CN101792480B - 一种纳米二氧化硅包裹组氨酸标签蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳米二氧化硅包裹组氨酸标签蛋白的方法，属纳米无机材料与生物高分子化学技术领域。本发明方法的要点是：将环己烷、聚乙二醇辛基苯基醚、正己醇按一定比例混合均匀至呈微乳液混合液体系，加入金属离子水溶性盐与组氨酸标签蛋白的混合物，再加入一定量的正硅酸乙酯，磁力搅拌均匀，再用少量氨水引发聚合，室温下搅拌反应完全后，加入丙酮破乳值纳米球沉淀出来，然后洗涤数次以去除表面活性剂等杂质，即可得到包含组氨酸标签蛋白的纳米二氧化硅颗粒。本发明方法制得的组氨酸标签的绿色荧光蛋白为例制得的纳米二氧化硅颗粒具有极好的热稳定性，且具有不易被酶解和荧光不易被淬灭等优良性能。

Description

一种纳米二氧化硅包裹组氨酸标签蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种纳米二氧化硅包裹组氨酸标签蛋白的方法，属纳米无机材料与生物高分子化学技术领域。

背景技术

组氨酸标签蛋白是蛋白质提纯中常用的蛋白，经组氨酸标签的蛋白提纯效率大大增高，且蛋白特性基本不发生改变。而应用纳米二氧化硅包裹蛋白是目前纳米技术与生物技术结合的交叉研究方向。传统方法包裹的纳米二氧化硅在溶液中容易泄漏，包裹效率低下，该法利用组氨酸标签蛋白的特性，选用合适的可以和咪唑基团络合的金属离子和组氨酸标签蛋白络合，改变了蛋白的带电性，制备了稳定的、单分散的纳米二氧化硅颗粒。包含蛋白的纳米二氧化硅颗粒是一种无毒、生物相容性好的无机纳米材料，且其表面易于修饰和改性，尺寸可控性好，被广泛的应用于生物标记、纳米探针、载药体系等生物医学领域。

组氨酸标签蛋白是指一种蛋白质的一端加入几个组氨酸(一般为六个)。组氨酸也是一种氨基酸。组氨酸标签是在蛋白质提纯前，在蛋白质对应的DNA上加上几个组氨酸的基因，这样表达出的蛋白质的一端就含有组氨酸标签，这个标签是用来蛋白质的提纯用的。这个六个组氨酸标签可以和金属离子整合。科研人员利用这种医理和作用，开展了一些新材料的开发工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米二氧化硅包裹组氨酸标签蛋白的方法。

本发明一种纳米二氧化硅包裹组氨酸标签蛋白的方法，其特征在于具有以下过程和步骤：

a.将环己烷、聚乙二醇辛基苯基醚、正己醇三者按体积比4∶1∶1的比例混合均匀使呈微乳液混合液体系；然后加入上述混合液总体积的2.7％的氯化钙与组氨酸标签蛋白的混合物，该混合物中氯化钙与组氨酸标签蛋白两者的摩尔比为3∶1；剧烈搅拌均匀后，再加入一定量的正硅酸乙酯；正硅酸乙酯的加入量以上述微乳液混合液的总体积为计量基准，为微乳液混合液总体积的0.9～1.0％(体积％)；然后磁力搅拌均匀后加入一定量的氨水引发聚合，在室温下搅拌反应24小时；接着再加入一定量的丙酮使纳米球沉淀出来；丙酮的加入量为上述总反应物体积的2倍；经洗涤数次以除去表面活性剂等杂质，最终得到包含有组氨酸标签蛋白的纳米二氧化硅颗粒。

所述的氯化钙与组氨酸标签蛋白的混合物中，其中的氯化钙可以用水溶性的氯化锌、或氯化铁、或氯化铜、或氯化镍中的任一种盐所取代。

本发明方法的机理，可简单地叙述如下：

组氨酸标签蛋白通过和金属离子的整合作用吸附在纳米二氧化硅颗粒的内部。

本发明方法可制得包含有组氨酸标签蛋白的纳米二氧化硅颗粒，同样地可测得组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅。组氨酸标签的绿色荧光蛋白是组氨酸标签蛋白的一种。一般实验过程中主要选取绿色荧光蛋白，因为绿色荧光蛋白具有荧光特性，易于检测。

本发明方法制得的含有组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅，其荧光信号较强；且具有较好的热稳定性，不易被酶解，以及荧光不得被淬灭等优良性能。

另外，本发明的产物可用作荧光纳米二氧化硅探针，能很好的穿越细胞膜进入细胞，且在细胞中荧光信号强，稳定性好，无毒性，可作生物标记。

附图说明

图1为本发明所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的透射电子显微镜(TEM)照片图。

图2为本发明所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的荧光强度与同等浓度无SiO₂包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白荧光强度的比较。

图3为本发明所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与无SiO₂包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白热稳定性对比曲线图。

图4为本发明所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与无SiO₂包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白酶K酶解对比曲线图。

图5为本发明所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与无钙离子情况下直接包裹组氨酸标签绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的泄漏研究。

图6为本发明所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与无SiO₂包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白盐酸胍淬灭的荧光图。

具体实施方式

现将本发明的具体实施例叙述于后。

实施例

以组氨酸标签的绿色荧光蛋白为例。将7.5毫升环己烷、1.77毫升聚乙二醇辛基苯基醚、1.8毫升正己醇的混合液混合，加入300微升氯化钙与组氨酸标签的绿色荧光蛋白的混合物，再加入100微升正硅酸乙酯，磁力搅拌均匀，最后用60微升氨水引发聚合，室温搅拌反应24小时后，加入20毫升丙酮使纳米球沉淀出来，洗涤数次除去表面活性剂等杂质，即可得到包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒。

本实施例所得的包含组氯酸标签绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的透射电子显微镜(TEM)图示于图1。

从图1中可看出，纳米二氧化硅颗粒内部包含了组氨酸标签绿色荧光蛋白。

纳米二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白与无二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白的性能对比

本实施例中所得到的纳米二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白与无二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白的性能对比，参见附图中的图2至图6。

图2为本实施例所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的荧光强度与同等浓度无二氧化硅包裹的组氨酸标签的绿色荧光蛋白的荧光强度比较图。从图2中可看出前者具有更好的荧光强度。

图3为本实施例所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与无氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白热稳定性对比曲线图。从图3中可看到前者具有较好的热稳定性。

图4为本实施例所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与无二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白酶K酶解对比曲线图。从图4中表明：组氨酸标签绿色荧光蛋白(无SiO₂包裹)在蛋白酶K的存在下，2小时后有80％发生了酶解，而纳米二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白其大多数(70％)都没有被酶解，从而说明被纳米二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白具有更好的稳定性。

图5为本实施例所得包含组氨酸标签的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与无钙离子存在下直接包裹组氨酸标签绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的泄漏研究。图5表明：没有金属钙离子存在下的纳米二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白在洗涤过程中很快就发生了泄漏，相反地在有钙离子存在的情况下，被纳米二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白很稳定地得泄漏。

图6为本实施例所得包含组氨酸的绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与无二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白的盐酸胍淬灭的荧光图。从图6中表明：无SiO₂包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白在盐酸胍淬灭剂存在下10分钟就基本变性，而纳米二氧化硅包裹的组氨酸标签绿色荧光蛋白在同样的盐酸胍存在下，20分钟后仍保存有大于60％的荧光强度，因而可看出包裹纳米SiO₂后的组氨酸标签绿色荧光蛋白具有更好的稳定性。

Claims (2)

1.一种纳米二氧化硅包裹组氨酸标签蛋白的方法，其特征在于具有以下的过程和步骤：

a.将环己烷、聚乙二醇辛基苯基醚、正己醇三者按体积比4∶1∶1的比例混合均匀使呈微乳液混合液体系；然后加入上述混合液总体积的2.7％的氯化钙与组氨酸标签蛋白的混合物，该混合物中氯化钙与组氨酸标签蛋白两者的摩尔比为3∶1；剧烈搅拌均匀后，再加入一定量的正硅酸乙酯；正硅酸乙酯的加入量以上述微乳液混合液的总体积为计量基准，为微乳液混合液总体积的0.9～1.0％(体积％)；然后磁力搅拌均匀后加入一定量的氨水引发聚合，在室温下搅拌反应24小时；接着再加入一定量的丙酮使纳米球沉淀出来；丙酮的加入量为上述总反应物体积的2倍；经洗涤数次以除去表面活性剂等杂质，最终得到包含有组氨酸标签蛋白的纳米二氧化硅颗粒。

2.如权利要求1所述的一种纳米二氧化硅包裹组氨酸标签蛋白的方法，其特征在于所述的氯化钙与组氨酸标签蛋白的混合物中，其中的氯化钙替换为水溶性的氯化锌、氯化铁、氯化铜或氯化镍中的任一种。

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