CN106119272B - 一种高效联产l-苯甘氨酸及葡萄糖酸的策略 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种将葡萄糖脱氢酶与L‑亮氨酸脱氢酶在大肠杆菌中单独和共表达，利用重组大肠杆菌酶法和全细胞法联产L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸盐的方法。本发明在于：将葡萄糖脱氢酶基因和L‑亮氨酸脱氢酶基因构建重组单独和共表达载体并将其转化至基因工程菌大肠杆菌内。利用重组菌酶法和全细胞法转化可以促进辅因子在转化体系中的循环，仅需添加少量外源辅因子或不添加外源辅因子，利用该辅因子循环再生系统可以利用底物苯甲酰甲酸及葡萄糖联产高附加值的L‑苯苷氨酸和葡萄糖酸，该转化过程简单快捷，成本低廉。在5L发酵罐中转化2‑4h，该方法所得的L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸产量分别可达58.8g/L及75.6g/L，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。

Description

一种高效联产L-苯甘氨酸及葡萄糖酸的策略
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种将葡萄糖脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶在大肠杆菌中单独和共表达构建成NADH辅酶循环系统，利用酶法和全细胞法高效制备L-苯甘氨酸和葡萄糖酸盐的方法。
背景技术
苯甘氨酸及其衍生物是一种重要的医药中间体，可用于合成氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢克罗、阿莫西林、苯咪唑青霉素等内酰胺类抗生素。邻氯苯甘氨酸则是合成抗血小板抑制剂氯批格雷的重要中间体。此外苯甘氨酸还是合成多肽类激素和多种手性农药的重要中间体，随着我国医药化工行业的飞速发展，相信对苯甘氨酸及其衍生物的需求量还将会不断增加，具有广阔的应用市场。L-苯甘氨酸主要通过化学合成法、酶拆分法及酶转化法来制备，在这三种方法之中，微生物酶转化法具有特异性较强，条件温和，对环境友好等优点。微生物酶转化法制备L-苯甘氨酸可通过利用L-亮氨酸脱氢酶对苯甲酰甲酸进行转氨还原催化作用完成，这之中需要辅因子NADH的参与，而辅因子NADH价格昂贵，显然不适用于工业生产中。通过加入另外一种酶和底物可以构建辅酶偶联再生系统，Degussa公司首次利用甲酸脱氢酶提供辅因子NADH的再生并且将其应用到L-叔亮氨酸的制备中，大大提高了产物的转化率。
葡萄糖酸是化工、医药及食品等产品的重要中间体，可被用来生产葡萄糖酸的衍生物如与钠、钙、锌、亚铁等金属氧化物合成制得的葡萄糖酸盐，也可直接作为一种产品，用在乳品工业上防止乳石沉淀，用在食品配方中作为酸味剂，也用来配制家用或工厂用清洗剂(替代多磷酸盐)、织物加工和金属加工的助剂、皮革矾鞣剂、去藻剂、金属除锈剂、建筑工业上混凝土的塑化剂、生物降解的螯合剂及二次采油的防沉淀剂等。葡萄糖酸的生产主要包括微生物发酵法、电解法和催化氧化法，其中微生物发酵法因其环境友好且能耗较低被广泛采用，但也存在发酵时间长，发酵条件控制严格等问题。
葡萄糖脱氢酶(Glucosedehydrogenase，缩写GlcDH)作为短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅因子NAD(P)+等存在时能够快速地催化葡萄糖转化为葡萄糖酸同时生成辅因子NAD(P)H。制备L-苯甘氨酸过程所需的NADH可通过葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸来获取，L-苯苷氨酸与葡萄糖酸的制备过程构建了一个NAD+与NADH的辅因子循环过程，可以达到高效联产L-苯苷氨酸与葡萄糖酸的目的。同时，利用酶法转化制备L-苯甘氨酸与葡萄糖酸时需要添加昂贵的外源辅因子NAD+，而将L-亮氨酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶在工程菌中串联表达后，利用全细胞法制备L-苯甘氨酸与葡萄糖酸，无需添加NAD+，可以进一步降低成本以实现其工业化生产。
发明内容
本发明的主要研究内容：本发明在于将L-亮氨酸脱氢酶(LeuDH)基因利用分子技术进行克隆，构建重组表达载体pET-28a-Bsleudh、pET-28a-Bcleudh、pET-28a-Blleudh、pET-28a-Baleudh、pET-28a-Heleudh及pET-28a-Nmleudh，并将其分别转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-Bsleudh/BL21、pET-28a-Bcleudh/BL21、pET-28a-Blleudh/BL21、pET-28a-Baleudh、pET-28a-Heleudh及pET-28a-Nmleudh/BL21。将葡萄糖脱氢酶基因与大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组表达载体pET-28a-Bsgdh、pET-28a-Bmgdh及pET-28a-Btgdh，并将其分别转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-Bsgdh/BL21、pET-28a-Bmgdh/BL21及pET-28a-Btgdh/BL21。同时，将L-亮氨酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶在工程菌中进行串联表达，成功构建了载体pET-duet-Bsgdh-Bcleudh，并将其转化E.coliBL21，成功构建了基因工程菌pET-duet-Bsgdh-Bcleudh/BL21，在加入少量辅因子的条件下，利用酶法转化底物苯甲酰甲酸及葡萄糖进行L-苯甘氨酸和葡萄糖酸的高效联产，进一步将酶共表达利用全细胞法转化生产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸，全细胞法操作简单，且无需添加外源辅因子，有效的降低了成本，为L-苯甘氨酸及葡萄糖酸的工业化应用提供了一种有效的策略。
本发明的技术方案：
1.引物的设计
根据不同来源的L-亮氨酸脱氢酶的基因序列设计引物。
PBsldhF：CGGGATCCATGGAACTTTTTAAATATATG(BamHI)
PBsldhR：CCCAAGCTT TTAACGTCTGCTTAATACACTGT(HindIII)
PBcldhF：CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCGA(BamHI)
PBcldhF：GGGGTACC ATGACATTAGAAATCTTCGA(KpnI)
PBcldhR：CCCTCGAGTTAGCGACGGCTAATAATATCG(XhoI)
PBlldhF：CGGGATCCATGGAACTATTTCGATATATGGA(BamHI)
PBlldhR：CCCAAGCTT TTAACGTCTGCTTAAAATGTGA(HindIII)
PbaldhF：CGGGATCCATGGAAATTTTTAAATATAT(BamHI)
PbaldhR：CCCAAGCTT CTATCGTCTGCTTAATACACTT(HindIII)
PheldhF：CGGGATCCATGACGGTCTTCTCTCACCCCGA(BamHI)
PheldhR：CCCAAGCTT TCAGCCGCGGAAGCGTTCCC(HindIII)
PNmldhF：CGGGATCCATGGTATTCGACTCAATCTC(BamHI)
PNmldhR：CCCAAGCTT CTAGTTCGACGGCAGTGCCGG(HindIII)
根据不同来源的葡萄糖脱氢酶的基因序列设计引物。
PBmgdhF：CGGAATTCATGTATACAGATTTAAAAGATA(EcoRI)
PBmgdhR：CCCAAGCTTTTAACCTCTTCCCGCTTGGAAAG(HindIII)
PBsgdhF：CGGAATTCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAA(EcoRI)
PBsgdhR：CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGGAAT(HindIII)
PBtgdhF：CGGAATTCATGTATAGTGATTTAGAAGGAA(EcoRI)
PBtgdhR：CCCAAGCTTTTACCCACGTCCAGCTTGAAAC(HindIII)
2.重组菌的构建
以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对载体pET-28a和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入卡那霉素或氨苄青霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
以pET-Duet为葡萄糖脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶的共表达载体时。先以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行L-亮氨酸脱氢酶基因的扩增，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对已经连上pET-Duet的葡萄糖脱氢酶质粒载体和纯化的PCR产物进行双酶切以，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄青霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
3.重组菌酶法及全细胞法转化联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸
将重组大肠杆菌在LB培养基进行诱导培养，然后进行酶法及全细胞转化。酶法转化：利用pH8.0的100mM PB缓冲液洗涤细胞然后将细胞冰浴超声破碎，在pH8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GlcDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液、5％的甘油和0.1mMNAD+的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，利用添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，并控制转化的温度在30℃，制备得到L-苯甘氨酸和葡萄糖酸。全细胞转化法：利用pH8.0的100mM PB缓冲液洗涤细胞然后以PB缓冲液等体积悬浮，在加入5％的甘油和4％的曲拉通的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，利用添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，并控制转化的温度在30℃，制备得到L-苯甘氨酸和葡萄糖酸。以HPLC检测产物L-苯甘氨酸及葡萄糖酸的产率。
本发明中，所用的L-亮氨酸脱氢酶选自：但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、蜡样芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、地衣芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、解淀粉芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、长盐单胞菌来源的L-亮氨酸脱氢酶及嗜盐碱古细菌来源的L-亮氨酸脱氢酶。所用的葡萄糖脱氢酶选自：但不限于，枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶、巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶和苏云金芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶。
本发明的有益效果：
L-苯甘氨酸和葡萄糖酸是一种重要的化工原料和医药中间体，具有巨大的市场需求。本发明将葡萄糖脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶在E.coli BL21中表达，构建了两酶单独和共表达的工程菌株。利用这些重组菌对苯甲酰甲酸及葡萄糖进行酶法和全细胞转化为L-苯甘氨酸及葡萄糖酸的应用提供了一种有效的策略，转化过程快速高效，具有重要的工业应用价值。
附图说明
无
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细的说明，以下实施例不对本发明产生限制。
实施例1：大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
[1]大肠杆菌感受态的制备。将单克隆大肠杆菌于10ml LB培养基中活化，之后转接于37℃振荡培养至OD600 0.35即可制备感受态；将培养好的菌液置于冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约10min；准备灭好菌的1.5ml离心管若干个，分装菌液于管中，每管装菌量1.2ml，将离心管放置于冰中；菌液离心8000r/min 10-20s，冰水中静置2min，弃上清，加入预冷好的0.1M CaCl2 400μL，轻轻吹吸悬浮液，放入冰中15min(该步骤重复2-3次)；最后，每管菌液离心弃上清后加入预冷好的0.1M CaCl2 80μL，轻轻吹吸悬浮菌液放入冰中。
[2]质粒的转化。取[1]制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒，轻轻反复吹吸，并在冰中放置45min；将离心管放入42℃水浴锅准确放置90s，然后取出迅速放入冰中5min；加入LB培养基800μL，轻轻混合，37℃摇床培养1-1.5h；菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200μL于目标抗性平板，置于37℃培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证。
实施例2：重组质粒pET-28a-Bsleudh/pET-28a-Bcleudh/pET-28a-Blleudh/pET-28a-Baleudh/pET-28a-Heleudh/pET-28a-Nmleudh的构建及转化
[1]以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、长盐单胞菌和嗜盐碱古细菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、长盐单胞菌和嗜盐碱古细菌的L-亮氨酸脱氢酶基因序列以及pET-28a质粒上的酶切位点设计leudh基因引物。
PBsldhF：CGGGATCCATGGAACTTTTTAAATATATG(BamHI)
PBsldhR：CCCAAGCTT TTAACGTCTGCTTAATACACTGT(HindIII)
PBcldhF：CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCGA(BamHI)
PBcldhR：CCCTCGAGTTAGCGACGGCTAATAATATCG(XhoI)
PBlldhF：CGGGATCCATGGAACTATTTCGATATATGGA(BamHI)
PBlldhR：CCCAAGCTT TTAACGTCTGCTTAAAATGTGA(HindIII)
PBaldhF：CGGGATCCATGGAAATTTTTAAATATAT(BamHI)
PBaldhR：CCCAAGCTT CTATCGTCTGCTTAATACACTT(HindIII)
PHeldhF：CGGGATCCATGACGGTCTTCTCTCACCCCGA(BamHI)
PHeldhR：CCCAAGCTT TCAGCCGCGGAAGCGTTCCC(HindIII)
PNmldhF：CGGGATCCATGGTATTCGACTCAATCTC(BamHI)
PNmldhR：CCCAAGCTT CTAGTTCGACGGCAGTGCCGG(HindIII)
[3]利用枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、长盐单胞菌和嗜盐碱古细菌的基因组DNA作为模板进行PCR扩增得到leudh基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex TaqDNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Bsleudh/pMD18-T-Bcleudh/pMD18-T-Blleudh/pMD18-T-Baleudh/pMD18-T-Heleudh/pMD18-T-Nmleudh，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coil JM109，转化方法参照实施例[1]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用BamH I/Hind III和BamH I/XhoI进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Bsleudh/pET-28a-Bcleudh/pET-28a-Blleudh/pET-28a-Baleudh/pET-28a-Heleudh/pET-28a-Nmleudh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[1]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例3：重组质粒pET-28a-Bmgdh/pET-28a-Bsgdh/pET-28a-Btgdh的构建及转化
[1]以巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌基因组DNA作为模板。
[2]根据巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因序列以及pET-28a质粒上的酶切位点设计gdh基因引物。
PBmgdhF：CGGAATTCATGTATACAGATTTAAAAGATA(EcoRI)
PBmgdhR：CCCAAGCTTTTAACCTCTTCCCGCTTGGAAAG(HindIII)
PBsgdhF：CGGAATTCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAA(EcoRI)
PBsgdhR：CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGGAAT(HindIII)
PBtgdhF：CGGAATTCATGTATAGTGATTTAGAAGGAA(EcoRI)
PBtgdhR：CCCAAGCTTTTACCCACGTCCAGCTTGAAAC(HindIII)
[3]利用巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增得到gdh基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×ExTaq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Bmgdh/pMD18-T-Bsgdh/pMD18-T-Btgdh，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coil JM109，转化方法参照实施例[1]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用EcoR I和Hind III进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Bmgdh/pET-28a-Bsgdh/pET-28a-Btgdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[1]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例4：重组质粒pET-duet-Bsgdh-Bcleudh的构建和转化
[1]以枯草芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌基因组DNA作为模板。
[2]根据枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因序列和蜡样芽孢杆菌L-亮氨酸脱氢酶基因序列以及pET-duet质粒上的酶切位点设计基因引物。
PBsgdhF：CGGAATTCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAA(EcoRI)
PBsgdhR：CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGGAAT(HindIII)
PBcldhF：GGGGTACC ATGACATTAGAAATCTTCGA(KpnI)
PBcldhR：CCCTCGAGTTAGCGACGGCTAATAATATCG(XhoI)
[3]利用枯草芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌基因组DNA作为模板做PCR扩增得到基因gdh和ldh。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Bsgdh/pMD18-T-Bcldh，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coil JM109，转化方法参照实施例[1]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Bsgdh/pMD18-T-Bcldh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒pMD18-T-Bsgdh和表达载体pET-duet分别用EcoR I和HindIII进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-Bsgdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[1]，用氨苄青霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
[6]将[4]中提取的质粒pMD18-T-Bcldh和表达载体pET-duet-Bsgdh分别用Kpn I和Xho I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-Bsgdh+Bcldh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[1]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例5：枯草芽孢杆菌来源的重组L-亮氨酸脱氢酶和巨大芽孢杆菌来源的重组葡萄糖酸脱氢酶酶法转化联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸
[1]将重组菌pET-28a-Bsleudh/BL21和pET-28a-Bmgdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.3mM的IPTG，诱导温度降低为24℃，诱导12h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 8.0的100mM PB缓冲液分别将pET-28a-Bsleudh/BL21和pET-28a-Bmgdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，用10倍浓缩体积的PB缓冲液重悬细胞，然后将细胞冰浴超声破碎，得到粗酶液。在pH8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GlcDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液、5％的甘油和0.1mM NAD+的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，转化持续2h，分不同时间取样，稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。L-苯甘氨酸的产率为58.8g/L，葡萄糖酸的产率为75.6g/L。
[2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：Dimosoil C8(5μm,150mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]葡萄糖酸的HPLC分析条件：色谱柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：0.5ml/min。
实施例6：蜡样芽孢杆菌来源的重组L-亮氨酸脱氢酶和枯草芽孢杆菌来源的重组葡萄糖酸脱氢酶酶法转化联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸
[1]将重组菌pET-28a-Bcleudh/BL21和pET-28a-Bsgdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.3mM的IPTG，诱导温度降低为24℃，诱导12h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 8.0的100mM PB缓冲液分别将pET-28a-Bcleudh/BL21和pET-28a-Bsgdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，用10倍浓缩体积的PB缓冲液重悬细胞，然后将细胞冰浴超声破碎，得到粗酶液。在pH8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GlcDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液、5％的甘油和0.1mM NAD+的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，转化持续2h，分不同时间取样，稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。L-苯甘氨酸的产率为43.8g/L，葡萄糖酸的产率为55.4g/L。
[2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：Dimosoil C8(5μm,150mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]葡萄糖酸的HPLC分析条件：色谱柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：0.5ml/min。
实施例7：地衣芽孢杆菌来源的重组L-亮氨酸脱氢酶和苏云金芽孢杆菌来源的重组葡萄糖酸脱氢酶法转化联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸
[1]将重组菌pET-28a-Blleudh/BL21和pET-28a-Btgdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.3mM的IPTG，诱导温度降低为24℃，诱导12h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 8.0的100mM PB缓冲液分别将pET-28a-Blleudh/BL21和pET-28a-Btgdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，用10倍浓缩体积的PB缓冲液重悬细胞，然后将细胞冰浴超声破碎，得到粗酶液。在pH8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GlcDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液、5％的甘油和0.1mM NAD+的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，转化持续2h，分不同时间取样，稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。L-苯甘氨酸的产率为50.8g/L，葡萄糖酸的产率为65.3g/L。
[2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：Dimosoil C8(5μm,150mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]葡萄糖酸的HPLC分析条件：色谱柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：0.5ml/min。
实施例8：解淀粉芽孢杆菌来源的重组L-亮氨酸脱氢酶和巨大芽孢杆菌来源的重组葡萄糖酸脱氢酶酶法转化联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸
[1]将重组菌pET-28a-Baleudh/BL21和pET-28a-Bmgdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.3mM的IPTG，诱导温度降低为24℃，诱导12h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 8.0的100mM PB缓冲液分别将pET-28a-Baleudh/BL21和pET-28a-Bmgdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，用10倍浓缩体积的PB缓冲液重悬细胞，然后将细胞冰浴超声破碎，得到粗酶液。在pH8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GlcDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液、5％的甘油和0.1mM NAD+的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，转化持续2h，分不同时间取样，稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。L-苯甘氨酸的产率为38.8g/L，葡萄糖酸的产率为48.5g/L。
[2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：Dimosoil C8(5μm,150mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]葡萄糖酸的HPLC分析条件：色谱柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：0.5ml/min。
实施例9：长盐假单胞菌来源的重组L-亮氨酸脱氢酶和枯草芽孢杆菌来源的重组葡萄糖酸脱氢酶酶法转化联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸
[1]将重组菌pET-28a-Heleudh/BL21和pET-28a-Bsgdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.3mM的IPTG，诱导温度降低为24℃，诱导12h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 8.0的100mM PB缓冲液分别将pET-28a-Heleudh/BL21和pET-28a-Bsgdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，用10倍浓缩体积的PB缓冲液重悬细胞，然后将细胞冰浴超声破碎，得到粗酶液。在pH8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GlcDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液、5％的甘油和0.1mM NAD+的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，转化持续2h，分不同时间取样，稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。L-苯甘氨酸的产率为30.8g/L，葡萄糖酸的产率为42.3g/L。
[2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：Dimosoil C8(5μm,150mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]葡萄糖酸的HPLC分析条件：色谱柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：0.5ml/min。
实施例10：嗜盐碱古细菌来源的重组L-亮氨酸脱氢酶和苏云金芽孢杆菌来源的重组葡萄糖酸脱氢酶酶法转化联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸
[1]将重组菌pET-28a-Nmleudh/BL21和pET-28a-Btgdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.3mM的IPTG，诱导温度降低为24℃，诱导12h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 8.0的100mM PB缓冲液分别将pET-28a-Nmleudh/BL21和pET-28a-Btgdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，用10倍浓缩体积的PB缓冲液重悬细胞，然后将细胞冰浴超声破碎，得到粗酶液。在pH8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GlcDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液、5％的甘油和0.1mM NAD+的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，转化持续2h，分不同时间取样，稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。L-苯甘氨酸的产率为25.8g/L，葡萄糖酸的产率为33.5g/L。
[2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：Dimosoil C8(5μm,150mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]葡萄糖酸的HPLC分析条件：色谱柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：0.5ml/min。
实施例11：来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶及来源于蜡样芽孢杆菌的L-亮氨酸脱氢酶共表达重组菌全细胞转化联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸
[1]将重组菌pET-duet-Bsgdh-Bcleudh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.3mM的IPTG，诱导温度降低为24℃，诱导12h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 8.0的100mM PB缓冲液分别将重组菌pET-duet-Bsgdh-Bcleudh/BL21洗涤二次，用等体积的PB缓冲液重悬细胞。在pH8.0的100mM PB缓冲液中，在加入5％的甘油和4％的曲拉通的情况下，投入500mM苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，转化持续4h，分不同时间取样，离心稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。L-苯甘氨酸的产率为45.8g/L，葡萄糖酸的产率为58.5g/L。
[2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：Dimosoil C8(5μm,150mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]葡萄糖酸的HPLC分析条件：色谱柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：0.5ml/min。
Figure IDA0001054637580000011
Figure IDA0001054637580000021

Claims (3)

1.一种通过重组大肠杆菌表达葡萄糖脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶用于酶法联产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸的方法，其特征包括以下内容：
(1) 将L-亮氨酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌；
(2) 酶法转化生产L-苯甘氨酸和葡萄糖酸：首先将L-亮氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶分别在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌，将培养好的重组大肠杆菌细胞分别在pH8.0的100mMPB缓冲液洗涤，然后将细胞分别在冰浴超声破碎，在pH6.0-8.0的100mMPB缓冲液中，在加入GDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液，0.1mMNAD+的情况下，加入700mM苯甲酰甲酸、900mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，利用添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，并控制转化的温度在30℃，制备得到L-苯甘氨酸和葡萄糖酸； 所述的葡萄糖脱氢酶选自：巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶和苏云金芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶；
所述的L-亮氨酸脱氢酶选自：枯草芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、地衣芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、解淀粉芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、长盐单胞菌来源的L-亮氨酸脱氢酶及嗜碱嗜盐古细菌来源的L-亮氨酸脱氢酶。
2.一种通过重组大肠杆菌表达葡萄糖脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶用于全细胞转化法合成L-苯甘氨酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括：首先将L-亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共同在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌，利用pH8.0的100mMPB缓冲液洗涤细胞然后以PB缓冲液等体积悬浮，在加入5％的甘油和4％的曲拉通的情况下，投入500mM苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH4Cl，利用添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，并控制转化的温度在30℃，制备得到L-苯甘氨酸和葡萄糖酸；
所述的葡萄糖脱氢酶选自：巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶和苏云金芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶；
所述的L-亮氨酸脱氢酶选自：枯草芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、地衣芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、解淀粉芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、长盐单胞菌来源的L-亮氨酸脱氢酶及嗜碱嗜盐古细菌来源的L-亮氨酸脱氢酶。
3.根据权利要求2所述的全细胞转化法合成L-苯甘氨酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，不需要向转化体系中添加任何辅因子。
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Enzymatic reduction of a-keto acids leading to L-amino acids, D- or L-hydroxy acids;G. Krix et al.;《Journal of Biotechnology》;19971231;第53卷;29-39 *
Stereoselective synthesis of l-tert-leucine by a newly cloned leucinedehydrogenase from Exiguobacterium sibiricum;Jing Li et al.;《Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic》;20140326;第105卷;第14页表3 *

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