CN105036330B - 一种结晶型精酮合剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种结晶型精酮合剂的制备方法，该方法直接从L‑精氨酸发酵液进行制备AAKG，将AAKG的生产有效的整合到L‑精氨酸发酵产物的后提取过程中，从整体上缩短流程，显著降低生产成本，整个过程废液得到了有效处理，节能环保。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结晶型精酮合剂的制备方法。
背景技术
L-精氨酸·α-酮戊二酸盐（AAKG）简称精酮合剂，是由L-精氨酸和α-酮戊二酸络合形成的氨基酸盐，可以从溶液中以盐的形式结晶析出。在不同的结晶条件下，精酮合剂可以形成单精氨酸酮戊二酸盐（MAAKG）和双精氨酸酮戊二酸盐（DAAKG）两种形式，目前研究和应用较多的主要是单精氨酸酮戊二酸，其晶型为无色棱柱状，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮、乙醚等，在水溶液中能够完全解离为L-精氨酸和α-酮戊二酸。
L-精氨酸·α-酮戊二酸盐不仅兼具L-精氨酸和α-酮戊二酸的生理功能，且可以作为功能性营养强化剂和护肝药物用于临床。L-精氨酸·α-酮戊二酸盐常用于保健品原料、运动营养强化剂。L-精氨酸·α-酮戊二酸盐能够在短期内促进一氧化氮的水平，增强蛋白质同化作用，因此能够增强力量并显著提高精力；增强体格，促进肌肉的快速增长和创伤恢复；还能促进肝细胞对营养和能量的代谢，增强力量和精力。
精酮合剂有1:1和2:1（L-精氨酸：α-酮戊二酸）两种配比的盐，即单精氨酸酮戊二酸盐和双精氨酸酮戊二酸盐，两种精酮合剂理化性质非常接近，但是在功能和应用领域上有一定的差异。单精氨酸酮戊二酸盐（MAAKG）主要的作用是增加血液一氧化氮水平，刺激血管舒张，促进训练后的肌肉生长，作为保健品、运动强壮剂在美国市场上很受青睐。双精氨酸酮戊二酸盐（DAAKG）是一种拥有多种生理作用的有机酸盐，对肝硬化病人给予高剂量的DAAKG，其肝脏脱毒功能得到增强，血浆氨、血清酚浓度得到显著降低，其氧化分解作用得到增强。这种作用在治疗氨中毒或用于强化肝脏解毒功能的动物模型试验中也得到证明，治疗组的存活率相对于控制组较高，而且较少出现昏迷。
文献“由L-精氨酸发酵液制备结晶型精酮合剂，食品与发酵工程，2012年”公开了一种L-精氨酸发酵液制备结晶型精酮合剂的方法，该方法直接从L-精氨酸发酵液进行制备AAKG，将AAKG的生产有效的整合到L-精氨酸发酵产物的后提取过程中，从整体上缩短流程，显著降低了生产成本；但是该方法产生了大量的废水，如何处理废水是亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种结晶型精酮合剂的制备方法，该方法将废液进行了有效处理，节能环保。为了实现本发明目的，采用如下技术方案：
为了实现本发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种结晶型精酮合剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1）：往L-精氨酸发酵液加入草酸沉淀Ca2+，再调节溶液为pH9.5，用聚丙烯酰胺对溶液进行絮凝，然后离心去除固形物，收集上层溶液；往上层溶液中加入活性炭，调节pH4.8，脱色处理40min，最后离心得L-精氨酸清液；
步骤2）：向步骤1）的L-精氨酸清液中缓慢加入α-酮戊二酸，搅拌使其完全溶解，减压浓缩，然后缓慢降温，置于15℃下恒温结晶26h，待结晶完全后，分离晶体和一次目液，得到粗产品AAKG；
步骤3）：将步骤2）得到的粗产品AAKG晶体重新溶解，加入活性炭进行脱色，搅拌并将溶液加热至80℃，维持40min，再通过板框过滤，收集AAKG滤液，重结晶，然后过滤收集晶体和二次母液；
步骤4）：合并一次母液和二次母液得到废液，调整废液的pH为7-7.5，然后按照5g生物制剂：1立方米废液的添加量添加生物制剂，再静置六天，排出。
所述生物制剂按照如下方法制备而成：
步骤A）制备生物载体：
（1）按照重量份称取下述各原料备用，其中，水25份，褐煤10份，高岭土8份，沸石粉6份，甲壳素4份，硅胶粉1份；其中，沸石粉和硅胶粉的粒径均为200目，甲壳素的粒径为50目；
（2）将褐煤用破碎机进行破碎，然后添加高岭土，混合均匀，研磨至100目的粉末，即为物料1；
（3）向沸石粉中添加相同重量的1M氯化钙溶液，搅拌均匀，然后350℃焙烧3小时，得到物料2；
（4）将水，物料1，物料2，甲壳素以及硅胶粉依次添加到搅拌反应器中，500转/min搅拌10min，静置30min，然后200转/min搅拌3min，最后置于60℃烘干至水分含量为5％，即得生物载体；
步骤B）制备生物制剂：
将枯草芽孢杆菌，鲍曼不动杆菌、巨大芽孢杆菌以及鞘氨醇单胞菌分别培养至浓度为1×107个/ml的菌液，将斜生栅藻培养至浓度为1×105个/ml的藻液，将上述培养的枯草芽孢杆菌液、巨大芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌液、鞘氨醇单胞菌液以及斜生栅藻液按照2：2：1：1：1的体积比混合，静置6小时，得到混合液体；将混合液体与生物载体按照1：2的质量比混合搅拌均匀，室温发酵24h，干燥至含水量为10％，即得。
所述巨大芽孢杆菌为（Bacillus megatherium）CGMCC No：2267，枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）CGMCC NO： 2947，鲍曼不动杆菌为(Acinetobacter baumanii) ATCC19606，鞘氨醇单胞菌为（Sphingomonas sp．）CGMCC NO.4589，斜生栅藻为（Scenedesmusobliquus）CGMCC No.8015。
本发明所述菌种和藻类均可以从保藏中心等商业途径购买得到。
本发明所述的菌种和藻类均可通过常规的培养方法得到所需浓度的菌液或藻液，此并非本发明的创新点，限于篇幅，并不一一赘述。
本发明取得的有益效果主要包括：
本发明直接从L-精氨酸发酵液进行制备AAKG，将AAKG的生产有效的整合到L-精氨酸发酵产物的后提取过程中，从整体上缩短流程，显著降低生产成本，整个过程废液得到了有效处理，节能环保；
本发明处理发酵废液的方法简单可行，成本低廉，处理效果好；本发明提供的载体，采用不同粒径的原料，不仅能够扩大载体的比表面积，而且具有抗拉强度大、分布均匀、比表面积大，使用寿命长等特点；本发明提供的载体能够大大提高微生物的附着量，增加整体附着的生物膜量，反应槽中的微生物浓度得以提高，并且能够减少污泥产生量；本发明载体提供的厌氧、缺氧和好氧的多样环境的存在可以促进硝化反硝化效果，同时促进污泥的减量化，有利于废液中氨氮等污染物的去除；本发明的生物制剂将各种能形成优势菌群的菌种和藻类，配制成高效生物制剂，各微生物之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，生物量大，繁殖快。
本发明生物制剂适于发酵废液处理，便于运输及保存，使用时更容易激活，运行成本低廉。
实施例1
一种结晶型精酮合剂的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1）：将发酵制备的L-精氨酸发酵液5L，先加入100g草酸沉淀Ca2+，在 55℃下加热15min沉淀蛋白质；调节溶液pH9.5，在30℃左右用聚丙烯酰胺（400mg/L）对发酵液进行絮凝，然后离心去除菌体等固形物，收集上层溶液；往上层溶液中加入50g活性炭，调节pH4.8，加热至70℃进行脱色处理40min，最后经过离心得L-精氨酸清液4.2L，经测定溶液中L-精氨酸的含量59g/L，溶液中共含有L-精氨酸1.42mol；
步骤2）：向步骤1）的L-精氨酸清液中缓慢加入α-酮戊二酸固体粉末207g，搅拌使其完全溶解，减压浓缩，获得浓缩液0.84L，按照一定的速率缓慢降温，置于15℃下恒温结晶26h，待结晶完全后，分离晶体和一次母液，得到粗产品AAKG晶体342.04g，收得率为75.3%；
步骤3）：将步骤（3）粗产品AAKG晶体340g重新溶解，加入适量的活性炭进行脱色，搅拌并将溶液加热至80℃，维持40min，再通过板框过滤，收集AAKG滤液；向收集的滤液中加入乙醇，在15℃下进行重结晶26h，然后过滤收集晶体和二次母液，并用少量冷乙醇淋洗晶体2次，置于50℃下真空干燥得到结晶型AAKG产品310.08g，收得率为91.2%，经高效液相色谱仪测定纯度为99.3%；AAKG产品的总收得率为68.17%；
步骤4）：合并一次母液和二次母液得到废液，调整废液的pH为7-7.5，然后按照5g生物制剂：1立方米废液的添加量添加生物制剂，再静置六天，排出。
实施例2
一种处理废液的生物制剂，其按照如下方法制备而成：
制备生物载体：
（1）按照重量份称取下述各原料备用，其中，水25份，褐煤10份，高岭土8份，沸石粉6份，甲壳素4份，硅胶粉1份；其中，沸石粉和硅胶粉的粒径均为200目，甲壳素的粒径为50目；
（2）将褐煤用破碎机进行破碎，然后添加高岭土，混合均匀，研磨至100目的粉末，即为物料1；
（3）向沸石粉中添加相同重量的1M氯化钙溶液，搅拌均匀，然后350℃焙烧3小时，得到物料2；
（4）将水，物料1，物料2，甲壳素以及硅胶粉依次添加到搅拌反应器中，500转/min搅拌10min，静置30min，然后200转/min搅拌3min，最后置于60℃烘干至水分含量为5％（重量份数），即得生物载体；
制备生物制剂：
将枯草芽孢杆菌，鲍曼不动杆菌、巨大芽孢杆菌以及鞘氨醇单胞菌分别培养至浓度为1×107个/ml的菌液，将斜生栅藻培养至浓度为1×105个/ml的藻液，将上述培养的枯草芽孢杆菌液、巨大芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌液、鞘氨醇单胞菌液以及斜生栅藻液按照2：2：1：1：1的体积比混合，静置6小时，得到混合液体；将混合液体与生物载体按照1：2的质量比混合搅拌均匀，室温发酵24h，干燥至含水量为10％（重量份数），即得。
其中，巨大芽孢杆菌为（Bacillus megatherium）CGMCC No：2267(可参见CN101215532)，枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）CGMCC NO： 2947(可参见CN101838621A)，鲍曼不动杆菌为(Acinetobacter baumanii) ATCC 19606（可参见InfectImmun. 2012 Mar;80(3):1015-24），鞘氨醇单胞菌为（Sphingomonas sp．）CGMCC NO.4589（可参见CN102168054A），斜生栅藻为（Scenedesmus obliquus）CGMCC No.8015（可参见CN103484374A）。
实施例3
实施例2制备的生物制剂在实施例1中的应用：
以去实施例1的废液为处理样品进行试验。
对照组1：使用硅藻土载体；微生物类型和试验组相同；处理方式：连续投加三天后，每天5g/立方米，再静置六天，检测处理结果见表1。
对照组2：载体与实施例2相同，不同之处是，仅添加四种菌，不添加斜生栅藻；处理方式：第一天投加5g/立方米，再静置六天，检测处理结果见表1。
试验组：本发明实施例2制备的生物制剂；处理方式：投加一天后，5g/立方米，再静置六天，检测处理结果见表1。
表1
| 处理前（mg/L） | 处理后（对照组1）（mg/L） | 处理后（对照组2）（mg/L） | 处理后（试验组）（mg/L） | |
| COD | 1623 | 21.2 | 45.3 | 5.1 |
| NH3-N | 209 | 13.9 | 16.7 | 2.6 |
| 硫化物 | 24.5 | 6.3 | 3.8 | 1.1 |
| 氯离子 | 22.6 | 4.2 | 5.1 | 0.5 |
结论：本发明制备的生物载体表面粗糙，比表面积大，微生物附着效果好，而且投入次数和重量均减少，使用寿命长，无需多次投放，节约了成本，降低了污泥的产生量。本发明生物制剂中菌类和藻类合理配伍，能够有效地去除发酵废液中的各类污染物，完全达到排放标准。本发明处理废液的方法简单可行，效果好，成本低廉，容易被企业所接受。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种结晶型精酮合剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）：往L-精氨酸发酵液加入草酸沉淀Ca2+，再调节溶液pH为9.5，用聚丙烯酰胺对溶液进行絮凝，然后离心去除固形物，收集上层溶液；往上层溶液中加入活性炭，调节pH4.8，脱色处理40min，最后离心得L-精氨酸清液；
步骤2）：向步骤1）的L-精氨酸清液中缓慢加入α-酮戊二酸，搅拌使其完全溶解，减压浓缩，然后缓慢降温，置于15℃下恒温结晶26h，待结晶完全后，分离晶体和一次母液，得到粗产品AAKG；
步骤3）：将步骤2）得到的粗产品AAKG晶体重新溶解，加入活性炭进行脱色，搅拌并将溶液加热至80℃，维持40min，再通过板框过滤，收集AAKG滤液，重结晶，然后过滤收集晶体和二次母液；
步骤4）：合并一次母液和二次母液得到废液，调整废液的pH为7-7.5，然后按照5g生物制剂：1立方米废液的添加量添加生物制剂，再静置六天，排出；
所述生物制剂按照如下方法制备而成：
步骤A）制备生物载体：
（1）按照重量份称取下述各原料备用，其中，水25份，褐煤10份，高岭土8份，沸石粉6份，甲壳素4份，硅胶粉1份；其中，沸石粉和硅胶粉的粒径均为200目，甲壳素的粒径为50目；
（2）将褐煤用破碎机进行破碎，然后添加高岭土，混合均匀，研磨至100目的粉末，即为物料1；
（3）向沸石粉中添加相同重量的1M氯化钙溶液，搅拌均匀，然后350℃焙烧3小时，得到物料2；
（4）将水，物料1，物料2，甲壳素以及硅胶粉依次添加到搅拌反应器中，500转/min搅拌10min，静置30min，然后200转/min搅拌3min，最后置于60℃烘干至水分含量为5％，即得生物载体；
步骤B）制备生物制剂：
将枯草芽孢杆菌，鲍曼不动杆菌、巨大芽孢杆菌以及鞘氨醇单胞菌分别培养至浓度为1×107个/ml的菌液，将斜生栅藻培养至浓度为1×105个/ml的藻液，将上述培养的枯草芽孢杆菌液、巨大芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌液、鞘氨醇单胞菌液以及斜生栅藻液按照2：2：1：1：1的体积比混合，静置6小时，得到混合液体；将混合液体与生物载体按照1：2的质量比混合搅拌均匀，室温发酵24h，干燥至含水量为10％，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌为（Bacillusmegatherium）CGMCC No：2267，枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）CGMCC NO： 2947，鲍曼不动杆菌为(Acinetobacter baumanii) ATCC 19606，鞘氨醇单胞菌为（Sphingomonassp．）CGMCC NO.4589，斜生栅藻为（Scenedesmus obliquus）CGMCC No.8015。
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