CN106566841A

CN106566841A - 一种成熟l‑谷氨酸氧化酶的生产方法

Info

Publication number: CN106566841A
Application number: CN201611193866.4A
Authority: CN
Inventors: 唐云平; 丁国芳; 余方苗; 杨最素; 黄芳芳
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2017-04-19

Abstract

本发明公开了一种成熟L‑谷氨酸氧化酶的生产方法，首先构建含有L‑谷氨酸氧化酶基因和蛋白酶K基因的重组表达载体pPIC9K‑LGOX和pPICZα‑proteinase K，并依此转化至毕赤酵母GS115中并进行抗性筛选；挑取转化子并利用甲醇进行诱导表达，热处理后通过离心‑硫酸铵沉淀‑离心‑复溶步骤，获得所需的成熟LGOX，本发明利用重组毕赤酵母同时分泌表达LGOX和蛋白酶K，快速获得成熟LGOX，从而降低LGOX的生产成本，以满足α‑酮戊二酸的酶法生产及生物传感器固定化酶膜的制备。

Description

一种成熟L-谷氨酸氧化酶的生产方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种成熟L-谷氨酸氧化酶的生产方法。

背景技术

L-谷氨酸氧化酶(LGOX)[EC1.4.3.11]可以催化L-谷氨酸氧化脱胺生成α-酮戊二酸，氨和过氧化氢(Arima J,Tamura T,et al.The Journal of Biochemistry,2003,134,805-812)。α-酮戊二酸是一种重要的生物化合物。作为三羧酸循环的重要中间代谢产物之一，α-酮戊二酸参与氨基酸、糖类、蛋白质以及脂肪代谢等重要生理过程，并且在微生物的碳氮代谢调控中起着重要作用。由α-酮戊二酸KG在细胞代谢上的重要性，其被广泛用于食品、医药、精细化工和化妆品行业，市场需求量巨大。此外，LGOX还被用于测定谷氨酸或制成测定谷氨酸的生物传感器，用于发酵和食品工业中的成分分析等。

来源于Streptomyces sp X-119-6的LGOX含有六个亚基(α₂β₂γ₂)，其中α亚基约为44kDa，β亚基约为16kDa，γ亚基约为9kDa。该LGOX在大肠杆菌中重组表达后仅能获得LGOX前体，需通过特殊处理后才可获得成熟酶(Arima J,Tamura T,et al.The Journal ofBiochemistry,2003,134,805-812)。目前，可利用金属内肽酶(Arima J,Tamura T,etal.The Journal of Biochemistry,2003,134,805-812)、Factor X蛋白酶(中国发明专利公开号CN104726472A)和蛋白酶K(中国发明专利申请号201510851671.3)对LGOX前体进行酶切，即可获得成熟的LGOX。

发明内容

针对大肠杆菌重组表达的LGOX需经过特殊酶切处理的缺点，本发明的目的在于一种成熟L-谷氨酸氧化酶的生产方法，利用重组毕赤酵母同时分泌表达LGOX和蛋白酶K，快速获得成熟LGOX，从而降低LGOX的生产成本，以满足α-酮戊二酸的酶法生产及生物传感器固定化酶膜的制备。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种成熟L-谷氨酸氧化酶的生产方法，包括以下步骤：

(1)构建含有L-谷氨酸氧化酶基因和蛋白酶K基因的重组表达载体pPIC9K-LGOX和pPICZα-proteinase K；

(2)将重组表达载体pPIC9K-LGOX和pPICZα-proteinase K用限制性内切酶线性化后，将重组表达载体pPIC9K-LGOX转入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过抗性筛选并结合酶活测定，获得能够高效表达LGOX的重组菌GS115-LGOX；然后将pPICZα-proteinase K转入到重组菌GS115-LGOX中，通过抗性筛选并结合酶活测定，获得具有高效表达LGOX的重组菌GS115-LGOX-proteinase K；

(3)重组菌GS115-LGOX-proteinase K使用诱导剂诱导表达重组蛋白，离心，收集上清液，经热处理，离心弃沉淀，上清液采用硫酸铵沉淀目的蛋白，离心，沉淀用缓冲液复溶，获得成熟L-谷氨酸氧化酶。

本发明将LGOX和蛋白酶K基因分别构建在真核表达载体pPIC9K和pPICZαA中，并将两个重组表达载体依次转化至毕赤酵母GS115中，通过甲醇诱导并对发酵上清液进行热处理，即可获得成熟的LGOX，从而可用于α-酮戊二酸的酶法生产及生物传感器固定化酶膜的制备等。

作为优选，步骤(1)中，LGOX基因具有SEQ ID NO：1所示的基因序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。LGOX基因以Streptomyces sp.X-119-6的LGOX(Sequence ID：JC8062)为原始基因序列，按照毕赤酵母密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化而得。

作为优选，步骤(1)中，蛋白酶K基因具有SEQ ID NO：3所示的基因序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。蛋白酶K基因以Parengyodontium album(Sequence ID：P06873)为原始基因序列，按照毕赤酵母密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化而得。

作为优选，步骤(2)中，对重组表达载体pPIC9K-LGOX线性化的限制性内切酶为SalI。

作为优选，步骤(2)中，对重组表达载体pPICZα-proteinase K线性化的限制性内切酶为SacI。

作为优选，步骤(2)中，获得能够高效表达LGOX的重组菌GS115-LGOX的抗性筛选使用的抗生素为G418，获得具有高效表达LGOX的重组子GS115-LGOX-proteinase K的抗性筛选使用的抗生素为Zeocin。

作为优选，步骤(3)中，所述诱导剂为甲醇，诱导浓度为1％。

作为优选，步骤(3)中，热处理温度为70℃，时间为1h。

作为优选，步骤(3)中，缓冲液为pH 6.0、浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

作为优选，

本发明的有益效果是：本发明利用重组毕赤酵母同时分泌表达LGOX和蛋白酶K，快速获得成熟LGOX，无需经过特殊酶切处理，从而降低LGOX的生产成本，以满足α-酮戊二酸的酶法生产及生物传感器固定化酶膜的制备。

附图说明

图1是0.5mg/mL(左)和2.0mg/mL(右)G418抗性筛选重组毕赤酵母LGOX转化子。

图2是重组毕赤酵母生产成熟LGOX的SDS-PAGE电泳图。

图3成熟LGOX的最适反应pH值。

图4是成熟LGOX的最适反应温度。

图5是成熟LGOX的热稳定性。

图6是成熟LGOX催化生成α-酮戊二酸的生成曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

步骤1：重组表达载体pPIC9K-LGOX的构建：

根据Streptomyces sp.X-119-6的LGOX的氨基酸序列(NCBI：JC8062)，按照毕赤酵母密码子分析用表对LGOX基因进行密码子优化，并委托上海捷瑞生物科技有限公司进行目的基因的全合成，合成后的基因两端分别带用EcoRI和NotI酶切位点并连接到pPIC9K上，获得重组表达载体pPIC9K-LGOX。优化的LGOX基因序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤2：重组表达载体pPICZα-proteinase K的构建

蛋白酶K基因以Parengyodontium album(NCBI：P06873)为原始基因序列，按照毕赤酵母密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化而得，并委托上海捷瑞生物科技有限公司进行目的基因的全合成，合成后的基因两端分别带用EcoRI和NotI酶切位点并连接到pPICZαA上，获得重组表达载体pPICZα-proteinase K。优化的蛋白酶K基因序列如SEQ IDNO.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

步骤3：重组菌GS115-LGOX-proteinase K的获得

将重组表达载体pPIC9K-LGOX用限制性内切酶SalI进行线性化，割胶回收目的片段。制备毕赤酵母GS115感受态细胞并通过电击转化法将线性化质粒pPIC9K-LGOX导入到毕赤酵母GS115中。随后，取200μL涂布到MD平板(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)，28℃倒置培养2-3天。待菌落长出后，用无菌牙签挑取重组子分别到0.5和2.0mg/mL G418抗性平板(YPD培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1.5％琼脂)进行高拷贝子的筛选(图1)，挑取在2.0mg/mL G418抗性平板上长出的菌落，进行诱导表达，结合酶活测定方法，筛选获得能够高效表达LGOX的重组菌GS115-LGOX。

将重组表达载体pPICZα-proteinase K用限制性内切酶SacI进行线性化，割胶回收目的片段。制备重组毕赤酵母GS115-LGOX感受态细胞并通过电击转化法将线性化载体pPICZα-proteinase K导入到GS115-LGOX细胞中。28℃复苏培养1-2h后，离心弃部分培养基并全部涂布至含有100μg/mL Zeocin抗性的YPD平板(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1.5％琼脂)，28℃倒置培养2-3天。挑取重组子并进行诱导培养，筛选获得能够高效表达LGOX和蛋白酶K的重组菌GS115-LGOX-proteinase K。

步骤4：重组酶的诱导表达

取100μL重组菌GS115-LGOX-proteinase K接种至含有100mL/500mL BMGY培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5生物素,100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1％甘油)中，28℃、220rpm振荡培养24h。随后，离心弃培养基并置换成等体积的诱导培养基BMMY(1％酵母膏，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素,100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1％甲醇)，每隔24h添加一次甲醇至终浓度为1％，诱导72-96h后，离心收集发酵上清液，酶活为48.6U/mL。

发酵上清液经70℃处理1h使得蛋白酶K和其他杂蛋白变性，经1 2000rpm室温离心10min后去除蛋白酶K和其他杂蛋白。随后，在上清液中加入30％硫酸铵进行目的蛋白的沉淀，经1 2000rpm室温离心10min获得目的蛋白并用缓冲液进行复溶，即为成熟的LGOX，其SDS-PAGE电泳结果见图2。

步骤5：重组酶的活性测定

分别配置0.1M柠檬酸缓冲液(pH 3.0-5.0)、0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0-9.0)和0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 10.0-11.0)。用上述缓冲液分别配制酶反应液(含5mM谷氨酸钠，6mM苯酚，6mM 4-氨基安替比林，1U辣根过氧化物酶)，随后加入一定量的LGOX酶液，采用分光光度计进行吸光值的测定。以最高活力为100％，计算在不同pH值下测定得到的酶的相对活性(图3)。最适pH值为7.0左右。

用pH值7.0的缓冲液配置酶反应液，将该酶反应液取出分为若干份并分别置于25、30、35、40、45、50和55℃水浴中将该酶反应液加热到相应的温度，随后各加入1U辣根过氧化物酶和一定量的成熟LGOX进行反应并采用分光光度计进行吸光值的测定。以最高酶活力为100％，计算在其他温度情况下测定得到的酶的相对活性(图4)。最适反应温度为35℃。

用pH值7.0的缓冲液将获得的成熟LGOX稀释到适当浓度，将该酶稀释液分别置于不同温度水浴中进行保温，30分钟后取出并进行酶活测定。以初始的成熟LGOX酶活为100％，计算经过热处理的成熟LGOX的残余活力。该酶在80℃处理30min仍具有很好的稳定性(图5)。

步骤6：成熟LGOX催化生产α-酮戊二酸

在2.5L酶反应器中配制含有100g/L L-谷氨酸的磷酸缓冲液，添加20U/mL的LGOX和150U/mL过氧化氢酶后在30℃，220rpm下进行转化反应。反应15h后，生成的α-酮戊二酸含量为95.72g/L(图6)。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大学

<120> 一种成熟L-谷氨酸氧化酶的生产方法

<130> 2016.12

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2103

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgactactg atactgctag aagacatact ggtgctgaaa gagctaacga aatgacttac 60

gaacaattgg ctagagaatt gttgttggtt ggaccagctc caactaacga agatttgaag 120

ttgagatact tggatgtttt gattgataac ggtttgaacc caccaggtcc accaaagaga 180

attttgattg ttggagctgg tattgctggt ttggttgctg gcgatttgtt gactagagct 240

ggacatgatg ttactatttt ggaagctaac gctaacagag ttggaggtag aattaagact 300

tttcatgcta agaagggtga accttcccca tttgctgatc cagctcaata cgctgaagct 360

ggagctatga gattgccttc ctttcatcca ttgactttgg ctttgattga taagttgggt 420

ttgaagagaa gattgttctt taacgttgat attgatcctc aaactggtaa ccaagatgct 480

ccagttcctc cagtattcta caagtccttt aaggatggga aaacttggac taacggtgct 540

ccttcacctg agttcaagga acctgataag agaaaccata cttggattag aactaacaga 600

gaacaagtta gaagagctca atacgctact gatccttctt ctattaacga aggatttcat 660

ttgactggat gtgaaactag attgactgtt tccgatatgg ttaaccaggc attggaacca 720

gttagagatt actactccgt taagcaagat gatggaacta gagttaacaa gccattcaag 780

gaatggttgg ctggatgggc tgatgttgtt agagattttg atggatactc tatgggtaga 840

tttttgagag aatacgctga attttccgat gaagctgttg aagctattgg aactattgaa 900

aacatgactt cgcgtttgca tttggccttc tttcattcct ttttgggtag atcagatatt 960

gatcctagag ctacttactg ggaaattgag ggcggttcgc ggatgttgcc agaaactttg 1020

gctaaggatt tgagagatca aattgttatg ggacaaagaa tggttagatt ggaatactac 1080

gatccaggta gagatggaca tcatggtgaa ttgactggac cgggtggacc agctgttgct 1140

attcaaactg ttcctgaagg tgaaccttac gctgctactc aaacttggac tggggatttg 1200

gctattgtta ctattccatt ttcttccttg agatttgtta aggttactcc accattttct 1260

tacaagaaga gaagagctgt tattgaaact cattacgatc aagctactaa ggttttgttg 1320

gagtttagcc gcagatggtg ggagttcact gaagctgatt ggaagagaga attggatgct 1380

attgctccag gtttgtacga ttactaccaa caatggggtg aagatgatgc tgaagctgct 1440

ttggctttgc cacaatccgt tagaaacttg ccaactggtt tgttgggagc tcatccatcc 1500

gttgatgaaa gtaggattgg tgaagaacaa gttgaatact acagaaactc cgaattgcgg 1560

ggcggagtta gaccagctac taacgcttac ggtggcggtt ccactactga taaccctaac 1620

cgtttcatgt actacccatc acatccagtt ccaggtactc agggcggcgt tgttttggct 1680

gcttactcat ggtccgatga tgctgctaga tgggattcct ttgatgatgc tgaaagatac 1740

ggatacgctt tggaaaactt gcaatccgtt catggtagaa gaattgaagt cttctacact 1800

ggtgctggtc aaactcaatc atggttgaga gatccatacg cttgtggtga agctgctgtt 1860

tacactccac atcaaatgac tgcttttcat ttggatgttg ttagacctga aggtccagtt 1920

tactttgctg gtgaacatgt ttccttgaag catgcttgga ttgaaggtgc tgttgaaact 1980

gctgttagag ctgctattgc tgttaacgaa gctccagttg gtgacactgg agttactgct 2040

gctgctggta gacgaggcgc tgctgctgct actgaaccta tgagagaaga agcgttgact 2100

tct 2103

<210> 2

<211> 701

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Thr Thr Asp Thr Ala Arg Arg His Thr Gly Ala Glu Arg Ala Asn

1 5 10 15

Glu Met Thr Tyr Glu Gln Leu Ala Arg Glu Leu Leu Leu Val Gly Pro

20 25 30

Ala Pro Thr Asn Glu Asp Leu Lys Leu Arg Tyr Leu Asp Val Leu Ile

35 40 45

Asp Asn Gly Leu Asn Pro Pro Gly Pro Pro Lys Arg Ile Leu Ile Val

50 55 60

Gly Ala Gly Ile Ala Gly Leu Val Ala Gly Asp Leu Leu Thr Arg Ala

65 70 75 80

Gly His Asp Val Thr Ile Leu Glu Ala Asn Ala Asn Arg Val Gly Gly

85 90 95

Arg Ile Lys Thr Phe His Ala Lys Lys Gly Glu Pro Ser Pro Phe Ala

100 105 110

Asp Pro Ala Gln Tyr Ala Glu Ala Gly Ala Met Arg Leu Pro Ser Phe

115 120 125

His Pro Leu Thr Leu Ala Leu Ile Asp Lys Leu Gly Leu Lys Arg Arg

130 135 140

Leu Phe Phe Asn Val Asp Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Gln Asp Ala

145 150 155 160

Pro Val Pro Pro Val Phe Tyr Lys Ser Phe Lys Asp Gly Lys Thr Trp

165 170 175

Thr Asn Gly Ala Pro Ser Pro Glu Phe Lys Glu Pro Asp Lys Arg Asn

180 185 190

His Thr Trp Ile Arg Thr Asn Arg Glu Gln Val Arg Arg Ala Gln Tyr

195 200 205

Ala Thr Asp Pro Ser Ser Ile Asn Glu Gly Phe His Leu Thr Gly Cys

210 215 220

Glu Thr Arg Leu Thr Val Ser Asp Met Val Asn Gln Ala Leu Glu Pro

225 230 235 240

Val Arg Asp Tyr Tyr Ser Val Lys Gln Asp Asp Gly Thr Arg Val Asn

245 250 255

Lys Pro Phe Lys Glu Trp Leu Ala Gly Trp Ala Asp Val Val Arg Asp

260 265 270

Phe Asp Gly Tyr Ser Met Gly Arg Phe Leu Arg Glu Tyr Ala Glu Phe

275 280 285

Ser Asp Glu Ala Val Glu Ala Ile Gly Thr Ile Glu Asn Met Thr Ser

290 295 300

Arg Leu His Leu Ala Phe Phe His Ser Phe Leu Gly Arg Ser Asp Ile

305 310 315 320

Asp Pro Arg Ala Thr Tyr Trp Glu Ile Glu Gly Gly Ser Arg Met Leu

325 330 335

Pro Glu Thr Leu Ala Lys Asp Leu Arg Asp Gln Ile Val Met Gly Gln

340 345 350

Arg Met Val Arg Leu Glu Tyr Tyr Asp Pro Gly Arg Asp Gly His His

355 360 365

Gly Glu Leu Thr Gly Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Ile Gln Thr Val

370 375 380

Pro Glu Gly Glu Pro Tyr Ala Ala Thr Gln Thr Trp Thr Gly Asp Leu

385 390 395 400

Ala Ile Val Thr Ile Pro Phe Ser Ser Leu Arg Phe Val Lys Val Thr

405 410 415

Pro Pro Phe Ser Tyr Lys Lys Arg Arg Ala Val Ile Glu Thr His Tyr

420 425 430

Asp Gln Ala Thr Lys Val Leu Leu Glu Phe Ser Arg Arg Trp Trp Glu

435 440 445

Phe Thr Glu Ala Asp Trp Lys Arg Glu Leu Asp Ala Ile Ala Pro Gly

450 455 460

Leu Tyr Asp Tyr Tyr Gln Gln Trp Gly Glu Asp Asp Ala Glu Ala Ala

465 470 475 480

Leu Ala Leu Pro Gln Ser Val Arg Asn Leu Pro Thr Gly Leu Leu Gly

485 490 495

Ala His Pro Ser Val Asp Glu Ser Arg Ile Gly Glu Glu Gln Val Glu

500 505 510

Tyr Tyr Arg Asn Ser Glu Leu Arg Gly Gly Val Arg Pro Ala Thr Asn

515 520 525

Ala Tyr Gly Gly Gly Ser Thr Thr Asp Asn Pro Asn Arg Phe Met Tyr

530 535 540

Tyr Pro Ser His Pro Val Pro Gly Thr Gln Gly Gly Val Val Leu Ala

545 550 555 560

Ala Tyr Ser Trp Ser Asp Asp Ala Ala Arg Trp Asp Ser Phe Asp Asp

565 570 575

Ala Glu Arg Tyr Gly Tyr Ala Leu Glu Asn Leu Gln Ser Val His Gly

580 585 590

Arg Arg Ile Glu Val Phe Tyr Thr Gly Ala Gly Gln Thr Gln Ser Trp

595 600 605

Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Cys Gly Glu Ala Ala Val Tyr Thr Pro His

610 615 620

Gln Met Thr Ala Phe His Leu Asp Val Val Arg Pro Glu Gly Pro Val

625 630 635 640

Tyr Phe Ala Gly Glu His Val Ser Leu Lys His Ala Trp Ile Glu Gly

645 650 655

Ala Val Glu Thr Ala Val Arg Ala Ala Ile Ala Val Asn Glu Ala Pro

660 665 670

Val Gly Asp Thr Gly Val Thr Ala Ala Ala Gly Arg Arg Gly Ala Ala

675 680 685

Ala Ala Thr Glu Pro Met Arg Glu Glu Ala Leu Thr Ser

690 695 700

<210> 3

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctgctcaaa ctaacgctcc ctggggattg gctagaattt catccacttc accaggaact 60

tccacttact actacgatga atccgctggt caaggatcat gtgtttacgt tattgatact 120

ggtattgagg catcccatcc tgaatttgaa ggtagagctc aaatggttaa gacttactac 180

tactccagcc gagatggaaa cggacatggt actcattgtg ctggaactgt tggttccaga 240

acttacggag ttgctaagaa gactcaattg tttggtgtta aggttttgga tgataacggt 300

tcaggtcaat actccactat tattgctggt atggattttg ttgcttctga taagaacaac 360

agaaactgtc ctaagggagt tgttgcttct ttgtccttgg gcggaggtta ctcctcttcc 420

gttaactccg ctgctgctag attgcaatca tccggagtta tggttgctgt tgctgctggt 480

aacaacaacg ctgatgctag aaactactca ccagcttctg aaccatcagt ttgtactgtt 540

ggagcttccg atagatacga tagaagatca tccttttcaa actacggttc agttttggat 600

atttttggac caggtacttc tattttgtcc acttggattg gagggtcaac tagatctatt 660

tccggaactt ctatggctac tccacatgtt gctggattgg ctgcttactt gatgactttg 720

ggaaaaacta ctgctgcttc agcttgtaga tacattgctg atactgctaa caagggggat 780

ttgtctaaca ttccttttgg aactgttaac ttgttggctt acaacaacta ccaagct 837

<210> 4

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg

65 70 75 80

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85 90 95

Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp

100 105 110

Phe Val Ala Ser Asp Lys Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val

115 120 125

Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala

130 135 140

Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly

145 150 155 160

Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser

165 170 175

Val Cys Thr Val Gly Ala Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe

180 185 190

Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile

195 200 205

Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser

210 215 220

Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu

225 230 235 240

Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala

245 250 255

Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu

260 265 270

Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala

275

Claims

1.一种成熟L-谷氨酸氧化酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)重组菌GS115-LGOX-proteinase K使用诱导剂诱导表达重组蛋白，离心，收集上清液，经热处理，离心弃沉淀，上清液采用硫酸铵沉淀目的蛋白，离心，沉淀用缓冲液复溶，获得成熟LGOX。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，L-谷氨酸氧化酶基因具有SEQ ID NO：1所示的基因序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，蛋白酶K基因具有SEQ IDNO：3所示的基因序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.根据权利要求1或2或3所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，对重组表达载体pPIC9K-LGOX线性化的限制性内切酶为SalI。

5.根据权利要求1或2或3所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，对重组表达载体pPICZα-proteinase K线性化的限制性内切酶为SacI。

6.根据权利要求1或2或3所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，获得能够高效表达LGOX的重组菌GS115-LGOX的抗性筛选使用的抗生素为G418，获得具有高效表达LGOX的重组子GS115-LGOX-proteinase K的抗性筛选使用的抗生素为Zeocin。

7.根据权利要求1或2或3所述的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，所述诱导剂为甲醇，诱导浓度为1％。

8.根据权利要求1或2或3所述的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，热处理温度为70℃，时间为1h。

9.根据权利要求1或2或3所述的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，缓冲液为pH 6.0、浓度100mM的磷酸钾缓冲液。