CN111676182B

CN111676182B - 一种利用重组钝齿棒杆菌发酵生产精酮合剂的方法

Info

Publication number: CN111676182B
Application number: CN202010633020.8A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 徐美娟; 刘平平; 杨套伟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2040-07-02
Also published as: CN111676182A

Abstract

本发明公开了一种利用重组钝齿棒杆菌发酵生产精酮合剂的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过将谷氨酸氧化酶GOX和过氧化氢酶CAT分别于pDXW‑10和pXMJ‑19载体上进行了成功表达，随后将两种质粒一起转入钝齿棒杆菌中，通过对重组钝齿棒杆菌于5L罐上进行发酵，获得了含有L‑精氨酸和α‑酮戊二酸的发酵液。在对发酵液进行预处理后，最终按照1:1比例从发酵液中结晶获得精酮合剂。本发明方法简单、高效，节省了生产精酮合剂过程中α‑酮戊二酸的用量，在精酮合剂的生产中具有较高的应用价值。

Description

一种利用重组钝齿棒杆菌发酵生产精酮合剂的方法

技术领域

本发明涉及一种利用重组钝齿棒杆菌发酵生产精酮合剂的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-精氨酸-α-酮戊二酸盐，简称精酮合剂，是由L-精氨酸和α-酮戊二酸络合形成的氨基酸盐。精酮合剂是目前国际市场上销量日益增长的一种氨基酸盐类功能制品，不仅兼具L-精氨酸和α-酮戊二酸的生理功能，而且还能够在临床上作为营养强化剂和护肝药物保护人体生理健康。它能够促进肝细胞对营养和能量的代谢，增强人体力量和精力，促进创伤修复和肌肉增长，在营养和医学领域具有十分重要的地位。

精酮合剂可以由L-精氨酸和α-酮戊二酸按照1:1或2:1的配比结晶生成，两种比例所生成的精酮合剂在理化性质上相差不大，并且都在刺激血管舒张，促进肌肉生长等方面具有一定的作用。目前已有利用精氨酸发酵液制备结晶型精酮合剂的研究，实验直接以精氨酸发酵液为原料，通过按照一定比例加入α-酮戊二酸，进而结晶形成精酮合剂。由于α-酮戊二酸原料的价格是L-精氨酸原料价格的将近12倍，因此额外添加α-酮戊二酸，大大增加了生产成本，并且步骤多，同时增加了人工成本，因此，急需一种无须额外添加昂贵的α-酮戊二酸且可以一步法生产精酮合剂的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌为宿主过表达编码谷氨酸氧化酶GOX的基因和编码过氧化氢酶CAT的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌SYPA5-5为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸氧化酶GOX的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过氧化氢酶CAT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码谷氨酸氧化酶GOX的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码过氧化氢酶CAT的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以钝齿棒杆菌SYPA5-5为宿主，以pDXW-10质粒或pXMJ-19质粒为载体过表达编码谷氨酸氧化酶GOX的基因和编码过氧化氢酶CAT的基因。

在本发明的一种实施方式中，上述重组钝齿棒杆菌的方法包括以下步骤：

(1)将编码谷氨酸氧化酶GOX的基因gox进行人工合成，与穿梭型载体pDXW-10成功连接，获得重组质粒pDXW-10-gox，然后将重组质粒转入钝齿棒杆菌中，获得重组钝齿棒杆菌Cc-gox；

(2)将编码谷氨酸氧化酶CAT的基因cat进行人工合成，与穿梭型载体pXMJ-19成功连接，获得重组质粒pXMJ-19-cat，然后将重组质粒转入钝齿棒杆菌中，获得重组钝齿棒杆菌Cc-cat；

(3)将重组质粒pXMJ-19-cat电转入重组钝齿棒杆菌Cc-gox中，最终得到重组钝齿棒杆菌Cc-gox-cat。

本发明还提供了一种上述重组钝齿棒杆菌在生产α-酮戊二酸或L-精氨酸中的应用。

本发明还一种生产精酮合剂的方法，所述方法为将上述的重组钝齿棒杆菌的种子液接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；向发酵液中添加精氨酸进行反应，得到反应液；从反应液中分离得到精酮合剂。

在本发明的一种实施方式中，发酵液中精氨酸与α-酮戊二酸的摩尔比例为1:1或2:1。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵液的处理方法为：所述发酵液为经处理的发酵液；所述发酵液的处理方法为：先于发酵液中加入过量草酸使Ca²⁺沉淀，然后将发酵液置于50℃-70℃下放置10～15min，使蛋白质进行沉淀；再调节溶液的pH为10.0，在30℃下利用聚丙烯酰胺(400mg/mL)对发酵液进行絮凝；接着对发酵液进行离心后，加入8-15g/L活性炭，并调节pH值为4.5-5.2；最后随后于80℃下进行脱色处理；脱色处理30min后，将发酵液进行离心，获得的上清液即为经处理的发酵液。

本发明还提供了一种上述重组钝齿棒杆菌或上述生产精酮合剂的方法在生产精酮合剂中的应用。

[有益效果]

(1)本发明成功的实现了重组钝齿棒杆菌发酵产生的发酵液一步法生产精酮合剂，无需额外添加α-酮戊二酸。本发明采用的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是本实验室筛选得到的精氨酸高产突变菌株(记载于公开号为CN1441055A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCC NO.0890)，通过基因工程方法使得菌株在生产精氨酸的同时也能够生产α-酮戊二酸，就能够直接通过菌株发酵液结晶生成精酮合剂，无需外源添加大量的α-酮戊二酸，从而进一步简化精酮合剂生产步骤，节省了生产精酮合剂过程中α-酮戊二酸的用量，在精酮合剂的生产中具有较高的应用价值。

(2)本发明通过构建表达谷氨酸氧化酶GOX和过氧化氢酶CAT的重组钝齿棒杆菌Cc-gox-cat。采用5L发酵罐分批发酵策略，最终重组钝齿棒杆菌Cc-gox-cat发酵至96h，L-精氨酸产量达到46.3g/L，α-酮戊二酸产量达到49.1g/L，实现了同时高产L-精氨酸和α-酮戊二酸。

(3)采用本发明的方法通过将发酵液进行预处理、结晶获得粗产品、以及二次结晶等过程得到的精酮合剂，纯度高，经HPLC测定其纯度高达99.2％。

(4)采用本发明的方法，无需外源添加大量的α-酮戊二酸，不仅简化精酮合剂生产步骤，而且大大降低了生产成本，为精酮合剂工业化生产奠定了良好的基础。

(5)相比较于采用直接混合法制备精酮合剂，结晶型产品，二者之间没有盐键结合，产品质量受到原料的品质、混合的均匀度影响；以及采用冻干法制备精酮合剂，该工艺能够得到相对稳定的结晶型AAKG，但存在晶型不可控、冻干过程能耗大等问题，本发明提供的制备精酮合剂的方法所制备出的产品纯度更高，具有方法简便、综合成本低等优点。

附图说明

图1：GOX和CAT表达图；其中，M:蛋白Marker；泳道1：钝齿棒杆菌pDXW-10/C.crenatum SYPA5-5；泳道2：钝齿棒杆菌Cc-gox；泳道3：钝齿棒杆菌pXMJ-19/C.crenatumSYPA5-5；泳道4：钝齿棒杆菌Cc-cat；泳道5：钝齿棒杆菌Cc-gox-cat。

图2：1g/Lα-酮戊二酸标准品的HPLC液相图。

图3：发酵液中α-酮戊二酸HPLC液相图。

图4：1g/L精氨酸标准品的HPLC液相图。

图5：发酵液中精氨酸HPLC液相图。

具体实施方式

下述实施例涉及的载体pDXW-10和载体pXMJ-19购自王小元实验室，精氨酸粉末购自sigma公司，本发明采用的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是本实验室筛选得到的精氨酸高产突变菌株，记载于公开号为CN1441055A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCC NO.0890。

下述实施例中涉及的培养基如下：

BHI液体培养基：脑心浸液37.5g/L。

种子培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵40g/L，玉米浆50g/L，尿素1g/L，碳酸钙1g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，去离子水配置，pH 7.0。

发酵培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵40g/L，玉米浆50g/L，尿素1g/L，糖蜜10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，一水合硫酸锰0.02g/L，谷氨酸100g/L，去离子水配置，pH 7.0。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其pH至7.0，在121℃下高温灭菌30min，葡萄糖分消。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

L-精氨酸检测方法：选择C18色谱柱；0.05mol/L的醋酸盐缓冲液(pH 6.4)-50％乙腈溶液(75:25)为流动相；检测波长362nm；柱温30℃。

α-酮戊二酸检测方法：选择有机酸色谱柱；3mmol/L的稀硫酸为流动相；检测波长为210nm；柱温35℃。

精酮合剂检测方法：精酮合剂在水中解离为L-精氨酸和α-酮戊二酸，分别测定溶液中L-精氨酸和α-酮戊二酸的含量。

实施例1：谷氨酸氧化酶GOX的表达

将来源于Streptomyces sp.X-119-6的gox基因进行人工合成，随后将其连接到载体pDXW-10中，获得重组质粒pDXW-10-gox；然后将重组质粒pDXW-10-gox电转入钝齿棒杆菌SYPA5-5中，将长出的单菌落进行扩大培养，转接至BHI液体培养基中，提取质粒进行PCR验证，从而获得重组菌株，命名为钝齿棒杆菌Cc-gox。

以含有pDXW-10空载体的钝齿棒杆菌为阳性对照，将钝齿棒杆菌Cc-gox于BHI固体平板上划线活化后，挑取单菌落接种于10mL含卡那霉素的BHI液体培养基中，随后再以1％接种量接种至50mL BHI液体培养基中，于30℃下培养12～14h。取一定量菌液，收集菌体，加入适量溶菌酶，进行超声破碎，获得粗酶液。随后进行SDS-PAGE检测，如图1所示，谷氨酸氧化酶GOX得到成功表达。

实施例2：过氧化氢酶CAT的表达

将来源于Bacillus pumilus ML 413的cat基因进行人工合成，随后将其连接到载体pXMJ-19中，获得重组质粒pXMJ-19-cat。然后将重组质粒pXMJ-19-cat电转入钝齿棒杆菌SYPA5-5中，将长出的单菌落进行扩大培养，转接至BHI液体培养基中，提取质粒进行PCR验证，从而获得重组菌株，命名为钝齿棒杆菌Cc-cat。

以含有pXMJ-19空载体的钝齿棒杆菌为阳性对照，将钝齿棒杆菌Cc-cat于BHI固体平板上划线活化后，挑取单菌落接种于10mL含氯霉素的BHI液体培养基中，随后再以1％接种量接种至50mL BHI液体培养基中，于30℃下培养2～4h后，在培养基中加入1mM IPTG，再将培养液置于30℃下培养12h左右。取菌液，收集菌体，加入适量溶菌酶，进行超声破碎，获得粗酶液。随后进行SDS-PAGE检测，如图1所示，过氧化氢酶CAT得到成功表达。

实施例3：谷氨酸氧化酶GOX和过氧化氢酶CAT的共表达

将重组质粒pXMJ-19-cat电转入钝齿棒杆菌Cc-gox中，于平板上挑取单菌落进行扩大培养，随后提取质粒进行PCR验证，从而获得重组菌株，并将其命名为Cc-gox-cat。

以分别含有pDXW-10和pXMJ-19空载体的钝齿棒杆菌为阳性对照，将钝齿棒杆菌Cc-gox-cat于BHI固体平板上划线活化后，挑取单菌落接种于10mL含氯霉素的BHI液体培养基中，随后再以1％接种量接种至50mL BHI液体培养基中，于30℃下培养2～4h后，在培养基中加入1mM IPTG，再将培养液置于30℃下培养12h左右。取一定量菌液，收集菌体，加入适量溶菌酶，进行超声破碎，获得粗酶液。随后进行SDS-PAGE检测，如图1所示，谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶CAT的得到成功表达。

实施例4：重组钝齿棒杆菌Cc-gox-cat的发酵

具体步骤如下：

1.种子培养

将重组钝齿棒杆菌Cc-gox-cat于平板上划线活化，挑取单菌落接种于10mL种子培养基(含200mg/mL卡那霉素100mg/mL氯霉素)中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于150mL种子培养基中，30℃培养24h，得到种子液。

2.发酵培养

于5L发酵罐中加入1.5L发酵培养基，将种子液全部接种于发酵培养基中，调整发酵温度为30℃，搅拌转速为600r/min，发酵过程中pH维持在7.0左右。当培养6～8h后，于培养基中加入1mM IPTG，然后继续进行发酵，得到发酵液，发酵总时间为96h。

发酵结束后，最终菌液的菌浓达到OD₆₀₀＝88.4，通过HPLC检测发酵液中的L-精氨酸和α-酮戊二酸的产量。结果表明(如图2-图5所示)，重组钝齿棒杆菌Cc-gox-cat的L-精氨酸产量达到43.3g/L，α-酮戊二酸产量达到47.1g/L，实现了L-精氨酸和α-酮戊二酸的生产。

实施例5：利用生物法制备结晶型精酮合剂

具体步骤如下：

1.发酵液预处理

取2L实施例4所得的菌株发酵液，于菌株发酵液中加入过量草酸使Ca²⁺沉淀，然后将发酵液置于60℃下放置10～15min，使蛋白质进行沉淀。调节溶液的pH为10.0，在30℃下利用聚丙烯酰胺(400mg/mL)对发酵液进行絮凝；对发酵液离心处理后，再加入10g/L活性炭，并调节pH值为5.0，随后于80℃下进行脱色处理；30min后，将发酵液进行离心，获得清液；经测定清液中含L-精氨酸43.3g/L，α-酮戊二酸产量47.1g/L。

2.结晶

将清液进行减压浓缩，获得浓缩液，然后按照1:1的摩尔比额外再加入14.98g/L精氨酸粉末，然后缓慢将清液的温度降至15℃进行结晶，待结晶完全后，分离晶体和母液，得到结晶粗产品；再将粗产品重新溶解，加入活性炭脱色，将溶液搅拌加热至80℃保持40min后，通过板框过滤，收集精酮合剂的滤液，进行二次结晶，最终获得精酮合剂结晶产品135.66g，经HPLC测定纯度为99.2％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种利用重组钝齿棒杆菌发酵生产精酮合剂的方法

<130> BAA200449A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2124

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaccaccg ataccgcccg tcgtcatacc ggtgccgagc gcgctaacga aatgacttac 60

gagcagctgg ctcgtgagct gctgctggtt ggtcctgcgc caaccaacga agatctgaag 120

ctgcgttacc tggatgtgct gatcgacaac ggtctgaacc cacctggtcc tcctaagcgt 180

atcctgattg tcggtgcggg tatcgctggt ctggtcgcag gtgacctgct gactcgcgct 240

ggtcatgatg taaccatcct ggaggctaac gctaaccgtg tgggtggtcg tatcaagacg 300

ttccacgcga agaaaggtga gccgagccct ttcgccgacc cagcacaata cgcagaggct 360

ggtgcaatgc gtctgccatc tttccaccca ctgactctgg cactgattga caaactgggt 420

ctgaaacgcc gcctgttttt caacgtcgac atcgacccgc agaccggtaa ccaggacgcg 480

ccagtcccac cggttttcta caaaagcttc aaagacggca aaacgtggac caacggcgcc 540

ccgagcccgg agtttaaaga gccggacaaa cgcaaccaca cctggattcg caccaaccgc 600

gagcaggtgc gtcgtgcaca gtacgcaact gatccgtctt ccatcaacga aggctttcac 660

ctgaccggct gcgaaacccg tctgaccgta agcgacatgg tgaaccaggc actggagccg 720

gtacgtgatt actactccgt gaaacaggac gacggtaccc gcgtgaacaa accgttcaaa 780

gaatggctgg cgggctgggc agacgtggtg cgtgatttcg acggttacag catgggtcgc 840

ttcctgcgcg aatacgctga gttcagcgac gaagcagtgg aagcgatcgg taccatcgaa 900

aacatgacct cccgcctgca cctggcattc ttccacagct tcctgggccg ttccgatatt 960

gacccgcgcg caacttactg ggaaatcgaa ggcggctccc gtatgctgcc ggaaactctg 1020

gctaaagacc tgcgtgacca gatcgtgatg ggccaacgta tggtgcgtct ggaatactac 1080

gatccgggcc gtgacggtca tcacggcgaa ctgactggtc cgggtggtcc ggcagttgca 1140

atccaaactg taccggaagg tgaaccgtac gctgcaactc aaacctggac cggcgatctg 1200

gcaatcgtta ctatcccgtt ctccagcctg cgtttcgtga aagttacccc gccgttctct 1260

tacaaaaagc gccgcgccgt tatcgaaacc cactacgacc aggccaccaa agttctgctg 1320

gagttctccc gtcgttggtg ggagttcacc gaagcggact ggaaacgcga actggacgcg 1380

attgcgccgg gtctgtacga ctactaccag cagtggggtg aagacgatgc tgaagccgct 1440

ctggctctgc cgcagtctgt tcgtaacctg ccgactggtc tgctgggtgc tcatccgtct 1500

gttgatgaat cccgcatcgg cgaagaacag gttgaatact atcgcaactc cgaactgcgt 1560

ggcggtgtgc gtccggctac taatgcttat ggcggcggtt ctaccactga taacccgaat 1620

cgttttatgt attatccgtc tcacccggtt ccgggcaccc agggcggcgt cgttctggcg 1680

gcttattctt ggagcgatga tgccgcccgt tgggattctt ttgatgatgc ggaacgttat 1740

ggctatgcgc tggaaaatct gcagtccgtt cacggccgtc gcattgaagt cttttacacg 1800

ggcgcgggcc agactcagtc ttggctgcgt gatccgtatg cgtgtggcga agcggcggta 1860

tatacgccgc accagatgac cgcgtttcat ctggatgttg tacgtccgga aggcccggta 1920

tattttgcgg gcgaacacgt ttctctgaaa cacgcgtgga ttgaaggtgc ggttgaaacc 1980

gctgtacgtg cggctattgc tgttaatgaa gcgccggttg gcgatacggg tgtaacggcc 2040

gctgcaggtc gtcgtggcgc cgccgcagcg actgaaccga tgcgtgaaga agcgctgacg 2100

tctcaccacc accaccacca ctaa 2124

<210> 2

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacaaatt caaatcataa aaatttgaca acgaatcaag gcgtgccagt tggcgataat 60

caaaactcaa gaactgctgg tcacagaggg ccttcattcc ttgatgatta ccatttgatt 120

gaaaaacttg cacactttga ccgtgaacgt attccagagc gtgttgttca tgcaagaggc 180

gccggcgctt atggtgtgtt tgaagtagaa aatagcatgg agaaacatac aagagcagcc 240

ttcttaagtg aagaaggaaa acaaacagat gtttttgtcc gtttctcaac ggttattcac 300

cctaaaggtt cacctgaaac attacgtgac cctcgtggtt tcgctgtcaa attttatacg 360

gaagaaggca actatgatct agttgggaac aacttgccga tcttcttcat tcgtgatgca 420

ctcaaattcc ctgacatggt tcactctctt aagccagatc ctgtaaccaa cattcaagat 480

cctgaccgtt attgggattt tatgacgtta acacctgaat ccactcatat gctcacatgg 540

ctcttctctg acgaaggtat tcctgcgaac tacgctgaaa tgcgcggttc cggtgttcat 600

acgtttagat gggtaaacaa atacggagaa acaaaatatg tgaaatacca ctggagacca 660

tcagaaggca ttcgcaattt atcgatggaa gaagctgcag aaattcaagc aaacgacttc 720

cagcatgcga caagagactt gtatgatcgt attgaaaaag gaaattatcc agcatgggat 780

ctttacgttc agcttatgcc gctcagtgat tatgatgaac tagattatga tccatgtgat 840

ccgacaaaga cgtggagcga ggaagattat ccgctgcaaa aagtgggccg catgacactg 900

aaccgcaatc cagaaaattt ctttgctgaa acagagcaag ctgctttcac gccaagtgcc 960

ctagtaccag gaattgaagc atctgaagac aaactgcttc agggtcgtct gttctcttat 1020

cctgacacgc agcgtcaccg cctaggtgca aactacgtgc gcatcccagt gaactgtcct 1080

tatgcgcctg ttcacaataa ccaacaggat agctttatga caacaactcg tccaagcggt 1140

catattaact atgaaccaaa ccgttatgac gatcagccaa aagaaaaccc tcactacaaa 1200

gaaagtgaac cggttcttca cggtgaccgt atggtgagac aaaaaatcga aaaaccaaac 1260

gatttcaaac aagctggaga aaaatatcga agctactctg aagaagagaa acaagcattg 1320

atcaaaaacc tgacagctga cttgaaagac gtaaatgaaa aaacgaaatt acttgcgatc 1380

tgcaacttct atcgtgcaga tgaagattat ggacagcgtt tagcggattc actcggtgtg 1440

gatattcgct catatcttca aggaagcatg aaataa 1476

<210> 3

<211> 707

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Thr Thr Asp Thr Ala Arg Arg His Thr Gly Ala Glu Arg Ala Asn

1 5 10 15

Glu Met Thr Tyr Glu Gln Leu Ala Arg Glu Leu Leu Leu Val Gly Pro

20 25 30

Ala Pro Thr Asn Glu Asp Leu Lys Leu Arg Tyr Leu Asp Val Leu Ile

35 40 45

Asp Asn Gly Leu Asn Pro Pro Gly Pro Pro Lys Arg Ile Leu Ile Val

50 55 60

Gly Ala Gly Ile Ala Gly Leu Val Ala Gly Asp Leu Leu Thr Arg Ala

65 70 75 80

Gly His Asp Val Thr Ile Leu Glu Ala Asn Ala Asn Arg Val Gly Gly

85 90 95

Arg Ile Lys Thr Phe His Ala Lys Lys Gly Glu Pro Ser Pro Phe Ala

100 105 110

Asp Pro Ala Gln Tyr Ala Glu Ala Gly Ala Met Arg Leu Pro Ser Phe

115 120 125

His Pro Leu Thr Leu Ala Leu Ile Asp Lys Leu Gly Leu Lys Arg Arg

130 135 140

Leu Phe Phe Asn Val Asp Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Gln Asp Ala

145 150 155 160

Pro Val Pro Pro Val Phe Tyr Lys Ser Phe Lys Asp Gly Lys Thr Trp

165 170 175

Thr Asn Gly Ala Pro Ser Pro Glu Phe Lys Glu Pro Asp Lys Arg Asn

180 185 190

His Thr Trp Ile Arg Thr Asn Arg Glu Gln Val Arg Arg Ala Gln Tyr

195 200 205

Ala Thr Asp Pro Ser Ser Ile Asn Glu Gly Phe His Leu Thr Gly Cys

210 215 220

Glu Thr Arg Leu Thr Val Ser Asp Met Val Asn Gln Ala Leu Glu Pro

225 230 235 240

Val Arg Asp Tyr Tyr Ser Val Lys Gln Asp Asp Gly Thr Arg Val Asn

245 250 255

Lys Pro Phe Lys Glu Trp Leu Ala Gly Trp Ala Asp Val Val Arg Asp

260 265 270

Phe Asp Gly Tyr Ser Met Gly Arg Phe Leu Arg Glu Tyr Ala Glu Phe

275 280 285

Ser Asp Glu Ala Val Glu Ala Ile Gly Thr Ile Glu Asn Met Thr Ser

290 295 300

Arg Leu His Leu Ala Phe Phe His Ser Phe Leu Gly Arg Ser Asp Ile

305 310 315 320

Asp Pro Arg Ala Thr Tyr Trp Glu Ile Glu Gly Gly Ser Arg Met Leu

325 330 335

Pro Glu Thr Leu Ala Lys Asp Leu Arg Asp Gln Ile Val Met Gly Gln

340 345 350

Arg Met Val Arg Leu Glu Tyr Tyr Asp Pro Gly Arg Asp Gly His His

355 360 365

Gly Glu Leu Thr Gly Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Ile Gln Thr Val

370 375 380

Pro Glu Gly Glu Pro Tyr Ala Ala Thr Gln Thr Trp Thr Gly Asp Leu

385 390 395 400

Ala Ile Val Thr Ile Pro Phe Ser Ser Leu Arg Phe Val Lys Val Thr

405 410 415

Pro Pro Phe Ser Tyr Lys Lys Arg Arg Ala Val Ile Glu Thr His Tyr

420 425 430

Asp Gln Ala Thr Lys Val Leu Leu Glu Phe Ser Arg Arg Trp Trp Glu

435 440 445

Phe Thr Glu Ala Asp Trp Lys Arg Glu Leu Asp Ala Ile Ala Pro Gly

450 455 460

Leu Tyr Asp Tyr Tyr Gln Gln Trp Gly Glu Asp Asp Ala Glu Ala Ala

465 470 475 480

Leu Ala Leu Pro Gln Ser Val Arg Asn Leu Pro Thr Gly Leu Leu Gly

485 490 495

Ala His Pro Ser Val Asp Glu Ser Arg Ile Gly Glu Glu Gln Val Glu

500 505 510

Tyr Tyr Arg Asn Ser Glu Leu Arg Gly Gly Val Arg Pro Ala Thr Asn

515 520 525

Ala Tyr Gly Gly Gly Ser Thr Thr Asp Asn Pro Asn Arg Phe Met Tyr

530 535 540

Tyr Pro Ser His Pro Val Pro Gly Thr Gln Gly Gly Val Val Leu Ala

545 550 555 560

Ala Tyr Ser Trp Ser Asp Asp Ala Ala Arg Trp Asp Ser Phe Asp Asp

565 570 575

Ala Glu Arg Tyr Gly Tyr Ala Leu Glu Asn Leu Gln Ser Val His Gly

580 585 590

Arg Arg Ile Glu Val Phe Tyr Thr Gly Ala Gly Gln Thr Gln Ser Trp

595 600 605

Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Cys Gly Glu Ala Ala Val Tyr Thr Pro His

610 615 620

Gln Met Thr Ala Phe His Leu Asp Val Val Arg Pro Glu Gly Pro Val

625 630 635 640

Tyr Phe Ala Gly Glu His Val Ser Leu Lys His Ala Trp Ile Glu Gly

645 650 655

Ala Val Glu Thr Ala Val Arg Ala Ala Ile Ala Val Asn Glu Ala Pro

660 665 670

Val Gly Asp Thr Gly Val Thr Ala Ala Ala Gly Arg Arg Gly Ala Ala

675 680 685

Ala Ala Thr Glu Pro Met Arg Glu Glu Ala Leu Thr Ser His His His

690 695 700

His His His

705

<210> 4

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Thr Asn Ser Asn His Lys Asn Leu Thr Thr Asn Gln Gly Val Pro

1 5 10 15

Val Gly Asp Asn Gln Asn Ser Arg Thr Ala Gly His Arg Gly Pro Ser

20 25 30

Phe Leu Asp Asp Tyr His Leu Ile Glu Lys Leu Ala His Phe Asp Arg

35 40 45

Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala Tyr

50 55 60

Gly Val Phe Glu Val Glu Asn Ser Met Glu Lys His Thr Arg Ala Ala

65 70 75 80

Phe Leu Ser Glu Glu Gly Lys Gln Thr Asp Val Phe Val Arg Phe Ser

85 90 95

Thr Val Ile His Pro Lys Gly Ser Pro Glu Thr Leu Arg Asp Pro Arg

100 105 110

Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Glu Gly Asn Tyr Asp Leu Val

115 120 125

Gly Asn Asn Leu Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Ala Leu Lys Phe Pro

130 135 140

Asp Met Val His Ser Leu Lys Pro Asp Pro Val Thr Asn Ile Gln Asp

145 150 155 160

Pro Asp Arg Tyr Trp Asp Phe Met Thr Leu Thr Pro Glu Ser Thr His

165 170 175

Met Leu Thr Trp Leu Phe Ser Asp Glu Gly Ile Pro Ala Asn Tyr Ala

180 185 190

Glu Met Arg Gly Ser Gly Val His Thr Phe Arg Trp Val Asn Lys Tyr

195 200 205

Gly Glu Thr Lys Tyr Val Lys Tyr His Trp Arg Pro Ser Glu Gly Ile

210 215 220

Arg Asn Leu Ser Met Glu Glu Ala Ala Glu Ile Gln Ala Asn Asp Phe

225 230 235 240

Gln His Ala Thr Arg Asp Leu Tyr Asp Arg Ile Glu Lys Gly Asn Tyr

245 250 255

Pro Ala Trp Asp Leu Tyr Val Gln Leu Met Pro Leu Ser Asp Tyr Asp

260 265 270

Glu Leu Asp Tyr Asp Pro Cys Asp Pro Thr Lys Thr Trp Ser Glu Glu

275 280 285

Asp Tyr Pro Leu Gln Lys Val Gly Arg Met Thr Leu Asn Arg Asn Pro

290 295 300

Glu Asn Phe Phe Ala Glu Thr Glu Gln Ala Ala Phe Thr Pro Ser Ala

305 310 315 320

Leu Val Pro Gly Ile Glu Ala Ser Glu Asp Lys Leu Leu Gln Gly Arg

325 330 335

Leu Phe Ser Tyr Pro Asp Thr Gln Arg His Arg Leu Gly Ala Asn Tyr

340 345 350

Val Arg Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Ala Pro Val His Asn Asn Gln

355 360 365

Gln Asp Ser Phe Met Thr Thr Thr Arg Pro Ser Gly His Ile Asn Tyr

370 375 380

Glu Pro Asn Arg Tyr Asp Asp Gln Pro Lys Glu Asn Pro His Tyr Lys

385 390 395 400

Glu Ser Glu Pro Val Leu His Gly Asp Arg Met Val Arg Gln Lys Ile

405 410 415

Glu Lys Pro Asn Asp Phe Lys Gln Ala Gly Glu Lys Tyr Arg Ser Tyr

420 425 430

Ser Glu Glu Glu Lys Gln Ala Leu Ile Lys Asn Leu Thr Ala Asp Leu

435 440 445

Lys Asp Val Asn Glu Lys Thr Lys Leu Leu Ala Ile Cys Asn Phe Tyr

450 455 460

Arg Ala Asp Glu Asp Tyr Gly Gln Arg Leu Ala Asp Ser Leu Gly Val

465 470 475 480

Asp Ile Arg Ser Tyr Leu Gln Gly Ser Met Lys

485 490

Claims

1.一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌SYPA5-5为宿主，所述钝齿棒杆菌SYPA5-5的保藏编号为CGMCC NO.0890；过表达氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的谷氨酸氧化酶GOX和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的过氧化氢酶CAT；所述重组钝齿棒杆菌以pDXW-10质粒为表达载体，过表达谷氨酸氧化酶GOX，采用pXMJ-19质粒为载体过表达过氧化氢酶CAT。

2.权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌在生产α-酮戊二酸中的应用。

3.一种生产精酮合剂的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌的种子液接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；向发酵液中添加精氨酸进行反应，得到反应液；从反应液中分离得到精酮合剂。

4.如权利要求3所述的一种生产精酮合剂的方法，其特征在于，发酵液中精氨酸与α-酮戊二酸的摩尔比例为1:1或2:1。

5.如权利要求3或4所述的一种生产精酮合剂的方法，其特征在于，所述发酵液为经处理的发酵液；所述发酵液的处理方法为：先于发酵液中加入过量草酸使Ca²⁺沉淀，然后将发酵液置于50℃-70℃下放置10~15 min，使蛋白质进行沉淀；再调节溶液的pH为10.0，在30℃下利用400mg/mL的聚丙烯酰胺对发酵液进行絮凝；接着对发酵液进行离心后，加入8-15 g/L活性炭，并调节pH值为4.5-5.2；最后随后于80℃下进行脱色处理；脱色处理30 min后，将发酵液进行离心，获得的上清液即为经处理的发酵液。

6.权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌或权利要求3-5任一所述生产精酮合剂的方法在生产精酮合剂中的应用。