核。
4.如权利要求3所述的一种复合免疫磁微粒的制备方法,其特征在于:所述步骤(I)中三价铁离子的终浓度为15-30mmol/L,二价铁离子的终浓度为7.5-20mmol/L,氨水的终浓度为 0.5-2.5%ο
5.如权利要求2所述的一种复合免疫磁微粒的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)具体为:将步骤(I)所制得的磁性四氧化三铁纳米内核用乙醇溶解,加入聚乙二醇、氨水和正硅酸乙酯,室温下搅拌反应11小时以上,反应结束后用水洗涤,即得具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。
6.如权利要求5所述的一种复合免疫磁微粒的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中乙醇为50-95%的乙醇,聚乙二醇的终浓度为0.5-4%,氨水的终浓度为0.1-0.5%,正硅酸乙酯的终浓度为0.1-0.5%。
7.如权利要求2所述的一种复合免疫磁微粒的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)具体为:将步骤(2)制备的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒溶于乙醇中,加入氨水、四甲基氢氧化铵和Y -氨丙基三甲氧基硅烷,室温下搅拌反应24小时以上,反应完成后用水清洗,即得修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒。
8.如权利要求7所述的一种复合免疫磁微粒的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中乙醇为50-80%的乙醇,氨水终浓度为0.05-0.5%,四甲基氢氧化铵的终浓度为0.5-2.0%,Y -氨丙基三甲氧基硅烷的终浓度为2.5-10.0%。
9.如权利要求2所述的一种复合免疫磁微粒的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)具体为:将步骤(3)制得的修饰有氨基的具有二氧化硅壳层的磁性纳米颗粒用活化缓冲液清洗后,加入四甲基氢氧化铵和戊二醛,室温震荡反应0.5-1小时,再用偶联缓冲液清洗,加入需富集的目标生物分子的抗体,室温震荡进行偶联反应I小时以上,PBS清洗一遍,封闭0.5小时以上后重悬于保存液中,即得所述复合免疫磁微粒。
10.如权利要求9所述的一种复合免疫磁微粒的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中活化缓冲液包括MES缓冲液和PBS缓冲液,所述偶联缓冲液包括MES缓冲液、Tris-Cl缓冲液、PBS缓冲液和碳酸盐缓冲液,所述保存液为包括1%BSA、0.5%酪蛋白和1%甘氨酸的PBS缓冲液;所述四甲基氢氧化铵的终浓度为0.1-0.5%,所述戊二醛的终浓度为2.5-10%。
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