CN101906439A - 一种生物絮凝剂的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

一种生物絮凝剂的制备方法及其用途，所述的制备方法包括步骤：(a)将绳状青霉(Penicillium funiculosum)经发酵培养得到发酵液，离心除去菌丝体，得到上清液；和(b)将上清液和乙醇混合、离心，得到生物絮凝剂。所述的生物絮凝剂可用于处理活性污泥、粉煤灰、木炭、墨水、泥水、河底沉积物悬浊液、高岭土悬浊液、粪尿水、印染废水、和/或果汁。

Description

一种生物絮凝剂的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及絮凝剂，尤其涉及一种生物絮凝剂的制备方法和用途。

背景技术

目前在水处理领域中广泛使用的絮凝剂主要是以聚合氯化铝(PAC)为代表的无机絮凝剂和以聚丙烯酰胺(PAM)为代表的高分子絮凝剂。这两类絮凝剂在使用过程中都往往会引起环境污染问题，如饮用水中Al³⁺的增多是引起临床上铝中毒症状，像铝性脑病(如老年痴呆症等)、铝性骨病和铝性贫血等的主要原因；聚丙烯酰胺的单体具有强烈的神经毒性，还有很强的致癌性。因此，开发高效、安全、无毒、无二次污染的絮凝剂迫在眉睫。

微生物絮凝剂是一种由微生物产生的有絮凝活性的高分子代谢产物，其主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白质、纤维素和DNA等，具有絮凝活性高、生物降解性强、安全无毒、无二次污染等特点，成为国内外新型水处理剂研究和开发的热点。目前已经报道细菌、放线菌、霉菌和酵母等微生物具有合成生物絮凝剂的能力，但是其发酵生产普遍存在原料成本高、发酵周期长、絮凝活性低等不足，而且很多生物絮凝剂还需和无机絮凝剂联合使用才能发挥较好的效果，这些不足使得国内外很少有相关产品上市。

因此，本领域迫切需要克服现有生物絮凝剂开发中存在的生产成本高、絮凝活性低以及某些生物絮凝剂还需要与无机絮凝剂配合使用才能发挥较好效果等不足，提供一种新的生物絮凝剂及其优异的制备工艺。

发明内容

本发明旨在提供一种生物絮凝剂的制备方法。

本发明的第二个目的是提供由上述方法制备得到的生物絮凝剂。

本发明的第三个目的是提供一种绳状青霉(Penicillium funiculosum)菌株的用途。

本发明的第四个目的是提供由上述方法制备得到的生物絮凝剂的用途。

本发明的第五个目的是提供由上述方法制备得到的生物絮凝剂的使用方法。

在本发明的第一方面，提供了一种生物絮凝剂的制备方法，所述的方法包括步骤：

(a)将绳状青霉(Penicillium funiculosum)经发酵培养得到发酵液，离心除去菌丝体，得到上清液；和

(b)将上清液和乙醇混合、离心，得到生物絮凝剂。

在另一优选例中，所述发酵培养的培养基含葡萄糖1％-2％，NaNO₃0.01％-0.05％，K₂HPO₄0.1％-0.25％，KH₂PO₄0.05％-0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.01％-0.02％，NaCl 0.005％-0.01％，pH6.0-8.0；更佳地，pH6.5-7.5。

在另一优选例中，所述发酵培养的接种量以发酵培养基总重量计为0.5-2％；更佳地，0.8-1.5％。

在另一优选例中，所述发酵培养的培养温度为20-35℃，培养时间为40-80小时；更佳地，培养温度为25-30℃，培养时间为50-70小时。

在本发明的第二方面，提供了一种生物絮凝剂，所述的生物絮凝剂通过如上所述的本发明提供的制备方法得到。

在另一优选例中，所述的生物絮凝剂的红外光谱图显示在3431.7±50cm^-1和1739.9±50cm^-1处能见率为78.5-80.2％。

在另一优选例中，所述的生物絮凝剂的紫外光谱图显示在260±5nm和280±5nm处的吸光度＜0.05。

在另一优选例中，以所述生物絮凝剂的总重量计，多糖含量为80-95％；更佳地，为85-90％。

在另一优选例中，所述生物絮凝剂的相对分子质量为9×10⁴-3×10⁵Da；更佳地，为1×10⁵-2.5×10⁵Da。

在本发明的第三方面，提供了一种菌株绳状青霉(Penicillium funiculosum)在制备生物絮凝剂中的应用。

在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的本发明提供的生物絮凝剂的用途，所述的生物絮凝剂用于处理活性污泥、粉煤灰、木炭、墨水、泥水、河底沉积物悬浊液、高岭土悬浊液、细菌发酵液、粪尿水、印染废水、和/或果汁。

在另一优选例中，所述的生物絮凝剂用于处理高岭土悬浊液、细菌发酵液、和/或活性污泥。

在本发明的第五方面，提供了一种如上所述的本发明提供的生物絮凝剂的使用方法，所述的方法包括步骤：将所述生物絮凝剂和待处理的液体混合、离心，得到澄清液体；以混合后的液体的总体积计，所述生物絮凝剂为0.5‰-2％(v/v)；所述的待处理的液体选自活性污泥、粉煤灰、木炭、墨水、泥水、河底沉积物悬浊液、高岭土悬浊液、细菌发酵液、粪尿水、印染废水、和/或果汁。

在另一优选例中，所述生物絮凝剂为1‰-1.5％(v/v)；更佳地，为4‰-1％(v/v)。

在另一优选例中，所述的待处理的液体选自高岭土悬浊液、细菌发酵液、或活性污泥。

据此，本发明克服了现有生物絮凝剂开发中存在的生产成本高、絮凝活性低以及某些生物絮凝剂还需要与无机絮凝剂配合使用才能发挥较好效果等不足，提供了一种新的生物絮凝剂及其优异的制备工艺。

附图说明

图1显示了本发明实施例1提供的生物絮凝剂SIPI-PF的紫外吸收光谱图。

图2显示了本发明实施例1提供的生物絮凝剂SIPI-PF的红外光谱图。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，意外地发现一种菌株绳状青霉(Penicillium funiculosum)经过发酵培养得到的代谢产物具有良好的絮凝活性。

定义

菌株绳状青霉(Penicillium funiculosum)，菌落呈圆形，边缘整齐，气生菌丝呈绳索状，并向外蔓延；菌落表面呈暗灰绿色，中间有突起，并有渗出液，背面橙褐色；分生孢子梗光滑，帚状枝分枝不多，是典型的双轮对称，小梗披针形；分生孢子椭圆形，光滑。该菌株可以通过本领域熟知的方式获得，例如可从中国普通微生物菌种保藏中心购买该菌株，保藏号码是CGMCC 3.5199。

如本文所用，“絮凝剂”是指一种能达到下述目的的试剂，即带有正电(负)性的基团中和一些水中带有负(正)电性难于分离的一些粒子或者叫颗粒，降低其电势，使其处于不稳定状态，并利用其聚合性质使得这些颗粒集中后通过物理或者化学方法分离出来。

如本文所用，“生物絮凝剂”和“微生物絮凝剂”可以互换使用，都是指利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂，利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂、直接利用微生物细胞的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂。优选由微生物产生的有絮凝活性的高分子代谢产物。

生物絮凝剂的制备方法

本发明提供一种生物絮凝剂的制备方法，是将菌株绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)在发酵培养基中培养后，得到发酵液；发酵液离心除去菌丝体，得到上清液；上清液和乙醇混合后，静置、离心，取沉淀，便得生物絮凝剂。

所述的发酵培养基是液体培养基，pH中性，较佳地为pH6.0-8.0；更佳地为pH6.5-7.5。其中含有适合绳状青霉生长、代谢所必需的营养物质，例如但不限于葡萄糖，硝酸钠，磷酸盐等。

所述的发酵条件是在摇瓶培养状态下的培养条件，pH中性，较佳地为pH6.0-8.0；接种量为1％，较佳地为0.5％-2％；培养温度为25℃-30℃，较佳地为28℃；摇床转速为120-180rpm，较佳地为150rpm；发酵培养时间为50h-70h，较佳地为60h。该发酵条件下绳状青霉的生长状态较好，所产絮凝剂的量较多，絮凝效果也较好。

生物絮凝剂

通过本发明提供的制备方法得到的生物絮凝剂中所含有的核酸和/或蛋白质的量，以生物絮凝剂的总重量计，≤0.05％，较佳地≤0.01％，更佳地为0。以生物絮凝剂的总重量计，其中多糖的含量为80-95％，较佳地为85-90％。

本发明的生物絮凝剂可以为固体，也可以是液体(通过将发酵液离心直接制得)；优选固体，更佳地为冻干粉。

生物絮凝剂的用途

本发明的生物絮凝剂具有广泛的应用，例如但不限于，处理畜牧场废水；改善污泥的沉降性能；去除废水中的悬浮颗粒；处理含有高悬浮物的建筑材料加工废水；处理瓦厂废水；对墨水、糖蜜废水、造纸黑液、颜料废水等进行处理，上清液呈无色透明；乳化液的油水分离；鞣革工业废水的处理；取代发酵工业和食品工业传统工艺中的离心和过滤分离细胞、回收发酵废液中有用的产品等；城市污水的处理。

优选处理的对象有：活性污泥、粉煤灰、木炭、墨水、泥水、河底沉积物、高岭土、粪尿水、印染废水、果汁等。

本发明的生物絮凝剂在使用过程中，将所述生物絮凝剂和待处理的液体混合、离心，得到澄清液体；以混合后的液体的总体积计，所述生物絮凝剂为0.5‰-2％(v/v)，较佳地为1‰-1.5％(v/v)，更佳地为4‰-1％(v/v)。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供的制备生物絮凝剂生产工艺简单、发酵周期短。

2、本发明提供的生物絮凝剂具有高絮凝活性、使用无二次污染、适应大规模生产和工业应用。

3、本发明提供的生物絮凝剂具有生物分解性和安全性、高效、无毒。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

制备生物絮凝剂(SIPI-PF)

1、菌种

绳状青霉(Penicilllium funiculosum)，可从中国普通微生物菌种保藏中心购买，菌种保藏号码是CGMCC 3.5199

2、发酵工艺

种子培养基(gL^-1)(购自国药集团化学试剂有限公司)：蔗糖30，NaNO₃2，KCl 0.5，K₂HPO₄1，MgSO₄.7H₂O0.5，FeSO₄0.01，pH7.2。

液体发酵培养基(gL^-1)(购自国药集团化学试剂有限公司)：葡萄糖10，NaNO₃0.5，K₂HPO₄2.5，KH₂PO₄1，MgSO₄.7H₂O 0.2，NaCl 0.1，pH 7.0，

以上培养基均在121℃，0.1MPa灭菌30min。

发酵条件为：初始pH7.0，接种量为1％，28℃，150rpm，振荡培养60h。

3、生物絮凝剂的提取

将发酵液在8000rpm转速下离心10min，除去菌丝体，得到上清液。往上清液中加入2倍体积的预冷乙醇，搅拌后4℃冰箱静置过夜，离心取沉淀，将沉淀复溶于少量水搅拌，再用2倍体积的乙醇沉淀，离心并将沉淀用乙醇洗涤两次，最后将沉淀冷冻干燥，可以得到絮凝剂SIPI-PF的粗品。

4、生物絮凝剂的组分鉴定

将冷冻干燥得到的絮凝剂取少量配成5g/L的溶液，将其进行紫外扫描，并做糖的鉴定实验，同时用KBr压片法对絮凝剂干粉进行红外扫描，结果见图1和2，以及表1：

表1生物絮凝剂SIPI-PF的成分鉴定实验

从紫外吸收光谱可以看出，SIPI-PF在260nm和280nm处均未发现吸收峰，而260nm和280nm分别是核酸和蛋白质的特征吸收峰，因此，可以推断SIPI-PF中不含有核酸和蛋白成分。

SIPI-PF的红外光谱图是一个典型的多糖红外光谱图，特别是在3431.7cm-1和1739.9cm-1处具有较强的吸收，表明该多糖絮凝剂具有较多的羟基和羧基基团。

从紫外扫描、红外扫描以及显色反应来看，絮凝剂SIPI-PF的主要成分是多糖，不含核酸与蛋白质类物质，进一步用苯酚硫酸法测得其多糖含量为87％左右。

(1)菌种筛选方法：

筛选培养基(gL^-1)：

①牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10，牛肉膏3.0，NaCl 5.0，琼脂15-20，pH7.0-7.2，

②查氏培养基：蔗糖30，，NaNO₃2，KCl 0.5，K₂HPO₄1，MgSO₄.7H₂O 0.5，FeSO₄0.01，

发酵培养基(gL^-1)：葡萄糖20，酵母膏0.5，K₂HPO₄5，KH₂PO₄2，(NH₄)₂SO₄0.2，尿素0.5，MgSO₄.7H₂O 0.2，NaCl 0.1，pH7.0，

以上培养基均在121℃，0.1MPa灭菌30min。

培养条件：将菌株接种于液体发酵培养基，150rpm，30℃振荡培养3天，检测发酵液的絮凝活性。

初筛方法：取0.1ml发酵液加至装有9ml高岭土悬浊液和0.4ml2％CaCl₂的10ml试管中，加去离子水定容至刻度，上下混匀后，静置片刻，目测高岭土溶液的絮凝状况，将其中絮凝活性高的菌株作为复筛菌株。

复筛方法：将初筛得到的高絮凝活性菌株的发酵液取1ml加至装有90ml高岭土溶液和1ml 2％CaCl₂的100ml量筒中，加去离子水定容至刻度，振荡后静置5min，取上清于SP-756PC型分光光度计550nm处测吸光度，对照用水代替发酵液。

(2)筛选结果

从土壤和活性污泥中分离得到的500多株细菌与30多株真菌中，筛选得到十余株细菌和3株真菌的发酵液具有较好的絮凝活性，其中一株编号为F9的真菌的絮凝活性最高，达到95％以上，因此将其作为目标菌。

(3)目标菌种特征

菌落呈圆形，边缘整齐，气生菌丝呈绳索状，并向外蔓延；菌落表面呈暗灰绿色，中间有突起，并有渗出液，背面橙褐色；分生孢子梗光滑，帚状枝分枝不多，是典型的双轮对称，小梗披针形；分生孢子椭圆形，光滑。

根据菌株的形态学特征以及18SrDNA序列分析，确定该菌株为绳状青霉(Penicillium funiculosum)

实施例2

生物絮凝剂的应用

将培养得到的发酵液离心除去菌丝体，保留上清作为絮凝剂SIPI-PF。在100ml量筒中加入90ml待絮凝溶液(如高岭土悬浊液、细菌发酵液、活性污泥等)，5mLw(CaCl₂)＝1％的水溶液，按照不同的投加量(％，v/v)加入SIPI-PF液体，加蒸馏水至100mL，调节pH至8.0，倒入150mL烧杯中，混合，搅拌3min，静置5min，吸取上清液于SP-756PC型分光光度计550nm处测定吸光度(A)，以不加絮凝剂的吸光度(A₀)为对照来确定絮凝剂的絮凝活性，以絮凝率表示：

结果见表2-4。

表2SIPI-PF对高岭土悬浊液的絮凝效果

A₅₅₀：高岭土悬浊液在550nm处的吸光度值

表3SIPI-PF对细菌发酵液的絮凝效果

A₅₅₀：细菌发酵液在550nm处的吸光度

表4SIPI-PF对活性污泥的絮凝效果

A₅₅₀：活性污泥在550nm处的吸光度

结果表明，本发明提供的生物絮凝剂在加量为1‰-1％(v/v)的范围内，对高岭土悬浊液、细菌发酵液以及活性污泥均具有良好的絮凝效果，特别是在处理高岭土悬浊液中，絮凝效果可以达到99％以上。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (15)

1.一种生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)将绳状青霉(Penicillium funiculosum)经发酵培养得到发酵液，离心除去菌丝体，得到上清液；和

(b)将上清液和乙醇混合、离心，得到生物絮凝剂。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基含葡萄糖1％-2％，NaNO₃0.01％-0.05％，K₂HPO₄0.1％-0.25％，KH₂PO₄0.05％-0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.01％-0.02％，NaCl 0.005％-0.01％，pH6.0-8.0；优选pH6.5-7.5。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的接种量以发酵培养基总重量计为0.5-2％；优选0.8-1.5％。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的培养温度为20-35℃，培养时间为40-80小时；优选培养温度为25-30℃，培养时间为50-70小时。

5.一种生物絮凝剂，其特征在于，所述的生物絮凝剂通过如权利要求1-4任一所述的制备方法得到。

6.如权利要求5所述的生物絮凝剂，其特征在于，所述的生物絮凝剂的红外光谱图显示在3431.7±50cm^-1和1739.9±50cm^-1处能见率为78.5-80.2％。

7.如权利要求5所述的生物絮凝剂，其特征在于，所述的生物絮凝剂的紫外光谱图显示在260±5nm和280±5nm处的吸光度＜0.05。

8.如权利要求5所述的生物絮凝剂，其特征在于，以所述生物絮凝剂的总重量计，多糖含量为80-95％；优选85-90％。

9.如权利要求5所述的生物絮凝剂，其特征在于，所述生物絮凝剂的相对分子质量为9×10⁴-3×10⁵Da；优选1×10⁵-2.5×10⁵Da。

10.一种菌株绳状青霉(Penicillium funiculosum)在制备生物絮凝剂中的应用。

11.一种如权利要求5-9任一所述的生物絮凝剂的用途，其特征在于，所述的生物絮凝剂用于处理活性污泥、粉煤灰、木炭、墨水、泥水、河底沉积物悬浊液、高岭土悬浊液、细菌发酵液、粪尿水、印染废水、和/或果汁。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的生物絮凝剂用于处理高岭土悬浊液、细菌发酵液、和/或活性污泥。

13.一种如权利要求5-9任一所述的生物絮凝剂的使用方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：将所述生物絮凝剂和待处理的液体混合、离心，得到澄清液体；以混合后的液体的总体积计，所述生物絮凝剂为0.5‰-2％(v/v)；所述的待处理的液体选自活性污泥、粉煤灰、木炭、墨水、泥水、河底沉积物悬浊液、高岭土悬浊液、细菌发酵液、粪尿水、印染废水、和/或果汁。

14.如权利要求13所述的使用方法，其特征在于，所述生物絮凝剂为1‰-1.5％(v/v)；优选4‰-1％(v/v)。

15.如权利要求13或14所述的使用方法，其特征在于，所述的待处理的液体选自高岭土悬浊液、细菌发酵液、或活性污泥。

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