CN112375693A - 一种利用天然生物絮凝剂对春雷霉素发酵菌丝进行预处理后制备微生物菌剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用天然生物絮凝剂对春雷霉素发酵菌丝进行预处理后制备微生物菌剂的方法，通过“预处理絮凝反应+生物絮凝反应+理化脱水处理+固体混合发酵处理”四个理化或生化反应过程，制备得到的微生物菌剂中，含有大量益生菌群，同时可以完全降解其中的抗生素残留。该发明解决了春雷霉素生产过程中发酵菌丝的下游处理难度，提高了发酵菌丝作为生产固废的经济价值，同时利用天然的生物活性污泥为生化反应核心预处理方法，和固体混合发酵工艺生产的微生物菌剂，该方法处理过程环保高效，制备的微生物菌剂在有机肥料和饲料等多个方向的应用前途，具有很大的经济价值和社会价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用天然生物絮凝剂对春雷霉素发酵菌丝进行预处理后制备微生物菌剂的方法，核心工艺为利用环保处理过程中的活性污泥的天然微生物絮凝作用对发酵菌丝进行预处理，降低春雷霉素发酵菌丝中含水率后，进行固态混合发酵，制备微生物菌剂的方法。
背景技术
工业生产过程产生的危废和固废一直是一个制约工业发展的重大难题，尤其是在处理技术方面，缺乏创新性的理论和能够转化的技术成果。对于各种固废的再循环利用，国家政策已经开始转变，国家和地方工业相关部门对绿色发展专项支持力度也在加大。目前，国内抗生素菌渣（折干）在200万吨/年以上，二次利用效率低，导致资源浪费和二次环境污染。因此，对于生产企业开发有效可行的发酵菌丝再利用技术，不但能够解决企业的可持续发展，同时也能够大大缓解企业和社会的环保压力。
春雷霉素是一种氨基糖苷类抗生素，是一种高效低毒的生物农药，也是一种绿色农药。春雷霉素发酵菌丝主要特性是含水量大90%以上，物料絮凝效果差，难以形成滤饼，因此在后续的利用过程，耗能大，处理工艺复杂，成本高，企业难以承担处理费用。
近年来工业絮凝剂在污水处理和医药生产领域的应用越来越广泛，絮凝过程的研究已成为一门独立的新学科—絮凝科学。在污水处理过程中，絮凝法处理已成为最常用的重要方法，目前所用的絮凝剂主要为无机絮凝剂和合成絮凝剂。在絮凝处理过程，絮凝剂的种类、性质和品质好坏是关系到絮凝处理效果的关键因素，是絮凝污染控制技术的关键部分和核心基础。
目前，絮凝剂的研究和开发应用向着高效低耗、安全无害、无二次污染的方向发展，新兴的第三代絮凝剂—生物絮凝剂具有絮凝效果好、效果稳定、可生物降解、无二次污染、安全无害等特性，实现无污染排放。生物絮凝剂是通过细菌、真菌等微生物培养方法产生的，从20世纪70年代初，国外就对生物絮凝进行了研究，并在市场上由多种产品用于废水处理方面。随着生物技术的发展，生物絮凝剂的研究和开发应用已经成为当前世界絮凝剂领域的前沿和热点，生物絮凝剂的廉价和大量生产和应用必将成为一种趋势。
国内外研究中的絮凝微生物种群主要通过三方面，天然土壤、活性污泥、购买纯种微生物菌株，相比较而言，利用活性污泥采集和分离絮凝微生物成本低，效率高，而且活性污泥中本身具有的良好絮凝沉降能力，对大肠杆菌、酵母以及工业废水处理有机好的絮凝和脱色效果，对菌悬液的絮凝速度快、用量少、效果好，对胶体和溶液均有良好的絮凝效果在水处理和过程中直接应用，无需复杂的分离和培养工艺。1985年，Norio Shimizu从具有高BOD负荷的活性污泥中分理处9株能形成絮凝剂的细菌，其中5号菌株鉴定为Agrobacterium菌。迄今为止，人们发现17各种类微生物具有絮凝性，活性污泥中存在细菌、真菌、霉菌、放线菌等各类生物絮凝菌株。
微生物菌剂是一种低炭、纯天然、无害、无污染的生物原料，属于变废为宝的绿色产业，提高菌渣的附加值，利用科技创新的前沿技术增加生产企业的生产效益，进一步增强医药企业可持续发展。国内农产品售价偏低，农业原料生产和供应不足，微生物菌剂在有机肥料、饲料等农业方向具有广阔的应用前途。
固态混合发酵法在温度、pH以及生物产酶种类和酶量上具有明显优势，多种微生物形成共生群落，生长过程存在协同促进作用，同时在两阶段固态发酵过程，温度和pH的变化在不同阶段，形成不同的优势菌落，能够加快对原料的酶解的作用，形成梯度生长趋势，达到自然发酵的最优状态。另外，多种微生物在在协同作用的同时，产生一定量的抑制素，可以降低有害微生物的入侵和繁殖，有利于工业化扩大培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用天然生物絮凝剂对春雷霉素发酵菌丝进行预处理后制备微生物菌剂的方法，包括添加适量的碳酸钙或熟石灰对春雷霉素发酵菌丝进行理化参数调节后初步絮凝，利用活性污泥和菌丝进行生物絮凝反应，加入少量絮凝剂对发酵物进行絮凝量调整，利用板框对絮凝物料进行压滤，能够达到对春雷霉素发酵菌丝的有效脱水，最后加入酵母菌和枯草芽孢杆菌进行混合固体发酵。该方法利用天然生物絮凝体—活性污泥对春雷霉素发酵菌丝进行关键的絮凝处理，然后利用固态混合发酵发制备微生物菌剂，生产的微生物菌剂在有机肥料和饲料等多个方向的应用前途，具有很大的经济和社会价值。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案，所述的方法包括如下步骤：
1）添加碱性无机钙对春雷霉素发酵菌丝进行理化参数调节后进行初步絮凝；
2）利用环保车间的生物膜池活性污泥和菌丝进行生物絮凝反应；
3）加入少量絮凝剂对发酵物进行絮凝量调整，利用板框对絮凝物料进行脱水处理，形成固体滤饼；
4）制备酵母菌和芽孢杆菌纯培养物，加入固体滤饼搅拌均匀，进行固态发酵发酵。
在本发明的优选的实施方式中，步骤1）中，所用的春雷霉素发酵菌丝的质量浓度为10%±2%，所述的碱性无机钙为轻质碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙、石灰乳中的一种或几种。
在本发明的优选的实施方式中，步骤1）中，添加碱性无机钙调节发酵菌丝的pH为4.0~4.5，搅拌均匀后，絮凝0.5h~2.0h。
在本发明的优选的实施方式中，步骤2）中，生物絮凝反应系统中加入正在运行的生物膜池活性污泥，污泥浓度在6000mg/L~7000 mg/L之间，污泥沉降比在45%~95%之间，污泥镜检中以丝状菌为主，絮凝状态良好，加入量按菌丝体积计算的5%~15%。
在本发明的优选的实施方式中，步骤2）中，生物絮凝反应过程温度在15℃~35℃范围内，使用循环泵进行回流搅拌，每小时回流达到0.5~1倍体积，反应8h~24h，中间监测物料离心上清比例变化，上清比例35%以上，到达反应终点。
在本发明的优选的实施方式中，步骤3）中，物料中加入絮凝剂为聚合氯化铝，加入量0.1kg/m³左右，调节发酵物进行絮凝量，离心测定上清液比例在45%以上。
在本发明的优选的实施方式中，步骤3）中，利用板框对絮凝物料进行脱水处理，形成的滤饼含水率在55%~60%，表观参数为捏在手中成型，有少量水滴或无水滴。
在本发明的优选的实施方式中，步骤4）中，纯培养物为来源于动物肠道的芽孢杆菌和食用酵母菌。
在本发明的优选的实施方式中，步骤4）中，芽孢杆菌和酵母菌纯培养物按质量比0.5%~2.0%的接种，进行液体扩大培养。
在本发明的优选的实施方式中，步骤4）中，芽孢杆菌和酵母菌分别进行扩大培养后，按质量比0.5%~2.0%接种，同时接种，进行固体发酵。
在本发明的优选的实施方式中，步骤4）中，芽孢杆菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃厌氧培养12h~24h；在平板下挑取一环菌体，接种至50ml的LB培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12~18h；液体种子采用5%~10%的接种量，接种1000ml的种子培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h，检测其菌液浓度，OD600＞12，种子备用。
在本发明的优选的实施方式中，步骤4）中，酵母菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃培养12h；在平板下挑取一环，接种至50ml的无抗性PDA培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，转速180rpm，培养10h~12h；液体种子采用5%~10%的接种量，接种至1000ml种子培养基，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养10h~12h，检测其菌液浓度，OD600＞14，种子备用。
在本发明的优选的实施方式中，步骤4）中，固体发酵的条件为：培养基湿度为45%~55%，温度为25℃~45℃，中间每隔12h测定温度变化，生长环境pH为4.5~8.5，进行培养。
与现有技术相比，本发明通过“预处理絮凝反应+生物絮凝反应+理化脱水处理+固体混合发酵处理”四个理化或生化反应过程，制备得到的微生物菌剂中，含有大量益生菌群，同时可以完全降解其中的抗生素残留。本发明解决了春雷霉素生产过程中发酵菌丝的下游处理难度大的技术问题，提高了发酵菌丝作为生产固废的经济价值，同时利用天然的生物活性污泥为生化反应核心预处理方法，和固体混合发酵工艺生产的微生物菌剂，该方法处理过程环保高效，制备的微生物菌剂在有机肥料和饲料等多个方向的应用前途，具有很大的经济价值和社会价值。更为具体的，本发明的技术方案的有益效果在于：
1）利用活性污泥中的生物絮凝体，采用活性污泥直接接种的方法，絮凝微生物来源简单，可以高效形成生物絮凝环境，对春雷霉素发酵菌丝进行有效的絮凝处理，能够保证板框滤饼形成，最高脱水率达60%。
2）利用环保活性污泥的絮凝作用和发酵菌丝的营养作用，形成综合固废处理和利用单元，大大减少了生产工艺的复杂性，提高了生产过程絮凝反应的实用性和可操作性，工艺极其简单。
3）生产过程采用物理聚凝絮凝、生物絮凝、化学絮凝连续絮凝处理的方法，以生物絮凝为核心，最后形成固含量达50%~55%的的菌丝滤饼，该方法实现对发酵菌丝的环保化、清洁化处理，不但降低了处理工艺复杂性，同时也减少了人员、能耗和设备的的投入。
4）本发明利用芽孢杆菌和酵母菌两种益生菌组合进行固态混合发酵，具有协同生长效应的组合方案，在不同时间段发挥两种菌株的代谢协同作用，制备的微生物菌剂中每克活性物料中有效活菌总数超过10亿个，产品粗蛋白占总干物比例达到65%~75%，具有多个方向的应用前途，提高了春雷霉素发酵菌丝作为生产固废的经济价值和社会价值。
具体实施方式
本发明实质性特点可以从以下实例中体现，但这些实例仅作为说明，而不限制该发明的实施方式。
实施例1
1）春雷霉素发酵菌丝的浓度控制在10%±2%，添加碱性无机钙为轻质碳酸钙，调节发酵菌丝的pH为4.0，搅拌均匀后，絮凝反应2h。
2）环保车间的正在运行的生物膜池活性污泥，测定污泥浓度在6000mg/L~7000mg/L之间，污泥沉降比在45%~95%之间，污泥镜检中以丝状菌为主，絮凝状态良好的活性污泥，在污泥浓缩池进行2h~3h的沉淀后，按质量比的5%泵入絮凝反应体系中。生物絮凝温度30℃~35℃，使用循环泵进行回流搅拌，每小时回流达到1倍体积，反应24h，中间监测物料离心上清比例变化，上清比例35%以上，终止反应进入下步。
3）生物絮凝池中加入聚合氯化铝0.1kg/m³左右，调节发酵物进行絮凝量，离心测定上清液比例在45%以上。絮凝好的物料，利用板框进行脱水处理，形成的滤饼含水率在55%~60%，表观参数为捏在手中成型，有少量水滴或无水滴。
4）芽孢杆菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃厌氧培养12h~24h。在平板下挑取一环菌体，接种至50ml的LB培养基中，在培养箱中37±0.5℃，180rpm，培养12h~18h。液体种子采用5%~10%的接种量，接种1000ml的种子培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h，检测其菌液浓度，OD600＞12，种子备用。
5）酵母菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃培养12h。在平板下挑取一环，接种至50ml的无抗性PDA培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，转速180rpm，培养10h~12h。液体种子采用5%~10%的接种量，接种至1000ml种子培养基，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养10h~12h，检测其菌液浓度，OD600＞14，种子备用。
6）实验室制备酵母菌和芽孢杆菌纯培养物，分别按2%的接种比例，同时接种加入到固体滤饼，利用混合机搅拌均匀后，装袋后室温自然，袋内温度25℃~45℃，进行固态发酵发酵，发酵时间在6天~7天。
实施例2
1）春雷霉素发酵菌丝的浓度控制在10%±2%，添加碱性无机钙为氧化钙，调节发酵菌丝的pH为4.0，搅拌均匀后，絮凝0.5h。
2）环保车间的正在运行的生物膜池活性污泥，控制污泥浓度在6000mg/L~7000mg/L之间，污泥沉降比在45%~95%之间，污泥镜检中以丝状菌为主，絮凝状态良好，在污泥浓缩池进行2h~3h的沉淀后，按质量比10%泵入絮凝反应体系中。生物絮凝温度30℃~35℃，使用循环泵进行回流搅拌，每小时回流达到0.5倍体积，反应16h~18h，中间监测物料离心上清比例变化，上清比例35%以上，即刻终止反应进入下步。
3）生物絮凝池中加入聚合氯化铝0.1kg/m³左右，调节发酵物进行絮凝量，离心测定上清液比例在45%以上。絮凝好的物料，利用板框进行脱水处理，形成的滤饼含水率在55%~60%，表观参数为捏在手中成型，有少量水滴或无水滴。
4）芽孢杆菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃厌氧培养12h~24h。在平板下挑取一环菌体，接种至50ml的LB培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h。液体种子采用5%~10%的接种量，接种1000ml的种子培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h，检测其菌液浓度，OD600＞12，种子备用。
5）酵母菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃培养12h。在平板下挑取一环，接种至50ml的无抗性PDA培养基中，在培养箱中37±0.5℃，转速180rpm，培养10h~12h。液体种子采用5%~10%的接种量，接种至1000ml种子培养基，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养10h~12h，检测其菌液浓度，OD600＞14，种子备用。
6）实验室制备酵母菌和芽孢杆菌纯培养物，分别按2%的接种比例，同时接种加入到固体滤饼，利用混合机搅拌均匀后，装袋后室温自然，袋内温度25℃~45℃，进行固态发酵发酵，发酵时间在6天~7天。
实施例3
1）春雷霉素发酵菌丝的浓度控制在10%±2%，添加碱性无机钙为氢氧化钙，或石灰乳，调节发酵菌丝的pH为4.2，搅拌均匀后，絮凝0.5~1h。
2）环保车间的正在运行的生物膜池活性污泥，控制污泥浓度在6000mg/L~7000mg/L之间，污泥沉降比在45%~95%之间，污泥镜检中以丝状菌为主，絮凝状态良好，在污泥浓缩池进行2h~3h的沉淀后，按质量比15%泵入絮凝反应体系中。生物絮凝反应过程温度自然15℃~35℃，使用循环泵进行回流搅拌，每小时回流达到0.5~1倍体积，反应8h~12h，中间监测物料离心上清比例变化，上清比例35%以上，即刻终止反应进入下步。
3）生物絮凝池中加入聚合氯化铝0.1kg/m³左右，调节发酵物进行絮凝量，离心测定上清液比例在45%以上。絮凝好的物料，利用板框进行脱水处理，形成的滤饼含水率在55%~60%，表观参数为捏在手中成型，有少量水滴或无水滴。
4）芽孢杆菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃厌氧培养12h~24h。在平板下挑取一环菌体，接种至50ml的LB培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h。液体种子采用5%~10%的接种量，接种1000ml的种子培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h，检测其菌液浓度，OD600＞12，种子备用。
5）酵母菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃培养12h。在平板下挑取一环，接种至50ml的无抗性PDA培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，转速180rpm，培养10h~12h。液体种子采用5%~10%的接种量，接种至1000ml种子培养基，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养10h~12h，检测其菌液浓度，OD600＞14，种子备用。
6）实验室制备酵母菌和芽孢杆菌纯培养物，分别按0.5%的接种比例，同时接种加入到固体滤饼，利用混合机搅拌均匀后，装袋后室温自然，袋内温度25~45℃，进行固态发酵发酵，发酵时间在9~12天。
实施例4
1）春雷霉素发酵菌丝的浓度控制在10%±2%，添加碱性无机钙为轻质碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙，或石灰乳，调节发酵菌丝的pH为4.0~4.5，搅拌均匀后，絮凝0.5h~2h。
2）环保车间的正在运行的生物膜池活性污泥，控制污泥浓度在6000mg/L~7000mg/L之间，污泥沉降比在45%~95%之间，污泥镜检中以丝状菌为主，絮凝状态良好。在污泥浓缩池进行2h~3h的沉淀后，按质量比15%泵入絮凝反应体系中。生物絮凝反应过程温度自然15℃~35℃，使用循环泵进行回流搅拌，每小时回流达到0.5~1倍体积，反应8h~24h，中间监测物料离心上清比例变化，反应终点上清比例35%以上，即刻终止反应进入下步。
3）生物絮凝池中加入聚合氯化铝0.1kg/m³左右，调节发酵物进行絮凝量，离心测定上清液比例在45%以上。絮凝好的物料，利用板框进行脱水处理，形成的滤饼含水率在55%~60%，表观参数为捏在手中成型，有少量水滴或无水滴。
4）芽孢杆菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃厌氧培养12h~24h。在平板下挑取一环菌体，接种至50ml的LB培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h。液体种子采用5%~10%的接种量，接种1000ml的种子培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h，检测其菌液浓度，OD600＞12，种子备用。
5）酵母菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃培养12h。在平板下挑取一环，接种至50ml的无抗性PDA培养基中，在培养箱中37℃±0.5℃，转速180rpm，培养10h~12h。液体种子采用5%~10%的接种量，接种至1000ml种子培养基，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养10h~12h，检测其菌液浓度，OD600＞14，种子备用。
6）实验室制备酵母菌和芽孢杆菌纯培养物，分别按0.5%的接种比例进行扩培，扩培量最大可以达到生产接种量提高到10%左右，然后同时接种加入到固体滤饼，利用混合机搅拌均匀后，装袋后室温自然，袋内温度25℃~45℃，进行固态发酵发酵，发酵时间在2天~3天。
实施例1-4所制备的微生物菌剂样品检测相关指标表1所示。
表1 实施例1-4所制备的微生物菌剂样品检测相关指标
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，对这些已描述的实施方式作出的若干替代或变型，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用天然生物絮凝剂对春雷霉素发酵菌丝进行预处理后制备微生物菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）添加碱性无机钙对春雷霉素发酵菌丝进行理化参数调节后进行初步絮凝；
2）利用环保车间的生物膜池活性污泥和菌丝进行生物絮凝反应；
3）加入少量絮凝剂对发酵物进行絮凝量调整，利用板框对絮凝物料进行脱水处理，形成固体滤饼；
4）制备酵母菌和芽孢杆菌纯培养物，加入固体滤饼搅拌均匀，进行固态发酵发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所用的春雷霉素发酵菌丝的质量浓度为10%±2%，所述的碱性无机钙为轻质碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙、石灰乳中的一种或几种，调节发酵菌丝的pH为4.0~4.5，搅拌均匀后，絮凝0.5h~2h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，生物絮凝反应系统中加入正在运行的生物膜池活性污泥，污泥浓度在6000mg/L~7000mg/L之间，污泥沉降比在45%~95%之间，污泥镜检中以丝状菌为主，絮凝状态良好，加入量按菌丝体积计算的5%~15%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，生物絮凝反应过程温度在15℃~35℃范围内，使用循环泵进行回流搅拌，每小时回流达到0.5~1倍体积，反应8h~24h，中间监测物料离心上清比例变化，上清比例35%以上，到达反应终点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，物料中加入絮凝剂为聚合氯化铝，加入量0.1kg/m³左右，调节发酵物进行絮凝量，离心测定上清液比例在45%以上；利用板框对絮凝物料进行脱水处理，形成的滤饼含水率在55%~60%，表观参数为捏在手中成型，有少量水滴或无水滴。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中，纯培养物为来源于动物肠道的芽孢杆菌和食用酵母菌。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中，芽孢杆菌和酵母菌纯培养物，按质量比0.5%~2.0%的接种，分别进行液体扩大培养；固体发酵的条件为：温度为25℃~45℃，湿度为45%~55%，中间每隔12h测定温度变化，生长环境pH在4.5~8.5，进行培养。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中，芽孢杆菌和酵母菌分别进行扩大培养后，按质量比0.5%~2.0%的接种比例，同时接种，进行固体发酵。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中，芽孢杆菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃厌氧培养12h~24h；在平板下挑取一环菌体，接种至50ml的LB培养液中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h；液体种子采用5%~10%的接种量，接种至1000ml的种子培养液中，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养12h~18h，检测其菌液浓度，OD600＞12，种子备用。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中，酵母菌纯培养物的制备方法：取出菌种保藏斜面或保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏和扩培，37℃±0.5℃培养12h；在平板下挑取一环，接种至50ml的无抗性PDA培养液中，在培养箱中37℃±0.5℃，转速180rpm，培养10h~12h；液体种子采用5%~10%的接种量，接种至1000ml种子培养液，在培养箱中37℃±0.5℃，180rpm，培养10h~12h，检测其菌液浓度，OD600＞14，种子备用。
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