CN102586331B - 一种高浓度发酵制备生物絮凝剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高浓度发酵制备生物絮凝剂的方法，属于生物工程领域。本发明选用微球菌DS16为生物絮凝剂的生产菌种，采用菌量优势方式的高浓度发酵生产用于水质净化的生物絮凝剂。制备过程包括生产菌种制备、发酵液制备、发酵液预处理、产品提取。制备的生物絮凝剂无毒、无害，具有生物可降解性，可安全、高效地应用于分离去除污染废水中的重金属和其它污染物质，使用无二次污染。本发明高浓度发酵制备生物絮凝剂的方法具有生产成本低，可进行大规模生产，发酵产量高(产量≥2.0％)和产品活性高(每克粉状产品能够从水中分离去除700克污染物)等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有絮凝和吸附功能的生物絮凝剂的制备方法，尤其是涉及一种通过高浓度发酵方式生产用于水质净化处理的生物絮凝剂的方法，属于生物工程领域。
背景技术
目前，随着工业的快速发展和人口的急剧增加，城镇饮用地表水需求量和工业废水、城市生活污水、养殖废水排放量与日俱增。由于污水排放类型不断上升，水中的污染物成分变得越来越复杂，因此对污水进行处理的难度也越来越大。如果处理不当，会对工农业生产和人类健康带来严重威胁。利用絮凝剂对污染物絮凝处理是对水质进行净化的有效手段。但是目前使用的化学絮凝剂容易造成对环境的二次污染，例如：老年痴呆与现在广泛使用的含铝无机絮凝剂有关；有机高分子絮凝剂聚丙烯酰胺的单体是直接的致癌、致畸、致突变剂，并具有强烈的神经毒性。并且随着化学絮凝剂用量的不断增加，使生态环境更加恶化。因此，研究与开发高效生物絮凝剂已成为大势所趋。
国务院办公厅2007年4月8日以国办发〔2007〕23号发布的国家发改委《生物产业发展“十一五”规划》中明确规定：国家重点支持发展高性能的生物水处理絮凝剂、混凝剂等生物环保技术。微生物絮凝剂的研发符合国家发改委会令第9号公布的《产业结构调整指导目录(2011年本)》第一类“鼓励类”的第2章“水利”的第3条“城乡供水水源工程”；第38章“环境保护与资源节约综合利用”的第2条“海洋环境保护及科学开发”、第16条“三废处理用生物菌种和添加剂开发与生产”、第18条“重复用水技术应用”以及第22条“新型水处理药剂开发与生产”中的规定。
微生物絮凝剂是由特殊代谢功能的微生物产生的具有絮凝和吸附作用的生物高分子。微生物絮凝剂最突出的特点是具有生物可降解性，它是一种高效、无毒，使用无二次污染的环境友好型水质净化剂。微球菌DS16是由山东省医药生物技术研究中心分离并保存的一产生高效微生物多糖絮凝剂的菌株(黄俊，栾兴社，王世立，等.响应面法优化微球菌DS16产絮凝剂的条件.化工科技[J]，2009，17(4)：17～22.)，该菌株属于真细菌目微球菌科微球菌属。在上述文章中，作者通过实验证明：对生物絮凝剂的产生来说，液糖与(NH4)2SO4具有交互作，Mn2+的促进作用明显，其絮凝活性达98％。但是该技术在实际应用中存在着产品浓度低(产品产量≤0.76％(w/v))、生产效率低、操作繁琐、成本高等不足，限制了广泛推广与应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种产品浓度高、效率高、易于操作、成本低的实用产业化工艺。
本发明的技术方案是：一种高浓度发酵制备生物絮凝剂的方法，其特征是，将微生物絮凝剂产生菌微球菌DS16通过生产菌种制备、发酵、发酵液预处理、产品提取生产高效微生物絮凝剂，具体包括以下步骤：
(1)生产菌种的扩大培养
①斜面培养基及斜面菌种培养
斜面培养基：牛肉膏3-6g/L，大豆蛋白胨8-12g/L，液糖7-12g/L，NaCl 3-6g/L，pH7.0-7.2；
将微球菌DS16接种于新鲜斜面，并在28-30℃保温培养36h；
②摇瓶培养基及摇瓶菌种培养
摇瓶培养基：液糖8-12g/L，大豆蛋白胨6-12g/L，酵母提取物0.3-0.8g/L，K2HPO4 3-8g/L，KH2PO42-7g/L，MgSO4·7H2O 0.3-0.9g/L，pH7.2；
每300mL三角瓶装液体摇瓶培养基70mL，每瓶接种斜面菌种一接种环，180r/min，28-30℃保温培养8-12h；
③生产菌种培养基及生产菌种培养
生产菌种培养基同摇瓶培养基；按2-5％的体积比接入摇瓶菌种进行通气培养，无菌空气通风比1∶0.35-0.65(V/V)，搅拌转速为150-250r/min，27-30℃下培养9-15h，得生产菌种备用；培养完成后菌体形态均一，菌种生长光密度OD值净增0.5以上。
(2)发酵
①发酵培养基
基础发酵培养基：液糖18-28g/L，尿素0.4-0.9g/L，(NH4)2SO41-5g/L，大豆蛋白胨0.6-1.2g/L，K2HPO43-8g/L，NaH2PO42-7g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.028g/L，MnCl2·H2O 0.035g/L，pH7.2；
补料发酵培养基：液糖48-68g/L；尿素1.0-3.0g/L，pH7.2；
②接种及发酵(采用菌量优势方式进行高浓度发酵)
发酵罐A中装入基础发酵培养基，然后按体积比5-10％接入生产菌种进行搅拌通气培养8-12h后，将培养液平均分装到三台发酵罐B中；然后分别在三台发酵罐B中加入培养液体积2倍的补料发酵培养基，继续培养22-30h；所述发酵罐A的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.35-0.75(V/V)，搅拌转速为120-180r/min，温度为22-32℃，罐压为0.01-0.03MPa；所述发酵罐B控制的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.25-0.65(V/V)，搅拌转速为90-170r/min，温度为20-30℃，罐压为0.01-0.03MPa；
(3)发酵液预处理
将发酵液升温至65-80℃，维持10-20min，使菌体灭活并充分变性，然后趁热以离心机离心去除菌体及其它杂质，得预处理发酵液备用；所述离心机转速优选为6000-8000转/分；
(4)产品提取与制成
以氢氧化钠溶液(其浓度优选为重量百分比为8-12％)调节预处理发酵液pH为5.8-7.5，在50-90r/min充分搅拌下加入1.6-2.6倍预处理发酵液体积的90％-95％(V/V)乙醇，得沉淀；将沉淀用离心机离心，将所得固形物以90％-95％(V/V)的乙醇充分洗涤；将含醇固形物用真空干燥器在真空度-0.07Mpa，35-45℃下干燥至水分小于5％，用粉碎机粉碎。产品产量≥2.0％(w/v发酵液)，收率≥95％。
本发明生产的微生物絮凝剂可广泛地应用于城镇饮用水原水、工业废水、城市生活污水、养殖废水、发酵工业分离纯化、生物量回收等，添加量为0.1-10mg/L；使用时将其配成重量百分比千分之一的溶液，按需要量直接搅拌加入到需要处理的污染水体中进行絮凝和吸附。继而通过沉淀分离工艺过程将污染物从水体中进行分离。
本发明的技术效果是：本发明制备微生物絮凝剂的方法具有工艺简单，生产成本低(与现有发酵方式相比，耗用同等质量分数的碳源的条件下，产量提高了33％，吨产品总能耗降低30％)，可进行大规模生产，发酵产量高和产品活性高(每克产品能够从水中分离去除700克以上的污染物)等特点。产品理化与微生物指标达到了食品级要求(山东省食品质量监督检验站检验报告，W20040723015。检验结果说明：样品水分7.5％，样品铅＜0.5mg/Kg，砷＜0.3mg/Kg，大肠杆菌＜30个/100g，致病菌未检出)。本发明的微生物絮凝剂与现有的化学产品相比具有无毒、无害(山东省疾病预防控制中心检验报告，鲁疾控检字2004D059。检验结果说明：该样品急性经口毒性实验属实际无毒；Ames实验结果为阴性；对小鼠骨髓嗜多染红细胞无致微核作用)、可生物降解、具有去除有机无机物和重金属的复合功能(加量3mg/L对黄河水(饮用水原水)进行絮凝和吸附处理，SS去除率≥98％，COD去除率≥87％，铁离子去除率≥99％，锰离子去除率≥98％；加量3mg/L对生活污水进行絮凝和吸附处理，COD去除率≥93％，铁离子去除率≥99％，铜离子去除率≥95％)、使用方便(直接应用于水质净化，不需复杂的操作)、净化速度快(5-30min固液分离)的优势。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明，本发明实施例中各培养基(斜面培养基、摇瓶培养基、生产菌种培养基、发酵培养基、补料培养基)均经过0.1Mpa高压蒸汽灭菌，121℃下灭菌20-30min。
实施例1：
(1)生产菌种的扩大培养
①斜面培养基及斜面菌种培养：牛肉膏4g/L，大豆蛋白胨10g/L，液糖7g/L，NaCl 5g/L，pH7.0-7.2；将微球菌DS16接种于新鲜斜面，并在28-30℃保温培养36h。
②摇瓶培养基及摇瓶菌种培养：液糖8g/L，大豆蛋白胨9g/L，酵母提取物0.3g/L，K2HPO44g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，pH7.2；每300mL三角瓶装液体摇瓶培养基70mL，每瓶接种斜面菌种一接种环，180r/min，28-30℃保温培养9h。
③生产菌种培养基及生产菌种培养：生产菌种培养基同摇瓶培养基；按2.5％的体积比接入摇瓶菌种进行通气培养，无菌空气通风比1∶0.4(V/V)，搅拌转速为180r/min，27-30℃下培养10h，得生产菌种备用；培养完成后菌体形态均一，菌种生长光密度OD值净增0.5以上。
(2)发酵
①发酵培养基
基础发酵培养基各组分重量配比为(g/L)：液糖20，尿素0.4，(NH4)2SO42，大豆蛋白胨1.0，K2HPO43，NaH2PO43，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.028，MnCl2·H2O 0.035，pH7.2。
补料发酵培养基各组分重量配比为(g/L)：液糖50，尿素11，pH为7.2。
②接种及发酵
等容积搅拌通气发酵罐A一台、发酵罐B三台，装料系数为75％。
发明采用菌量优势方式进行高浓度发酵：将基础发酵培养基分装于发酵罐A中，然后按体积比5％接入的生产菌种进行搅拌通气培养10h后，将其中培养液平均分装到三台发酵罐B中，然后分别在三台发酵罐B中补足装料总体积2/3(培养液体积的2倍)的灭菌补料发酵培养基进行继续培养26h，直到发酵结束。所得发酵液进入预处理。罐A中的培养液分装到发酵罐B中后即可开始下批培养。发酵罐A控制的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.45(V/V)，搅拌转速为130r/min，29℃，罐压为0.01MPa；发酵罐B控制的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.35(V/V)，搅拌转速为110r/min，20-30℃，罐压为0.02MPa；
(3)发酵液预处理将发酵液升温至65℃，维持18min，使菌体灭活并充分变性，然后趁热以离心机离心去除菌体及其它杂质，得预处理发酵液备用。
(4)产品提取与制成用重量百分比为11％的NaOH溶液调节预处理发酵液pH为6.5，在55r/min充分搅拌下加入2.0倍体积的93％(V/V)乙醇，得沉淀，将沉淀用离心机离心5min，将所得固形物用8倍93％(V/V)乙醇充分洗涤，将含醇固形物用真空干燥器在真空度-0.07Mpa，43℃下干燥至水分小于5％，用粉碎机粉碎成80目粉状。产品产量≥2.03％(w/v)，收率＞95.2％。
实施例2：
(1)生产菌种的扩大培养
①斜面培养基及斜面菌种培养：牛肉膏3.5g/L，大豆蛋白胨9g/L，液糖8g/L，NaCl 4g/L，pH7.0-7.2；将微球菌DS16接种于新鲜斜面，并在28-30℃保温培养36h。
②摇瓶培养基及摇瓶菌种培养：液糖9g/L，大豆蛋白胨8g/L，酵母提取物0.4g/L，K2HPO45g/L，KH2PO42.5g/L，MgSO4·7H2O 0.35g/L，pH7.2；每300mL三角瓶装液体摇瓶培养基70mL，每瓶接种斜面菌种一接种环，180r/min，28-30℃保温培养8-12h。
③生产菌种培养基及生产菌种培养：生产菌种培养基同摇瓶培养基；按3％的体积比接入发明的摇瓶菌种进行通气培养，无菌空气通风比1∶0.5(V/V)，搅拌转速为160r/min，27-30℃下培养9，得生产菌种备用；培养完成后菌体形态均一，菌种生长光密度OD值净增0.5以上。
(2)发酵
①发酵培养基
基础发酵培养基各组分重量配比为(g/L)：液糖20，尿素0.45，(NH4)2SO41.5，大豆蛋白胨0.8，K2HPO43.5，NaH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.15，FeSO4·7H2O 0.028，MnCl2·H2O 0.035，pH为7.2。
补料发酵培养基各组分重量配比为(g/L)：液糖53，尿素1.2，pH为7.2。
②接种及发酵
等容积搅拌通气发酵罐A一台、发酵罐B三台，装料系数为75％。
发明采用菌量优势方式进行高浓度发酵：发酵罐A中装入基础发酵培养基，然后按体积比6％接入生产菌种进行搅拌通气培养10h后，将其中培养液平均分装到三台发酵罐B中，然后分别在三台发酵罐B中补足装料总体积2/3的灭菌补料发酵培养基进行继续培养27h，直到发酵结束。所得发酵液进入预处理。罐A中的培养液分装到发酵罐B中后即可开始下批培养。发酵罐A控制的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.48(V/V)，搅拌转速为130r/min，30℃，罐压为0.01MPa；发酵罐B控制的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.3(V/V)，搅拌转速为105r/min，28℃，罐压为0.02MPa；
(3)发酵液预处理将发酵液升温至70℃，维持15min，使菌体灭活并充分变性，然后趁热以离心机离心去除菌体及其它杂质，得预处理液发酵备用。
(4)产品提取与制成用重量百分比为9％的NaOH溶液调节预处理发酵液pH为6.8，在60r/min充分搅拌下加入1.9倍体积的93％(V/V)乙醇，得沉淀，将沉淀用离心机离心4min，将所得固形物用7倍95％(V/V)乙醇充分洗涤，将含醇固形物用真空干燥器在真空度-0.07Mpa，42℃下干燥至水分小于5％，用粉碎机粉碎成80目粉状。产品产量≥2.1％(w/v)，收率≥95.2％。
实施例3：
(1)生产菌种的扩大培养
①斜面培养基及斜面菌种培养：牛肉膏4.2g/L，大豆蛋白胨8.5g/L，液糖9g/L，NaCl4.5g/L，pH7.0-72；将微球菌DS16接种于新鲜斜面，并在28-30℃保温培养36h。
②摇瓶培养基及摇瓶菌种培养：液糖10g/L，大豆蛋白胨9.5g/L，酵母提取物0.35g/L，K2HPO45.5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH7.2；每300mL三角瓶装液体摇瓶培养基70mL，每瓶接种斜面菌种一接种环，180r/min，28-30℃保温培养8-12h。
③生产菌种培养基及生产菌种培养：生产菌种培养基同摇瓶培养基；按3.5％的体积比接入发明的摇瓶菌种进行通气培养，无菌空气通风比1∶0.55(V/V)，搅拌转速为180r/min，27-30℃下培养9h，得生产菌种备用；培养完成后菌体形态均一，菌种生长光密度OD值净增0.5以上。
(2)发酵
①发酵培养基及制备
基础发酵培养基各组分重量配比为(g/L)：液糖18，尿素0.4，(NH4)2SO41.5，大豆蛋白胨0.65，K2HPO43.5，NaH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.15，FeSO4·7H2O 0.028，MnCl2·H2O 0.035，pH7.2。
补料发酵培养基各组分重量配比为(g/L)：液糖55，尿素1.3，pH为7.2。
②接种及发酵
等容积搅拌通气发酵罐A一台、发酵罐B三台，装料系数为75％。
发明采用菌量优势方式进行高浓度发酵：发酵罐A中装入基础发酵培养基，然后按体积比8％接入生产菌种进行搅拌通气培养9h后，将其中培养液平均分装到三台发酵罐B中，然后分别在三台发酵罐B中补足装料总体积2/3的灭菌补料发酵培养基进行继续培养28h，直到发酵结束。所得发酵液进入预处理。罐A中的培养液分装到发酵罐B中后即可开始下批培养。发酵罐A控制的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.55(V/V)，搅拌转速为130r/min，30℃，罐压为0.01MPa；发酵罐B控制的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.35(V/V)，搅拌转速为100r/min，28℃，罐压为0.02MPa；
(3)发酵液预处理将发酵液升温至75℃，维持13min，使菌体灭活并充分变性，然后趁热以离心机离心去除菌体及其它杂质，得预处理发酵液备用。
(4)产品提取与制成用重量百分比为10％的NaOH溶液调节预处理发酵液pH为6.6，在70r/min充分搅拌下加入1.8倍体积的95％(V/V)乙醇，得沉淀，将沉淀用离心机离心5min，将所得固形物用9倍90％(V/V)乙醇充分洗涤，将含醇固形物用真空干燥器在真空度-0.07Mpa，42℃下干燥至水分小于5％，用粉碎机粉碎成80目粉状。产品产量≥2.17％(w/v)，收率＞95.3％。
Claims (4)
1.一种高浓度发酵制备生物絮凝剂的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)生产菌种的扩大培养
①斜面培养基及斜面菌种培养
斜面培养基：牛肉膏3-6g/L，大豆蛋白胨8-12g/L，液糖7-12g/L，NaCl 3-6g/L，pH7.0-7.2；
将微球菌DS16接种于新鲜斜面，并于28-30℃下保温培养36h；
②摇瓶培养基及摇瓶菌种培养
摇瓶培养基：液糖8-12g/L，大豆蛋白胨6-12g/L，酵母提取物0.3-0.8g/L，K2HPO43-8g/L，KH2PO42-7g/L，MgSO4·7H2O 0.3-0.9g/L，pH7.2；
每300mL三角瓶装液体摇瓶培养基70mL，每瓶接种斜面菌种一接种环，180r/min，28-30℃保温培养8-12h；
③生产菌种培养基及生产菌种培养
生产菌种培养基同摇瓶培养基；按2-5％的体积比接入摇瓶菌种进行通气培养，无菌空气通风比1∶0.35-0.65(V/V)，搅拌转速为150-250r/min，27-30℃下培养9-15h，得生产菌种备用；
(2)发酵
①发酵培养基
基础发酵培养基：液糖18-28g/L，尿素0.4-0.9g/L，(NH4)2SO41-5g/L，大豆蛋白胨0.6-1.2g/L，K2HPO43-8g/L，NaH2PO42-7g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.028g/L，MnCl2·H2O 0.035g/L，pH7.2；
补料发酵培养基：液糖48-68g/L；尿素1.0-3.0g/L，pH7.2；
②接种及发酵
发酵罐A中装入基础发酵培养基，然后按体积比5-10％接入生产菌种进行搅拌通气培养8-12h后，将培养液平均分装到三台发酵罐B中；然后分别在三台发酵罐B中加入培养液体积2倍的补料发酵培养基，继续培养22-30h；所述发酵罐A的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.35-0.75(V/V)，搅拌转速为120-180r/min，温度为22-32℃，罐压为0.01-0.03MPa；所述发酵罐B控制的培养条件为：无菌空气通风比1∶0.25-0.65(V/V)，搅拌转速为90-170r/min，温度为20-30℃，罐压为0.01-0.03MPa；
(3)发酵液预处理
将发酵液升温至65-80℃，维持10-20min，然后趁热以离心机离心，得预处理发酵液备用；
(4)产品提取与制成
以氢氧化钠溶液调节预处理发酵液pH为5.8-7.5，在50-90r/min充分搅拌下加入1.6-2.6倍预处理发酵液体积的乙醇，得沉淀；将沉淀用离心机离心，将所得固形物以乙醇充分洗涤；将含醇固形物用真空干燥器干燥至水分小于5％，用粉碎机粉碎。
2.如权利要求1所述的一种高浓度发酵制备生物絮凝剂的方法，其特征是，所述步骤(4)控制真空干燥器的真空度为-0.07Mpa，温度为35-45℃。
3.如权利要求1所述的一种高浓度发酵制备生物絮凝剂的方法，其特征是，所述步骤(4)氢氧化钠溶液的重量百分比为8-12％，所述乙醇浓度为90％-95％(V/V)。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的一种高浓度发酵制备生物絮凝剂的方法，其特征是，所述步骤(3)离心机转速为6000-8000转/分。
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