CN106367377B - 一种蔗糖异构酶的固定化方法 - Google Patents

一种蔗糖异构酶的固定化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蔗糖异构酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。本发明以重组短小芽孢杆菌为生产菌株，生产蔗糖异构酶，然后进行固定化，固定化后的酶活为35.2U/g，酶活力回收率达70.3％。固定化酶的最适温度为40℃(游离酶为30℃)，最适pH为4.5(游离酶为6.0)，表明固定化酶具有更好的温度、pH耐受性。以600g·L‑1的蔗糖浓度为底物，异麦芽酮糖最大产物得率可以达到87.8％。在最佳的转化条件下连续转化16次，产物得率仍有87.52％，显示该固定化酶具有良好的操作稳定性及较高的异麦芽酮糖合成能力。该固定化方法操作简单易行，成本低廉，为工业化应用提供参考。

Description

一种蔗糖异构酶的固定化方法
技术领域
本发明涉及一种蔗糖异构酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
蔗糖异构酶(EC 5.4.99.11)，也称异麦芽酮糖合酶或者α-葡糖基转移酶和海藻酮糖合酶，能够催化蔗糖生成异麦芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖)和海藻酮糖(1-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖)，是生物转化法生产异麦芽酮糖的关键酶。
由于液态酶制剂不能重复利用等缺点，故而可以物理、化学等方法将蔗糖异构酶加以固定化，使其具有高活力、可连续化、自动化，且产品易于后续的分离精制，从而提高产品质量，降低生产成本，大力推动异麦芽酮糖的生产。关于蔗糖异构酶固定化的研究较少。Fabiano Jares Contesini等分别以硅藻土吸附戊二醛交联法与微胶囊包埋法对来源于Erwinia sp.的蔗糖异构酶进行固定化(Fabiano Jares Contesini,et al.JournalofBiotechnology,158(2012)137–143)。Hong Xu等用改性的新型介孔材料TiO2对蔗糖异构酶进行了固定化(Hong Xu,et al.Food Chemistry 187(2015)182–188)。但这些固定化方法的方法复杂、载体成本较高，难以大规模工业化应用。因此，研究一种操作简单、生产成本低廉、性能优异且可实现工业化生产的固定化方法具有非常重要的现实意义。
发明内容
本发明提供了一种固定化蔗糖异构酶的方法。
为此，本发明首先构建了一株重组表达蔗糖异构酶的短小芽孢杆菌基因工程菌，构建步骤如下：
(1)在如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶基因的5’和3’端，设计并引入酶切位点Nde I和Hind III，连接pUC57得到pUC57-pal I；
(2)将携带palI的质粒pUC57-pal I和表达载体pET-24a(+)分别用限制性内切酶Nde I和Hind III进行酶切，回收目的片段连接得到重组质粒pET-24a-palI；
(3)以pET-24a(+)-pal I为模板，采用一步PCR法对蔗糖异构酶G1347位点进行定点突变，通过突变去掉palI内部的pst I位点；再扩增获取去除信号肽的具有Pst I和HindIII酶切位点的目的基因片段palILSP；
(4)将具有pst I和Hind III酶切位点的去信号肽palILSP，与短小芽孢杆菌表达载体pNY326进行连接，得到表达质粒pNY 326-palILSP，将质粒转化短小芽孢杆菌表达宿主，构建得到重组菌B.brevis/pNY 326-palILSP。
本发明还提供了应用所述重组表达蔗糖异构酶的短小芽孢杆菌基因工程菌生产蔗糖异构酶的方法，包括以下步骤：
以B.brevis/pNY 326-pal ILSP为生产菌株，在种子培养基中37℃、200rpm，培养10h，转接到发酵培养基中发酵产蔗糖异构酶，培养条件为30℃、200rpm，发酵时间48h。
所述种子培养基成分为(g/L)：多聚蛋白胨10，酵母粉2，牛肉浸出物5，葡萄糖10，七水硫酸亚铁0.01，四水硫酸锰0.01，七水硫酸锌0.001，pH 7.0。
所述发酵培养基成分为(g/L)：牛肉蛋白胨10，大豆蛋白胨5，硫代甜菜碱2.4，三水磷酸氢二钾4.56，磷酸二氢钾2.72，七水硫酸亚铁0.01，四水硫酸锰0.01，七水硫酸锌0.001，葡萄糖10，pH 7.0。
本发明所述固定化蔗糖异构酶的方法包括以下步骤：
(1)称取一定质量脱乙酰度≥95％的壳聚糖粉末，加入到浓度为4％的乙酸溶液中，搅拌均匀后静置，使之完全溶解，制得终浓度为2％-5％的壳聚糖胶体溶液，抽真空除去气泡；
(2)将溶解完全的壳聚糖胶体溶液缓慢滴入4M的氢氧化钠中，匀速搅拌，形成直径约1.5mm的微球，待微球成型完全，倾去氢氧化钠溶液，用去离子水将制得微球洗至中性；
(3)将处理好的壳聚糖微球加入到0.5％-3％的戊二醛水溶液中，于25℃交联2h，倾去戊二醛溶液，用去离子水洗去多余的戊二醛；
(4)将用戊二醛处理过的壳聚糖微球按30-200U/g的给酶量与酶液混合，于4℃交联一定时间，洗去未交联的游离酶即得固定化酶颗粒。
在本发明的一种实施方式中，所述固定化方法包括以下步骤：
(1)以短小芽孢杆菌B.brevis/pNY 326-palILSP为出发菌株，发酵制备蔗糖异构酶酶液；
(2)以4％的乙酸溶液为溶剂，制得终浓度为3％的壳聚糖胶体溶液，抽真空除去气泡；
(3)将溶解完全的壳聚糖胶体溶液缓慢滴入4M的氢氧化钠溶液中，匀速搅拌，形成直径约1.5mm的壳聚糖微球，待微球成型完全，倾去氢氧化钠溶液，用去离子水将制得微球洗至中性。
(4)将洗至中性的壳聚糖微球加入到0.75％的戊二醛水溶液中，于25℃交联2h，倾去戊二醛溶液，用去离子水洗去多余的戊二醛；
(5)将用戊二醛处理过的壳聚糖微球按50U/g的给酶量与酶液混合，于4℃交联16h，洗去未交联的游离酶即得固定化酶颗粒。
本发明还提供一种应该固定化蔗糖异构酶催化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法，是在温度30～35℃、初始pH4.0～4.5、加酶量15～25U·g-1蔗糖、蔗糖浓度500～600g·L-1的条件下转化12～14h。
在本发明的一种实施方式中，是在温度30℃、初始pH4.5、加酶量15U·g-1蔗糖、蔗糖浓度600g·L-1的条件下转化12h。
本发明构建的重组短小芽孢杆菌，发酵后发酵上清液中的酶活力单位可达660.5U/mL，是采用TM培养基的4.2倍多。发酵所得酶经本发明固定化方法固定化后，固定化酶的酶活为35.2U/g，酶活力回收率达70.3％。固定化酶的最适温度为40℃(游离酶为30℃)，最适pH为4.5(游离酶为6.0)，表明固定化酶具有更好的温度、pH耐受性。应用所得固定化蔗糖异构酶生产异麦芽酮糖的最大产物得率可以达到87.8％。在最佳的转化条件下连续转化16次，产物得率仍有87.52％，显示该固定化酶具有良好的操作稳定性及较高的异麦芽酮糖合成能力。该固定化方法操作简单易行，成本低廉，为工业化应用提供参考。
具体实施方式
酶活力测定：将100μL适当稀释的酶液加入到900μL含有蔗糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(50mmol·L-1,pH 6.0)中，使蔗糖的终浓度为100g·L-1。振荡混匀后置30℃水浴锅中反应15min，灭酶，离心。反应样品中蔗糖、异麦芽酮糖、海藻酮糖、葡萄糖和果糖的含量利用HPLC进行检测，检测器为示差检测器。
酶活单位定义：在上述条件下，每分钟释放1μmol异麦芽酮糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
固定化酶活力的测定只需要将100uL适当稀释的酶用一定质量的固定化酶代替，其他步骤相同。固定化酶活收率计算公式如下：
异麦芽酮糖产物得率测定：转化后的样品经过加热灭酶之后，于12000r·min-1离心10min，取上清用去离子水适当稀释，备用。HPLC检测条件是：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱4.6mm×250mm×5μmSyncronis Amino Column；Aginent示差检测器；流动相为80％的乙腈，超声脱气20min，流速为0.8mL·min-1；柱温30℃。
实施例1 B.brevis/pNY 326-pal ILSP的构建
在蔗糖异构酶基因(pal I)(基因序列见SEQ ID NO.1)的5’和3’端，设计并引入酶切位点Nde I和Hind III，最后由上海捷瑞生物工程有限公司合成，得到pUC57-palI。
将携带pal I的质粒pUC57-palI和表达载体pET-24a(+)分别用限制性内切酶NdeI和Hind III进行酶切，回收目的片段连接得到重组质粒pET-24a-palI。
以pET-24a(+)-pal I为模板，设计表1G1374A-For、G1374A-Rev所示PCR引物，采用一步PCR法对蔗糖异构酶基因G1347位点进行定点突变，通过突变去掉pal I内部的pst I位点；再利用引物P-For、P-Rev PCR扩增获取去除信号肽的具有Pst I和Hind III酶切位点的目的基因片段palILSP。
将具有pst I和Hind III酶切位点的去信号肽palILSP，与短小芽孢杆菌B.brevis表达载体pNY 326进行连接，得到表达质粒pNY 326-palILSP，将质粒转化短小芽孢杆菌表达宿主，构建得到重组菌B.brevis/pNY 326-palILSP。
表1
实施例2摇瓶培养基对发酵液酶活的影响
将短小芽孢杆菌B.brevis/pNY 326-pal ILSP作为出发菌株，经种子培养基培养后接入到不同的摇瓶培养基：
(1)单一氮源
以葡萄糖为碳源，在TM培养基上，分别用工业酵母粉、工业蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白、棉籽粉饼、多聚蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨、安琪蛋白胨等作为氮源，每种氮源的含量为15g·L-1，接种量为1％，在摇床上200r/min、30℃培养48h后测定酶活。
(2)复配氮源
在单一氮源的基础上，选取较好的两种氮源，按一定的比例进行混合配制，接种量为1％，在摇床上200r/min、30℃培养48h后测定酶活。
(3)缓冲液浓度
在氮源复配发酵培养基上，分别以20-100mM的缓冲液配培养基，接种量为1％，在摇床上200r/min、30℃培养48h后测定酶活。
(4)金属离子及添加剂
在上述(3)的基础上，分别添加20mM不同的金属离子(Mg2+、Zn2+、Ba2+、Mn2+、Ca2+、Cu2 +、Co2+、Mo6+、Fe2+、Al3+)、20mM和40mM的DMT，接种量为1％，在摇床上200r/min、30℃培养48h后测定酶活。
表2单一氮源对发酵液酶活的影响
氮源种类 酶活U/mL
工业酵母粉 316.3
安琪酵母粉 378.35
鱼粉蛋白胨 104.51
工业蛋白胨 131.6
大豆蛋白胨 449.98
牛肉浸膏 30.17
酸水解酪蛋白 29.61
棉籽粉 37.85
多聚蛋白胨 16.61
胰蛋白胨 26.26
牛肉蛋白胨 431.03
安琪蛋白胨 11.3
TM培养基 154.5
表3复配氮源对发酵液酶活的影响
表4缓冲液浓度对发酵液酶活的影响
缓冲液浓度 酶活U/mL
20mM/L 495.1
40mM/L 502.6
60mM/L 221.1
80mM/L 334.5
100mM/L 313.1
表5金属离子及添加剂对发酵液酶活的影响
采用发酵培养基成分为(g/L)：牛肉蛋白胨10，大豆蛋白胨5，硫代甜菜碱2.4，三水磷酸氢二钾4.56，磷酸二氢钾2.72，七水硫酸亚铁0.01，四水硫酸锰0.01，七水硫酸锌0.001，葡萄糖10，pH 7.0；所得发酵液酶活力单位为660.5U/mL，是采用基础培养基的4.2倍多。
实施例3固定化蔗糖异构酶的制备
(1)以短小芽孢杆菌(B.brevis/pNY 326-palILSP)为出发菌株，采用实施例2最终确定的发酵培养基发酵制备蔗糖异构酶酶液，发酵结束后，离心去除菌体得到酶液。
(2)以4％的乙酸溶液为溶剂，制得终浓度为2％-5％的壳聚糖胶体溶液，抽真空除去气泡。
(3)用注射器将溶解完全的壳聚糖胶体溶液缓慢滴入4M的氢氧化钠溶液中，匀速搅拌，形成直径约1.5mm的壳聚糖微球，待微球成型完全，倾去氢氧化钠溶液，用去离子水将制得微球洗至中性。
(4)将洗至中性的壳聚糖微球加入到浓度为0.5％-3％的戊二醛水溶液中，于25℃交联2h，倾去戊二醛溶液，用去离子水洗去多余的戊二醛。
(5)将用戊二醛处理过的壳聚糖微球按30-200U/g的给酶量与酶液混合，于4℃交联一定时间，洗去未交联的游离酶即得固定化酶颗粒。
表6壳聚糖浓度对固定化蔗糖异构酶活力回收率的影响
表7戊二醛加量对固定化蔗糖异构酶活力回收率的影响
戊二醛浓度 回收率％ 酶活U/g
0.50％ 48.25 24.125
0.75％ 55.6 27.8
1％ 51.6 25.8
1.25％ 49.6 24.8
1.50％ 47.9 23.95
2％ 46.7 23.35
3％ 33.1 16.55
表8酶加量对固定化蔗糖异构酶活力回收率的影响
酶加量 酶活力回收率％ 酶活U/g
30 58.5 17.55
50 55.1 27.55
70 37.4 26.18
100 25.7 25.7
200 13.8 27.6
表9固定化时间对固定化蔗糖异构酶活力回收率的影响
时间 回收率 酶活U/g
4h 45.4 22.7
8h 50.5 25.25
12h 58.9 29.45
16h 70.3 35.15
20h 69.9 34.95
24h 70.2 35.1
最终确定的固定化条件：
(1)以短小芽孢杆菌(B.brevis/pNY 326-palILSP)为出发菌株，采用实施例2最终确定的发酵培养基发酵制备蔗糖异构酶酶液，发酵结束后，离心去除菌体得到酶液。
(2)以4％的乙酸溶液为溶剂，制得终浓度为3％的壳聚糖胶体溶液，抽真空除去气泡。
(3)用注射器将溶解完全的壳聚糖胶体溶液缓慢滴入4M的氢氧化钠溶液中，匀速搅拌，形成直径约1.5mm的壳聚糖微球，待微球成型完全，倾去氢氧化钠溶液，用去离子水将制得微球洗至中性。
(4)将洗至中性的壳聚糖微球加入到0.75％的戊二醛水溶液中，于25℃交联2h，倾去戊二醛溶液，用去离子水洗去多余的戊二醛。
(5)将用戊二醛处理过的壳聚糖微球按50U/g的给酶量与酶液混合，于4℃交联16h，洗去未交联的游离酶即得固定化酶颗粒。
在该最佳固定化条件下，固定化后的酶活为35.2U/g，酶活力回收率达70.3％。
实施例4固定化酶转化生产异麦芽酮糖
具体技术方案如下：
(1)pH 4.5的400g/L的蔗糖作为底物，加酶量为15U·g-1，置于30℃、转速为150r·min-1的水浴摇床中，每隔一定时间取样500μL，用HPLC检测异麦芽酮糖的生成量，计算产物得率。
(2)以pH 6.0的磷酸缓冲液溶解400g/L的蔗糖作为底物，固定化酶加量为20U·g-1，反应初始pH 6.0，分别置于20、25、30、35、40、45、50℃水浴摇床中，转速为150r·min-1，转化12h，用HPLC检测异麦芽酮糖生成量，计算产物得率。
(3)分别用pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的磷酸缓冲液配制400g/L的蔗糖作为底物，固定化酶加量为20U·g-1，置于30℃、转速为150r·min-1的水浴摇床，转化12h，用HPLC检测异麦芽酮糖生成量，计算产物得率。
(4)以pH 4.5的400g/L的蔗糖作为底物，固定化酶加量分别为5U·g-1、10U·g-1、15U·g-1、20U·g-1、25U·g-1和30U·g-1，置于30℃、转速为150r·min-1的水浴摇床中，转化12h，用HPLC检测异麦芽酮糖生成量，计算产物得率。
(5)分别配制pH 4.5的200g/L、300g/L、400g/L、500g/L、600g/L、700g/L和800g/L的蔗糖溶液，固定化酶加量为15U·g-1，置于30℃、转速为150r·min-1的水浴摇床中，转化12h，用HPLC检测异麦芽酮糖生成量，计算产物得率。
表10反应时间对异麦芽酮糖产物得率的影响
时间 产物得率
2h 39.7％
4h 56.2％
6h 66.7％
8h 75.7％
10h 83.5％
12h 85.1％
14h 85.1％
表11温度对异麦芽酮糖产物得率的影响
温度 产物得率
25℃ 70％
30℃ 83％
35℃ 79％
40℃ 77％
45℃ 71％
50℃ 64％
表12初始pH对异麦芽酮糖产物得率的影响
pH 产物得率
3.5 0.68％
4 0.80％
4.5 0.85％
5 0.80％
5.5 0.78％
6 0.74％
6.5 0.66％
7 0.62％
表13加酶量对异麦芽酮糖产物得率的影响
加酶量 产物得率
5U/g 74
10U/g 79.4
15U/g 85.2
20U/g 84.1
25U/g 84.9
30U/g 84.6
表14底物浓度对异麦芽酮糖产物得率的影响
底物浓度 产物得率
200g 81.41
300g 83.30
400g 85.56
500g 87.79
600g 87.50
700g 87.62
800g 87.55
最终，结果表明，在温度30℃、初始pH 4.5、加酶量15U·g-1蔗糖，转化12h，蔗糖浓度600g·L-1条件下，异麦芽酮糖最大产物得率可以达到87.8％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种应用短小芽孢杆菌基因工程菌生产蔗糖异构酶的方法，其特征在于，以短小芽孢杆菌基因工程菌B.brevis/pNY 326-pal ILSP为生产菌株，在种子培养基中37℃、200rpm，培养10h，转接到发酵培养基中发酵产蔗糖异构酶，培养条件为30℃、200rpm，发酵时间48h；
所述短小芽孢杆菌基因工程菌B.brevis/pNY 326-pal ILSP构建步骤如下：
(1)在如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶基因的5’和3’端，设计并引入酶切位点Nde I和Hind III，连接pUC57得到pUC57-pal I；
(2)将携带pal I的质粒pUC57-pal I和表达载体pET-24a(+)分别用限制性内切酶NdeI和HindIII进行酶切，回收目的片段连接得到重组质粒pET-24a(+)-pal I；
(3)以pET-24a(+)-pal I为模板，采用一步PCR法对蔗糖异构酶G1347位点进行定点突变，通过突变去掉pal I内部的pst I位点；再扩增获取去除信号肽的具有Pst I和HindIII酶切位点的目的基因片段pal ILSP；
(4)将具有pst I和HindIII酶切位点的去信号肽pal ILSP，与短小芽孢杆菌表达载体pNY 326进行连接，得到表达质粒pNY 326-pal ILSP，将质粒转化短小芽孢杆菌表达宿主，构建得到重组菌B.brevis/pNY 326-pal ILSP；
所述种子培养基成分按g/L计为：多聚蛋白胨10，酵母粉2，牛肉浸出物5，葡萄糖10，七水硫酸亚铁0.01，四水硫酸锰0.01，七水硫酸锌0.001，pH7.0；
所述发酵培养基成分按g/L计为：牛肉蛋白胨10，大豆蛋白胨5，硫代甜菜碱2.4，三水磷酸氢二钾4.56，磷酸二氢钾2.72，七水硫酸亚铁0.01，四水硫酸锰0.01，七水硫酸锌0.001，葡萄糖10，pH7.0。
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