CN112553259A - 一种用地衣芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用地衣芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，将特定的地衣芽孢杆菌通过ARTP和高压复合诱变处理，并经适当筛选获得絮凝活性显著高于出发菌的生产菌，再配合特定的发酵培养基，能够大量生产微生物絮凝剂，显著降低了微生物絮凝剂的生产成本。

Description

一种用地衣芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法
技术领域
本发明属于絮凝剂制备技术领域，具体涉及一种用地衣芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法。
背景技术
微生物絮凝剂(microbialflocculant，MBF)是由微生物经过培养与发酵所获得的产物，其主要成分为具有一定絮凝活性的有机聚合物。微生物絮凝剂主要用于除去废水中所含有的胶体、颗粒悬浮物物以及某些有机染料，除此之外，还被用于污泥的浓缩与脱水。相比传统絮凝剂，微生物絮凝剂具有更加安全、高效、无毒、无二次污染且可生物降解等优点，是一类新兴的环保水处理剂。
微生物絮凝剂由Louis Pasteur于19世纪70年代首先发现，其来源十分广泛且生产周期短，因此成为一个新兴的研究和应用热点。但是，由于其低产率和高成本，限制了其广泛应用的可能性。因此，通过生物工程技术来筛选、培养高产絮凝剂菌种并提高生物絮凝剂产量成为近年来研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用地衣芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法。
本发明的技术方案如下：
一种用地衣芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，包括如下步骤：
(1)将保存在甘油管中的地衣芽孢杆菌B.l.2876(Bacillus licheniformisCGMCC No.2876，请见CN101503709B，已于2009年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)将活化培养至对数中期，获得活化菌液；
(2)将上述活化菌液与菌液稳定剂混合后，涂覆于诱变载片的表面进行ARTP诱变，然后将ARTP诱变后的诱变载片置于菌体复苏液中，再加入硬质固体颗粒进行震荡，获得ARTP诱变菌液；将该ARTP诱变菌液培养至对数生长期后，进行高压诱变，获得高压诱变菌液；该步骤的诱变致死率为95％；
(4)将上述高压诱变菌液进行适当稀释后，涂布于LB琼脂糖平板上，于36-38℃培养10-20h，挑取面积大于3mm且光滑湿润的若干诱变菌落；
(5)将上述若干诱变菌落进行筛选，获得传代培养3次，其絮凝活性仍然稳定高于地衣芽孢杆菌B.1.2876的絮凝活性的33％的生产菌；
(6)将上述生产菌经活化后，置于发酵培养基中于36-38℃且180-220rpm的条件下培养10-20h，再经纯化，即得所述微生物絮凝剂；该发酵培养基的配方具体为：葡萄糖45g/L，NaNO3 16g/L，谷氨酸钠35-40g/L，酵母膏0.5-0.7g/L，尿素2-3g/L，KH2PO4 5-6g/L，K2HPO41-2g/L，NaCl 1.5-2.5g/L，MgSO4·7H2O 0.04-0.06g/L，蒸馏水为溶剂，pH 7.2-8.0。
在本发明的一个优选实施方案中，所述菌液稳定剂由蒸馏水、甘油和氯化钠组成，甘油在其中的体积百分比为10-30％，氯化钠在其中的浓度为1-10wt％。
进一步优选的，所述甘油在所述菌液稳定剂中的体积百分比为20％，氯化钠在所述菌液稳定剂中的浓度为1wt％。
在本发明的一个优选实施方案中，所述ARTP诱变的具体参数为：功率为0.10kW，气量为10SLM，时间为120s。
在本发明的一个优选实施方案中，所述高压诱变的具体参数为：处理菌液体积为10-15mL，温度为36-38℃，压力为150MPa，时间为15min。
在本发明的一个优选实施方案中，所述ARTP诱变的具体参数为：功率为0.10kW，气量为10SLM，时间为120s；所述高压诱变的具体参数为：处理菌液体积为10-15mL，温度为36-38℃，压力为150MPa，时间为15min。
在本发明的一个优选实施方案中，所述菌体复苏液中包括复苏培养基和PBS缓冲液，其中复苏培养基为LB培养基或牛肉膏蛋白胨培养基。
进一步优选的，所述菌体复苏液有复苏培养基、PBS缓冲液和水组成。
更进一步优选的，所述菌体复苏液由体积比为40：40：10的复苏培养基、PBS缓冲液和水组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养基的配方具体为：葡萄糖45g/L，NaNO3 16g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母膏0.6g/L，尿素2.36g/L，KH2PO4 5.6g/L，K2HPO4 1.4g/L，NaCl 2g/L，MgSO4·7H2O 0.048g/L，蒸馏水为溶剂，pH 7.2。
本发明的有益效果是：本发明将特定的地衣芽孢杆菌通过ARTP和高压复合诱变处理，并经适当筛选获得絮凝活性显著高于出发菌的生产菌，再配合特定的发酵培养基，能够大量生产微生物絮凝剂，显著降低了微生物絮凝剂的生产成本。
附图说明
图1为本发明实施例1的实验结果图之一。
图2为本发明实施例1的实验结果图之二。
图3为本发明实施例1的实验结果图之三。
图4为本发明实施例1的实验结果图之四。
图5为本发明实施例1的实验结果图之五。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
(1)将保存在甘油管中的地衣芽孢杆菌B.l.2876将活化培养至对数中期，获得活化菌液，具体为：
a、将保存在甘油管中的地衣芽孢杆菌B.l.2876用接种环取一环在平板上划线，在37℃培养16h，获得生长在平板上的菌株；
b、将上述菌株取一环接种至pH为7.2的LB培养基中，于温度37℃及转速200rpm的条件下培养16h，获得菌株在LB培养基中的生长曲线，获得其对数中期OD＝1.2，培养时间为7h；
(2)将上述活化菌液与菌液稳定剂混合后，涂覆于诱变载片的表面进行ARTP诱变，然后将ARTP诱变后的诱变载片置于菌体复苏液中，再加入硬质固体颗粒进行震荡，获得ARTP诱变菌液；将该ARTP诱变菌液培养至对数生长期后，进行高压诱变，获得高压诱变菌液；该步骤的优选的诱变致死率为95％；具体为：
a、取对数中期的活化菌液2mL离心去上清液，加入菌液稳定剂(20％甘油，1％氯化钠，余量为无菌水，在相同的诱变条件下，使用该菌液稳定剂后的菌体的存活率显著提高)，菌液浓缩至2倍，震荡1min；
b、取上述浓缩后的菌液10μL涂至诱变载片表面进行ARTP诱变，设置参数气量为10SLM，功率设置0.10kW，温度设置为30℃，分别以20s、40s、60s、80s、100s、120s、140s、160s为处理时间诱变时间；
c、将ARTP诱变后的诱变载片置于菌体复苏液(由体积比为40：40：10的LB培养基、PBS缓冲液和水组成)中，再加入玻璃球进行震荡以促进菌体从诱变载片上震荡入复菌体复苏液，获得ARTP诱变菌液，将其培养至对数生长期；
d、将培养至对数生长期的ARTP诱变菌液10-20mL装入聚丙烯袋中，并经封口机封口处理，在36-38℃下经150-200Mpa处理10-20min，获得高压诱变菌液；
(4)将上述高压诱变菌液进行适当稀释后，涂布于LB琼脂糖平板上，于37℃培养16h，挑取面积大于3mm且光滑湿润的若干诱变菌落(用菌落计数软件计数统计平板上的单菌落个数，绘制不同诱变时间菌株的致死率曲线。取致死率为95％的ARTP诱变的时间和高压诱变的具体参数，本实施例优选的，ARTP诱变的时间为120s，高压诱变的参数为菌液体积15mL，温度为37℃，压力为150MPa，时间为15min)；
(5)将上述若干诱变菌落进行筛选，获得传代培养3次，具体为：
a、从挑取的诱变菌落接种于种子培养基中进行活化获得种子液，将活化的种子液以4％的接种量接入50mL发酵培养基中，放置于摇床中设定参数37℃，200rpm。连续培养56h。提取51株诱变处理菌的粗提产物，依次检测絮凝活性和粗提产量。
如图1和2所示，挑选絮凝活性高于平均值的菌株进行絮凝剂粗提产量的筛选，获得菌株M5、M26和M32；
上述絮凝活性的检测方法为：取9mL高岭土溶液(5g/L)加至20mL刻度试管中，依次加入1mLCaCl2溶液(10g/L)和200mL待测的发酵液，蒸馏水加至满刻度，充分混合后，迅速置于比色杯中，静止5min后，用紫外可见光光分光度计在波长550nm下测定吸光度。以蒸馏水作空白测定。计算公式如下：
Figure BDA0002843477390000041
式中，A：待测样品的OD550值，B：空白培养基的OD550值，D：发酵液稀释倍数；
上述絮凝剂粗提产量的检测方法为：将待测的种子液以4％的接种量接入50mL发酵培养基中，放置于摇床中设定参数37℃，200rpm。连续培养56h；离心，获得上清液；上清液通过乙醇沉淀(加入3-5倍体积的无水乙醇，于4℃静置12h)后，离心(12000rpm，，15min，4℃)获得沉淀；将沉淀溶解于超纯水中，进行真空冷冻干燥，即得絮凝剂粗体物，将该絮凝剂粗体物进行比较；
b、将菌株M5、M26和M32继续培养验证其产量是否稳定，M26和M32的产量相比于原始菌株有明显提高，因而选取M32和M26做传代培养如图3所示，具体的，经过传代培养传代3次，菌株M32的絮凝剂产量分别为13.6，13.56，13.72g/L，均高于原始菌B.l.2876，如图4所示，选定菌株M32为生产菌。
(6)将上述生产菌M32经活化后，置于发酵培养基中于37℃且200rpm的条件下培养10-20h，再经纯化，即得所述微生物絮凝剂，具体结果如图5所示；该发酵培养基的配方具体为：葡萄糖45g/L，NaNO3 16g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母膏0.6g/L，尿素2.36g/L，KH2PO4 5.6g/L，K2HPO4 1.4g/L，NaCl 2g/L，MgSO4·7H2O 0.048g/L，蒸馏水为溶剂，pH 7.2。
本实施例的微生物絮凝剂的产量最高可达47g/L，该产量较原始菌株在原始培养条件下提高了5.71倍。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种用地衣芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将保存在甘油管中的地衣芽孢杆菌B.l.2876将活化培养至对数中期，获得活化菌液；
(2)将上述活化菌液与菌液稳定剂混合后，涂覆于诱变载片的表面进行ARTP诱变，然后将ARTP诱变后的诱变载片置于菌体复苏液中，再加入硬质固体颗粒进行震荡，获得ARTP诱变菌液；将该ARTP诱变菌液培养至对数生长期后，进行高压诱变，获得高压诱变菌液；该步骤的诱变致死率为95％；
(4)将上述高压诱变菌液进行适当稀释后，涂布于LB琼脂糖平板上，于36-38℃培养10-20h，挑取面积大于3mm且光滑湿润的若干诱变菌落；
(5)将上述若干诱变菌落进行筛选，获得传代培养3次，其絮凝活性仍然稳定高于地衣芽孢杆菌B.1.2876的絮凝活性的33％的生产菌；
(6)将上述生产菌经活化后，置于发酵培养基中于36-38℃且180-220rpm的条件下培养10-20h，再经纯化，即得所述微生物絮凝剂；该发酵培养基的配方具体为：葡萄糖45g/L，NaNO3 16g/L，谷氨酸钠35-40g/L，酵母膏0.5-0.7g/L，尿素2-3g/L，KH2PO4 5-6g/L，K2HPO41-2g/L，NaCl 1.5-2.5g/L，MgSO4·7H2O 0.04-0.06g/L，蒸馏水为溶剂，pH 7.2-8.0。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述菌液稳定剂由蒸馏水、甘油和氯化钠组成，甘油在其中的体积百分比为10-30％，氯化钠在其中的浓度为1-10wt％。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述甘油在所述菌液稳定剂中的体积百分比为20％，氯化钠在所述菌液稳定剂中的浓度为1wt％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述ARTP诱变的具体参数为：功率为0.10kW，气量为10SLM，时间为120s。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述高压诱变的具体参数为：处理菌液体积为10-15mL，温度为36-38℃，压力为150MPa，时间为15min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述ARTP诱变的具体参数为：气量为0.10kW，功率为10SLM，时间为120s；所述高压诱变的具体参数为：处理菌液体积为10-15mL，温度为36-38℃，压力为150MPa，时间为15min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述菌体复苏液中包括复苏培养基和PBS缓冲液，其中复苏培养基为LB培养基或牛肉膏蛋白胨培养基。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述菌体复苏液有复苏培养基、PBS缓冲液和水组成。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述菌体复苏液由体积比为40∶40∶10的复苏培养基、PBS缓冲液和水组成。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方具体为：葡萄糖45g/L，NaNO3 16g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母膏0.6g/L，尿素2.36g/L，KH2PO4 5.6g/L，K2HPO41.4g/L，NaCl 2g/L，MgSO4·7H2O 0.048g/L，蒸馏水为溶剂，pH 7.2。
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