CN101503709B - 利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法 - Google Patents

Abstract

利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，涉及一种生物絮凝剂。提供一种具有较高絮凝活性、原料成本低、工业应用潜力较大的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法。微生物为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。将新鲜斜面上的菌苔转接至种子培养基培养后，转接至发酵培养基培养，得生物絮凝剂发酵液，离心除去沉淀收集上清液，加入乙醇静置后离心，除去上清液，向沉淀物中再加入无水乙醇，搅拌，离心，除去上清液，向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化铵，离心，除去上清液得沉淀物，将沉淀物溶解于NaCl溶液中，加入无水乙醇，搅拌，静置，离心除去上清液得沉淀物，将沉淀物冷冻真空干燥得到纯品生物絮凝剂。

Description

利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法

技术领域

本发明涉及一种生物絮凝剂，尤其是涉及一种利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法。

背景技术

生物絮凝剂是一类由微生物产生的可使液体中不易降解的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子等凝集、沉淀的特殊高分子代谢产物，主要含有蛋白、粘多糖、纤维素和DNA等高分子化合物。生物絮凝剂是利用生物技术，通过微生物发酵、分离提取而得到的一种新型、高效、廉价的水处理剂(陈元彩，肖锦.天然有机高分子絮凝剂研究与应用，工业水处理，1999，19(4)：11-13)。与传统的无机和有机合成高分子絮凝剂相比，生物絮凝剂具有许多独特的性质和优点：①无毒无害，安全性高；②易被微生物降解，无二次污染；③具有很强的除浊和脱色性能；④适用范围广；⑤易于固液分离，形成沉淀物少；⑥有些生物絮凝剂还具有pH和热稳定性强，用量小的特点(Takagi H，Kadowaki K.Poly-galactosamine produced by amicroorganism.Nat Technol.1985a，49(3)：121-128)。

随着工业和科学技术的发展，无机和有机高分子絮凝剂的生产和应用在取得长足进步的同时，其使用过程中的不安全性和给环境造成的二次污染也越来越引起人们的重视。如无机絮凝剂在实际应用中易给被处理液带入大量无机离子，增加了脱盐工序，过量的无机离子不仅影响产品的风味、口感，而且不利于人的健康，尤其是Al³⁺的摄入，与目前日益增多的老年痴呆症的引发有直接关系；铁盐类絮凝剂不仅对所用设备具有强腐蚀性，而且容易残留铁离子，使被处理液带有颜色，影响水质；当处理含有较多硫化物的工业废水(如纺织印染废水，石油工业废水，酸法造纸废水等)时，由于Fe³⁺会被还原为Fe²⁺，同时生成胶体状态的FeS和Fe₂S₃的混合物，很难形成絮凝沉淀。

有机合成高分子絮凝剂丙烯酰胺多聚体虽然本身没有任何毒性，但是其难降解性却易造成二次污染，而且聚合单体丙烯酰胺的残留也是一个令人十分担忧的问题，它不仅具有强烈的神经毒性，而且是强致癌物，现在许多国家和领域已禁止或限量使用此类絮凝剂，如美国批准使用的聚丙烯酰胺Separum Nplo最大容许浓度为1mg/mL；英国规定PAM的投加剂量平均不得超过0.5mg/mL，最大投加剂量不得超过1mg/mL。

天然高分子絮凝剂作为一类较新的水处理剂，是利用蛋白质、多聚糖、木质素、几丁质等生物体分泌的天然有机高分子，通过化学改性制成。由于天然有机高分子物质具有无毒，能安全降解的特点，所以曾一度引起重视，但天然絮凝剂较弱的絮凝活性却限制了其进一步的推广应用，致使多年来在此领域能真正大规模用于工业生产的种类并不多。

目前已有一些关于生物絮凝剂产生菌的报道，涉及到细菌、真菌和藻类等。1984年，FattomA.等(Ali Fattom，Moshe Shilo.Phormidium J-1 bioflocculant：production and activity.Archives ofMicrobiology，1984，139(4)：421-426)利用从排水渠内获得的丝状藻青菌Phormidium J-1研制出对斑脱土有良好絮凝效果的高分子生物絮凝剂。1986年，Kurane等(Kurane R，Toeda K，TakedaK，Suzuki T.Culture condition for production of microbial flocculant by Rhodococcus erythropolis.Agric Biol Chem，1986，50：2309-2313)研究活性污泥法处理酞酚酯废水时发现红平红球菌Rhodococcus erythropolis，用特定的培养基和培养条件研制出了微生物絮凝剂NOC-1，该产品可用于畜产废水处理、膨胀污泥的沉降、瓦厂废水及纸浆废水处理。Nakamura等(Nakamura J，Miyashiro S，Hirose Y.Purification and chemical analysis of microbial cell flocculant produced byAspergillus sojae AJ7002.Agric Biol Chem，1976，40：619-624)又用酱油曲霉Aspergillus sojae制备出了生物絮凝剂AJ7002。Takagi(Takagi H，Kadowaki K.Purification and chemical properties ofa flocculant produced by Paecilomyces.Agric Biol Chem，1985，49(11)：3159-3164)利用拟青霉菌Paecilomyces I-1研制出生物絮凝剂PF101。近年来国内研究者也发现了一些能产生絮凝剂的菌株。陆茂林等(陆茂林，施大林，王蕾，陈金林.微生物絮凝剂产生菌的筛选和发酵条件研究.工业微生物，1997，27(2)：25-28)从土壤和污泥中筛选出两株活性较高的诺卡氏菌，并对其适宜培养基、培养时间和培养液pH变化与絮凝活性之间的关系进行了研究；宫小燕等(宫小燕，王竞，周集体.絮凝剂产生菌的筛选及其培养条件优.环境科学研究，1999，12(4)：9-11)从污水处理厂活性污泥中分离筛选到1株具有稳定絮凝性状的菌株，经初步鉴定为假单胞菌Paseudomonas sp.GX4-1，对絮凝活性条件进行了初步研究；何宁等(何宁，李寅，陈坚.新型生物絮凝剂REA-11的代谢模型建立与代谢网络分析.化工学报，2005，56(4)：687-694)研究了谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum产生新型蛋白聚糖生物絮凝剂REA-11的代谢过程。2001年，Shih等(I.L.Shil，Y.T.Van，L.C.Yeh，H.G.Lin，Y.N.Chang.Production of abiopolymer flocculant from Bacillus licheniformis and its flocculation properties.BioresourceTechnology 2001，78：267-272)利用谷氨酸、柠檬酸和甘油作为发酵培养基主要组分培养Bacillus licheniformis CCRC 12826合成一种聚谷氨酸类生物絮凝剂，表现出较高的絮凝活性，可望在废水、饮用水以及食品发酵工业下游过程得到推广应用。

生物絮凝剂作为一类高效安全絮凝剂，在人们亟待寻求一种新型絮凝剂代替传统絮凝剂的今天，已得到了诸多研究者的重视和认可，它终将取代或部分取代合成絮凝剂是大势所趋。因此，开发一种安全无毒、絮凝活性高、无二次污染、成本低廉、产量高的新型絮凝剂对物质产品的生产工艺改进、人类的健康和环境保护都有很重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于针对目前微生物絮凝剂生产所存在的原料成本高、发酵周期长、絮凝效率低等问题，提供一种具有较高絮凝活性、原料成本低、工业应用潜力较大的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法。

本发明采用的微生物为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该微生物已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的筛选及鉴定采用以下方法：

从实验室染菌培养基中，分离得到一株具有高絮凝活性的菌株。经生理生化和16S rDNA鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

筛选培养基(g/L)：葡萄糖5～10，酵母膏1～3，尿素1～3，KH₂PO₄0.1～0.5，K₂HPO₄0.1～0.5，NaCl 0.1～0.5，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5，蒸馏水，pH 7.2～8.0。

斜面培养基(g/L)：酵母膏1～3，牛肉膏1～3，胰蛋白胨2～7，葡萄糖10～20，FeSO₄微量，琼脂15～20，蒸馏水，pH 7.2～7.5。

发酵培养基(g/L)：糖蜜7～12，酵母膏1～3，尿素1～3，KH₂PO₄0.1～0.3，K₂HPO₄0.1～0.3，NaCl 0.1～0.3，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5，蒸馏水，pH7.2～8.0。

选择性培养基制作平板时加入1.5％～2％琼脂。

初筛方法：用筛选培养基制作平板，将样品稀释涂布，37℃培养16～20h，挑取生长快、透明圈大且有粘性的菌落转接于固体斜面培养基上，37℃培养16～20h后，4℃保存。

复筛方法：从斜面上挑取菌苔接种于发酵培养基，于37℃，150-200r/min培养1-2d，测定发酵液絮凝活性，挑选絮凝活性高的菌株。

菌种特征：

菌落较大、透明、粘性很强；

孢子萌发时，营养细胞发生的位置从赤道到顶端各种情况都有，孢子壳不是多处破裂，也不迅速消解；

许多菌株在含有足够的铁水化合物培养基上形成红色素，老培养物呈褐色；

大多数菌株精氨酸水解酶呈阳性。

16S rDNA测定：提取菌株基因组，根据细菌通用引物对基因组进行PCR扩增，获得1500bp左右的基因片段，测定碱基序列并做系统发育树。

本发明的具体操作步骤如下：

1)生物絮凝剂的发酵合成

将新鲜斜面上的菌苔转接至种子培养基培养后，转接至发酵培养基培养，得生物絮凝剂发酵液；

2)生物絮凝剂的制备

将生物絮凝剂发酵液第一次离心，除去沉淀，收集上清液，向上清液中加入乙醇，静置后第二次离心，除去上清液，向第二次离心后的沉淀物中再加入无水乙醇，搅拌，第三次离心，除去上清液，向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化铵，第四次离心，除去上清液得到沉淀物，将沉淀物溶解于NaCl溶液中，加入无水乙醇，搅拌，静置，第五次离心除去上清液得沉淀物，将沉淀物冷冻真空干燥得到纯品生物絮凝剂。

所述将新鲜斜面上的菌苔转接至种子培养基培养的温度最好为35～40℃，摇床转速最好为150～200r/min，培养时间最好为16～20h；所述转接至发酵培养基培养的接种量最好为1％～8％，培养的温度最好为30～40℃，摇床转速最好为150～200r/min，培养的时间最好为1～2d；

所述种子培养基由以下配比原料组成(g/L)：

葡萄糖7～12，酵母膏0.3～0.6，尿素0.3～0.6，KH₂PO₄0.1～0.3，NaCl 0.1～0.3，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5，蒸馏水，pH 7.2～g.0

所述发酵培养基由以下配比原料组成(g/L)：

糖蜜7～12，酵母膏1～3，尿素1～3，KH₂PO₄0.1～0.3，K₂HPO₄0.1～0.3，NaCl 0.1～0.3，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5，蒸馏水，pH7.2～8.0。

向上清液中加入乙醇的量最好按体积比为上清液的2～3倍，乙醇的浓度最好按体积百分比为95％，静置的温度最好为4℃，向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化铵的量最好按体积比为乙醇沉淀物的0.5～1倍，十六烷基三甲基溴化铵的浓度最好按体积百分比为2％；将沉淀物溶解于NaCl溶液中的NaCl溶液的浓度按体积百分比为3％～5％，加入无水乙醇的量按体积比最好为2～3倍。所述第一、二、三、四、五次离心的转速最好为4000～4500r/min，离心的时间最好为20min。

生物絮凝剂的絮凝活性(Flocculation Rate)可采用以下方法测定：

取40mL 1g/L高岭土溶液加至50mL刻度试管中，依次加入2.5mLCaCl₂溶液(1g/L)和1mL待测液，蒸馏水加至满刻度，充分混合后，迅速置于比色杯中，静止5min后，用紫外可见光光分光度计在波长550nm下测定吸光度。以空白发酵培养基作空白测定。计算公式如下：

式中，A：待测样品的OD₅₅₀值，B：空白培养基的OD₅₅₀值，D：发酵液稀释倍数。

生物絮凝剂的特征分析如下：

利用紫外分光光度计、红外光谱仪、斐林反应、双缩脲反应等方式对纯品生物絮凝剂进行成分分析，初步推断本发明涉及的生物絮凝剂主要活性物质是糖类物质。

本发明由地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法与现有技术中各种生物絮凝剂的制备方法相比具有原料成本低、发酵周期短、活性高等特点，该生物絮凝剂无毒无害、无二次污染、其生产工艺适合大规模生产及工业应用，具有很好的推广价值。

附图说明

图1为本发明实施例不同发酵时间对絮凝率的影响。在图1中，横坐标为培养时间/h，纵坐标为絮凝活性U/mL。

图2为本发明实施例生物絮凝剂的紫外扫描图谱。在图2中，横坐标为波长/nm，纵坐标为吸光度。

图3为本发明实施例生物絮凝剂的红外光谱。在图3中，横坐标为波数/cm^-1，纵坐标为透光率/％。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，以便为更好地理解本发明提供依据。

实施例1地衣芽孢杆菌合成生物絮凝剂的发酵过程曲线

将新鲜斜面上的菌苔转接至100mL种子培养基中，37℃摇床培养，转速195r/min，20h后，按4％的接种量转接至发酵培养基中，同样条件继续培养。测定不同时间发酵液的絮凝活性，结果如图1所示。从图1可以看出发酵44h时絮凝活性达716U/mL。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏0.5，尿素0.5，KH₂PO₄0.1，NaCl 0.1，MgSO₄·7H₂O0.2，蒸馏水，pH 7.2。

发酵培养基(g/L)：糖蜜10，酵母膏1，尿素1，KH₂PO₄0.1，K₂HPO₄0.1，NaCl 0.1，MgSO₄-7H₂O 0.2，蒸馏水，pH 7.2。

实施例2生物絮凝剂的紫外扫描图谱

将50mL发酵液于4500r/min离心20min，除去沉淀，收集上清液。向上清液中加入2倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜后，4500r/min再次离心20min；重复上述操作2次。向乙醇沉淀物中加入1倍体积的浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵，4500r/min离心，除去上清液收集沉淀物。将沉淀物溶解于4％NaCl溶液中并搅拌2h，加入2倍体积无水乙醇，搅拌均匀，4℃静置过夜，离心除去上清液得沉淀物，将沉淀物冷冻真空干燥即得到纯品生物絮凝剂。将提纯的生物絮剂用水稀释经进行紫外可见分光光度扫描，结果如图2所示。从图2可以看出，该生物絮凝剂在260nm和280nm均没有峰出现，由此推测该生物絮凝剂的主要活性成分既不是蛋白质也不是核酸类物质。

实施例3生物絮凝剂的红外光谱图

将实例2提纯的生物絮剂经傅立叶变换红外光谱仪扫描，结果如图3所示。从图3可以看出，该生物絮凝剂在2927.96cm^-1处吸收，C-H不对称伸缩振动产生的结果，此吸收峰是糖类的特征峰；3423.68cm^-1处有强而宽的吸收峰，是糖环中-OH中和N-H振动所致，表明分子内存在氢键；1637.14cm^-1处吸收峰为多糖中的乙酰氨基(-NHCOCH₃)的C＝O键伸缩振动造成的；1384.28cm^-1处吸收峰为羧基中的-COO^-中C＝O键对称伸缩振动的体现；1003.48cm^-1强吸收峰是酯内的C-O-C反对称伸缩振动吸收谱带。该红外光谱不仅显示了糖的特征结构，还有酰胺结构的特征吸收峰，由此可以推断该生物絮凝剂可能是一种氨基多糖。

Claims (9)

1.利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.2876，该微生物已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876；

其具体操作步骤如下：

1)生物絮凝剂的发酵合成

将新鲜斜面上的菌苔转接至种子培养基培养后，转接至发酵培养基培养，得生物絮凝剂发酵液；

2)生物絮凝剂的制备

将生物絮凝剂发酵液第一次离心，除去沉淀，收集上清液，向上清液中加入乙醇，静置后第二次离心，除去上清液，向第二次离心后的沉淀物中再加入无水乙醇，搅拌，第三次离心，除去上清液，向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化铵，第四次离心，除去上清液得到沉淀物，将沉淀物溶解于NaCl溶液中，加入无水乙醇，搅拌，静置，第五次离心除去上清液得沉淀物，将沉淀物冷冻真空干燥得到纯品生物絮凝剂；所述第一、二、三、四、五次离心的转速为4000～4500r/min，离心的时间为20min。

2.如权利要求1所述的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于所述将新鲜斜面上的菌苔转接至种子培养基培养的温度为35～40℃，摇床转速为150～200r/min，培养时间为16～20h。

3.如权利要求1所述的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于所述转接至发酵培养基培养的接种量为1％～8％，

4.如权利要求1或3所述的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于培养的温度为30～40℃，摇床转速为150～200r/min，培养的时间为1～2d。

5.如权利要求1所述的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于所述种子培养基由以下配比原料组成，单位为g/L：

葡萄糖7～12，酵母膏0.3～0.6，尿素0.3～0.6，KH₂PO₄0.1～0.3，NaCl 0.1～0.3，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5，蒸馏水，pH 7.2～8.0。

6.如权利要求1所述的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于所述发酵培养基由以下配比原料组成，单位为g/L：

糖蜜7～12，酵母膏1～3，尿素1～3，KH₂PO₄0.1～0.3，K₂HPO₄0.1～0.3，NaCl 0.1～0.3，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5，蒸馏水，pH7.2～8.0。

7.如权利要求1所述的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于向上清液中加入乙醇的量按体积比为上清液的2～3倍，乙醇的浓度按体积百分比为95％，静置的温度为4℃。

8.如权利要求1所述的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化铵的量按体积比为乙醇沉淀物的0.5～1倍，十六烷基三甲基溴化铵的浓度按体积百分比为2％。

9.如权利要求1所述的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于将沉淀物溶解于NaCl溶液中的NaCl溶液的浓度按体积百分比为3％～5％，加入无水乙醇的量按体积比为2～3倍。

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