CN105331642B - 一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用L‑谷氨酸氧化酶催化生产α‑酮戊二酸的方法，包括以下步骤：对L‑谷氨酸氧化酶（L‑GOX）基因的密码子进行优化设计和合成；构建L‑GOX和类弹性蛋白（ELP）的融合表达载体pET‑28a‑LGOX‑ELP并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，挑取转化子培养并添加诱导剂进行表达，获得重组L‑谷氨酸氧化酶融合蛋白粗酶液；利用ITC方法纯化获得重组L‑谷氨酸氧化酶融合蛋白，利用蛋白酶对重组L‑谷氨酸氧化酶融合蛋白进行酶切，获得成熟的L‑谷氨酸氧化酶；利用成熟的L‑谷氨酸氧化酶催化生产酮戊二酸。本发明方法简单、快速、高效，可用于大规模的分离纯化L‑谷氨酸氧化酶，在酮戊二酸的酶法生产中具有较高的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法。
背景技术
α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）是一种重要的生物化合物。作为三羧酸循环的重要中间代谢产物之一，α-酮戊二酸参与氨基酸、糖类、蛋白质以及脂肪代谢等重要生理过程，并且在微生物的碳氮代谢调控中起着重要作用。由于α-酮戊二酸在细胞代谢上的重要性，其被广泛用于食品、医药、精细化工和化妆品行业，市场需求量巨大。特别地，L-精氨酸-α-酮戊二酸（1:1）和L-精氨酸-α-酮戊二酸（2:1）是目前国际市场上销量日益增加的一种氨基酸盐类保健品，作为功能性营养强化剂和护肝药物，主要用于增强体格、促进肌肉的快速增长和恢复、促进肝细胞对营养和能量的吸收、维护肝功能正常等（中国发明专利申请公开号CN104109698A、CN101591271）。
目前，α-酮戊二酸的生产制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法和酶催化转化法。其中化学合成所使用的大量氰化物、重金属离子、强酸强碱等有害试剂，严重限制该方法在医药、化妆品和食品等行业的应用。微生物发酵法制备α-酮戊二酸，具有生产条件温和、工艺步骤简单、对环境友好等优点。但是其存在生产周期长、产品与发酵产物中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂等缺点，总成本偏高，不适合工业化生产（中国发明专利申请公开号CN101717735A、CN102391977A）。酶催化转化法具有催化反应条件温和、转化率高、转化时间短、反应形成的副产物少，产物易分离等优点，非常适合α-酮戊二酸的工业化生产（中国发明专利申请公开号CN102994467A、CN104109698A、）。
L-谷氨酸氧化酶(LGOX)[EC1.4.3.11]可以催化L-谷氨酸氧化脱胺生成α-酮戊二酸，氨和过氧化氢（Arima J, Tamura T, et al. The Journal of Biochemistry, 2003,134, 805-812）。利用大肠杆菌表达系统生产的重组L-谷氨酸氧化酶是胞内酶，它的分离纯化需要经过细胞裂解、亲和层析等处理步骤（Niu P, Dong X, et al. Journal ofBiotechnology, 2014, 179:56-62）。其中的亲和层析虽然具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点，并已成为目前纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一，但它的缺点也很明显，主要包括耗时大、成本高、处理量小等，这些缺陷不但使得这种纯化蛋白质的生产工艺成本较高，而且也限制了其大规模的工业化应用。
类弹性蛋白多肽（elastin like polypeptides, ELP）是根据弹性蛋白相关序列人工合成的生物大分子，由五肽重复序列VPGXG (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，其中Xaa是除Pro以外的任意一种氨基酸)。ELP具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度细胞中呈溶解状态，在高于相变温度溶液中呈凝聚状态，因此可以用简单的离心法与细胞自身的杂蛋白进行有效分离。ELP融合蛋白仍能保持ELP的可逆相变特性，因此ELP可以作为分离重组蛋白一种很好的工具，并且该分离过程相比亲和纯化，具有简单、价格低廉、易操作等优点，具有工业化应用的前景（中国发明专利申请公开号CN10955960A、CN104725515A）。
L-谷氨酸氧化酶在大肠杆菌中表达后仅能得到谷氨酸氧化酶的前体，需要通过特殊处理后才能得到成熟的蛋白（Arima J, Tamura T, et al. The Journal ofBiochemistry, 2003, 134, 805-812）。据报道，通过使用金属内肽酶（Arima J, TamuraT, et al. The Journal of Biochemistry, 2003, 134, 805-812）和Factor X蛋白酶（中国发明专利公开申请号CN104726472A）的酶切，可获得成熟的L-谷氨酸氧化酶。本发明利用蛋白酶K代替金属内肽酶和Factor X蛋白酶，发现酶切获得的L-谷氨酸氧化酶具有与报道的经金属内肽酶酶切的L-谷氨酸氧化酶同样的酶学特性。因此，本发明将ELP的温度敏感特性与L-谷氨酸氧化酶的酶切特性相结合，将重组大肠杆菌表达的LGOX-ELP融合蛋白用于重组L-谷氨酸氧化酶的快速分离纯化，从而可满足α-酮戊二酸的规模化生产。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，采用本发明可进一步降低L-谷氨酸氧化酶的生产成本和使用成本，实现大规模的分离纯化L-谷氨酸氧化酶，以满足α-酮戊二酸的规模化生产。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
（1）L-谷氨酸氧化酶基因的合成：根据Streptomyces sp. X-119-6的L-谷氨酸氧化酶的原始基因序列，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化，并进行L-谷氨酸氧化酶基因的全合成，合成后的全基因两端分别带用NcoI和XhoI酶切位点并连接到原核表达载体pET28a (+)上，获得融合表达载体pET28a-LGOX。优化的L-谷氨酸氧化酶基因序列如SEQ NO.1所示。
（2）融合表达载体pET-LGOX-ELP的构建：根据L-谷氨酸氧化酶基因序列，设计一对引物，上游引物：5’-CATGCCATGGGCACGACCGATACTGC
AAGAAGGC-3’，下游引物：5’-CCCTCGAGCTAGAATTCCATATGTGAGGTCA
AGGCTTCCTCACGCATTG-3’，其中上游引物含有NcoI酶切位点，下游引物含有XhoI、EcoRI和NdeI酶切位点。以pET28a-LGOX为模板，通过PCR获得的目的片段，割胶纯化后经NcoI和XhoI双酶切后与同样经过双酶切的载体pET28a进行连接，获得载体pET-LGOX。用NdeI和EcoRI对载体pET-EICM-MBP进行双酶切，获得ELP基因片段并与同样经过双酶切的载体pET-LGOX进行连接，获得融合表达载体pET-LGOX-ELP。
（3）将融合表达载体转化到大肠杆菌中：将融合表达载体pET-LGOX-ELP通过热激转化法转到表达菌株Rosetta (DE3)中，然后涂布到含有卡那霉素（Kana）和氯霉素（Chl）的琼脂平板上进行抗性筛选，37℃培养过夜。挑取单菌落，小量扩增后提取质粒，然后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，含有质粒条带的为实验所需的重组大肠杆菌。
（4）LGOX-ELP融合蛋白的表达：将5 μL甘油菌加入到5 mL含卡那霉素（Kana）和氯霉素（Chl）的LB培养液（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，pH 7.0）中，37℃，200转/分，摇床培养过夜，次日取1 mL菌液加入到含卡那霉素（Kana）和氯霉素（Chl）的100 mL LB培养基中，37℃下振荡培养至细胞生长密度OD600=0.6-0.8，然后添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.1 mM， 25-28℃下诱导培养8-16 h。
（5）细胞破碎：5000 g离心10 min后收集菌体，用0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液洗涤菌体三次，然后再用0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液重悬，超声破碎后13000 g，4℃离心10 min，取上清，即为粗酶液。
（6）融合蛋白的纯化：在粗酶液中添加硫酸铵至终浓度为0.4 M，37℃水浴10 min使得融合蛋白发生凝聚，13000 g室温离心10 min后，弃上清。用预冷的0.1 M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液重悬沉淀部分，使其重新溶解在缓冲液中。反复几次获得纯的融合蛋白LGOX-ELP。
（7）融合蛋白的酶切：用蛋白酶K对融合蛋白进行4℃过夜酶切，酶切后置于70℃水浴中使得蛋白酶K变性，13000 g，4℃离心10 min后去除变性的蛋白酶K，获得成熟的L-谷氨酸氧化酶。
（8）酶切前后热稳定性的比较：将LGOX-ELP融合蛋白和成熟的L-谷氨酸氧化酶分别至于一系列不同温度下保温1 h，然后测定所残余酶活。
（9）利用酶切后的L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸：在3 L发酵罐中配置含有120 g/L L-谷氨酸的磷酸缓冲液，添加15 U/mL的L-谷氨酸氧化酶和200 U/mL 过氧化氢酶后在30℃，220 rpm下进行转化反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用本发明可进一步降低L-谷氨酸氧化酶的生产成本和使用成本，实现大规模的分离纯化L-谷氨酸氧化酶，以满足α-酮戊二酸的规模化生产。
附图说明
图1是本发明L-谷氨酸氧化酶的纯化重组过程图。
图2是本发明构建的重组L-谷氨酸氧化酶的表达质粒pET28-LGOX的过程图。
图3是本发明构建的重组L-谷氨酸氧化酶的表达质粒pET-LGOX-ELP的过程图。
图4是大肠杆菌Rosetta (DE3)、Rosetta (DE3)/pET28-LGOX、Rosetta (DE3)/pET28-ELP和Rosetta (DE3)/pET-LGOX-ELP诱导表达后目标蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图5是融合蛋白经一轮ITC纯化后的SDS-PAGE电泳图。
图6是融合蛋白经酶切前后对热稳定性的图。
图7是成熟的L-谷氨酸氧化酶催化谷氨酸生产α-酮戊二酸的曲线图。
图8是 融合蛋白的亲和纯化表。
图中说明：
图4、图5中：M表示目标蛋白，1表示大肠杆菌Rosetta (DE3)，2表示Rosetta(DE3)/pET28-LGOX，3表示Rosetta (DE3)/pET28-ELP，4表示Rosetta (DE3)/pET-LGOX-ELP。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。
如图1～图8所示的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，以下通过步骤进一步对本发明进行描述：
步骤1、L-谷氨酸氧化酶基因的合成：
根据大肠杆菌密码子偏爱性，全基因合成Streptomyces sp X-119-6来源的L-谷氨酸氧化酶基因LGOX (SEQ ID NO.1)，并委托上海捷瑞生物科技有限公司进行L-谷氨酸氧化酶基因的全合成，合成后的全基因两端分别带用NcoI和XhoI酶切位点并连接到pET28a(+)上，获得融合表达载体pET28a-LGOX。
步骤2、融合表达载体pET-LGOX-ELP的构建：
根据L-谷氨酸氧化酶基因序列，设计一对引物，上游引物：5’-CATGCCATGGGCACGACCGATACTGC
AAGAAGGC-3’，下游引物：5’-CCCTCGAGCTAGAATTCCATATGTGAGGTCA
AGGCTTCCTCACGCATTG-3’，其中上游引物含有NcoI酶切位点，下游引物含有XhoI、EcoRI和NdeI酶切位点。
以pET28a-LGOX为模板，通过PCR获得的目的片段，PCR扩增程序如下：预变性94℃，10 min；变性94℃，40s；复性 55℃，20s；延伸72℃，2.5 min，共30个循环，最后一次反应延伸时间为10 min。取PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒提取胶中的目的片段LGOX。
回收获得的LGOX片段经NcoI和XhoI双酶切后与同样经过双酶切的载体pET28a用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，次日，用氯化钙法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含Kana的LB平板，37℃培养过夜。挑取单克隆接种于含有Kana的LB试管中进行培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用NcoI和XhoI进行双酶切验证，获得重组载体pET-LGOX。
取10 μL含有质粒pET-EICM-ELP的大肠杆菌DH5α接种到含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，收集菌体，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得质粒pET-EICM-ELP。
用NdeI和EcoRI对载体pET-EICM-MBP进行双酶切，取酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒提取胶中的目的片段ELP。
回收获得的ELP基因片段并与同样经过双酶切的载体pET-LGOX用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，次日，用氯化钙法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含Kana的LB平板，37℃培养过夜。挑取单克隆接种于含有Kana的LB试管中进行培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用NdeI和EcoRI进行双酶切验证。获得融合表达载体pET-LGOX-ELP。
步骤3、将融合表达载体转化到大肠杆菌中：制备大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，通过氯化钙法转化将融合表达载体pET-LGOX-ELP转化至Rosetta（DE3）感受态细胞，涂布于含有50 µg/mL的Kana和30 µg/mL Chl抗性的LB平板，37℃培养过夜。挑取单菌落，小量扩增后提取质粒，然后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，含有质粒条带的为实验所需的重组大肠杆菌。保存甘油菌备用。
步骤4、重组LGOX-ELP融合蛋白的表达：将5 μL甘油菌加入到5 mL含卡那霉素（Kana）和氯霉素（Chl）的LB培养液中，37℃，200转/分，摇床培养过夜，次日取1 mL菌液加入到含50 µg/mL的Kana和30 µg/mL Chl抗性的100 mL LB培养基中，37℃下振荡培养至OD600=0.6-0.8，然后添加IPTG至终浓度为0.1 mM， 25-28℃下诱导培养8-16 h。离心后收集菌体备用。
步骤5、细胞破碎：用0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液洗涤菌体三次，然后再用0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液重悬，进行超声破碎（超声功率200W，工作5s，停7s，工作次数为50次），超声破碎后13000 g，4℃离心10 min，上清即为粗酶液。
步骤6、融合蛋白的纯化：4℃条件下，往粗酶液中缓慢添加硫酸铵至终浓度为0.4M，然后置于37℃水浴锅中水浴10 min，使得融合蛋白发生凝聚。室温条件下，13000 g离心10 min，倒去上清液，沉淀部分即为纯化的融合蛋白。用预冷的0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液重悬沉淀部分，使其重新溶解在缓冲液中。反复几次获得纯的融合蛋白LGOX-ELP。
步骤7、融合蛋白的酶切：选用蛋白酶K对融合蛋白进行酶切处理，投酶量按照谷氨酸氧化酶酶活的千分之一当量进行投放，随后在4℃进行过夜酶切。酶切的反应液后置于70℃水浴中水浴1 h，使得蛋白酶K变性，13000 g，4℃离心10 min后去除变性的蛋白酶K，从而获得成熟的L-谷氨酸氧化酶。
步骤8、酶切前后热稳定性的比较：将LGOX-ELP融合蛋白和成熟的L-谷氨酸氧化酶分别至于一系列不同温度下（25-95℃）保温1 h，然后测定所残余酶活。
步骤9、L-谷氨酸氧化酶的酶活测定方法：在0.2 mL 的反应体系内, 反应液中含有 5 mM 谷氨酸钠，6 mM 4-氨基安替比林，6 mM 苯酚，1U 过氧化物酶 和 适量的酶液，反应在25℃下测定，采用分光光度计进行反应的测定。该方法主要是通过检测生成的过氧化氢的含量来确定酶的活性，酶活定义为：在25℃下，1 min生成1 μmol过氧化氢所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
步骤10、利用酶切后的L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸：用发酵罐或者其他供养条件好的容器中进行反应，反应体系中加入120 g/L L-谷氨酸，15 U/mL的L-谷氨酸氧化酶和200 U/mL 过氧化氢酶后在30℃，150转/分下进行转化反应，反应进行20 h后酮戊二酸的产量可达113.56 g/L。
本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明说明书的内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将L-谷氨酸氧化酶基因和类弹性蛋白基因依次连接到原核表达载体上，获得融合表达载体；
(2)将融合表达载体转化到大肠杆菌中，在低温条件下进行L-谷氨酸氧化酶-类弹性蛋白融合蛋白的诱导表达，收集菌体，用超声波破碎，离心去除不溶性物质，获得可溶性的细胞裂解液即为粗酶液；
(3)利用类弹性蛋白的特性，用ITC循环方法纯化重组融合蛋白；
(4)利用L-谷氨酸氧化酶的特性，用蛋白酶对重组融合蛋白进行酶切，去除弹性蛋白并获得成熟的L-谷氨酸氧化酶；
(5)酶切前后热稳定性的比较；
(6)利用成熟的L-谷氨酸氧化酶催化L-谷氨酸生产酮戊二酸；
所述步骤(4)中的酶切过程为：将蛋白酶添加到纯化的重组融合蛋白中，4℃酶切过夜，70℃下保温1h使蛋白酶变性，4℃下，13000g离心10min除去变性的蛋白酶，获得的上清液即为成熟的L-谷氨酸氧化酶；所述的蛋白酶为蛋白酶K，使用蛋白酶K对融合蛋白进行酶切处理，投酶量按照谷氨酸氧化酶酶活的千分之一当量进行投放；
所述步骤(5)中的热稳定性测定方法为：将L-谷氨酸氧化酶-类弹性蛋白融合蛋白和成熟的L-谷氨酸氧化酶分别置于 一系列不同温度下保温1h，然后测定残余酶活；
L-谷氨酸氧化酶的酶活测定方法：在0.2mL的反应体系内,反应液中含有5mM谷氨酸钠，6mM 4-氨基安替比林，6mM苯酚，1U过氧化物酶和适量的酶液，反应在25℃下测定，采用分光光度计进行反应的测定。
2.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的L-谷氨酸氧化酶基因来源各种链霉菌微生物的L-谷氨酸氧化酶基因，并对其进行密码子优化。
3.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的表达条件为：将重组载体转化到大肠杆菌中，将转化子接种到含LB培养基的锥形瓶中，220rpm，30-37℃培养直至细胞生长密度达到0.6-0.8左右，然后添加终浓度为0.1mM IPTG于25-28℃条件下进行诱导表达12-16h，收集菌体，用0.1M Tris-HCl缓冲液在pH值为8.0的环境下重悬菌体并用超声波进行破碎，4℃，13000g离心去除不溶性物质，获得的可溶性细胞裂解液即为粗酶液。
4.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的ITC纯化过程为：添加硫酸铵至粗酶液中的终浓度为0.4M，37℃水浴中孵育10min，13000g室温离心10min获得融合蛋白沉淀部分，用预冷的0.1M Tris-HCl缓冲液在pH值为8.0的环境下重悬沉淀部分，即获得纯化的重组融合蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：所述步骤(6)中酶催化体系为：在3L发酵罐中配置含有120g/L的L-谷氨酸的磷酸缓冲液，添加15U/mL的L-谷氨酸氧化酶和200U/mL过氧化氢酶后在30℃，220rpm下进行转化反应。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20200619 Termination date: 20201130 |