CN108085350B - 一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于絮凝剂制备技术领域。本发明公开了一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其包括菌种培养、发酵培养、改性膨润土沉降、干燥等步骤，其中的速生杆菌菌株为从菲律宾蛤仔吐出的污泥中分离提纯获得的速生杆菌菌株Celeribacter sp.GHF1031。通过本发明中的方法制备获得的絮凝剂具有高絮凝率的特点，同时其性能稳定、无毒副作用、安全性高、生产简单、成本低廉，可以作为废水絮凝剂使用。

Description

一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法
技术领域
本发明涉及吸附剂制备技术领域，尤其是涉及一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法。
背景技术
絮凝剂是水处理技术中常用的药剂之一。近年来，应用最广泛的传统高分子聚合物类絮凝剂不断被发现存在威胁人类健康和破坏生态环境的潜在问题，研究环保无公害的新型絮凝剂便成为了水处理研究的热点问题，其中报道最多的当属微生物絮凝剂。生物絮凝剂是一类具有生物降解功能的聚合物，由具有这类特殊功能的微生物所分泌的包含多糖、脂类及蛋白质等。由于其对环境的安全及无污染性，因此受到国内外众多科研工作者的重视。目前已经从土壤、活性污泥、生活污水、各种工业废水等环境中筛选得到多种微生物絮凝剂产生菌，其中报道较多的有Nakamura等发现的产生微生物絮凝剂AJ7002的酱油曲霉AJ7002、Takagi等发现的产生PF101的拟青霉和Kurane等产生NOC-1的红平红球菌等，这些微生物絮凝剂相对于传统高分子化学絮凝剂来说具有环境友好、无二次污染的优点，但由于制取生物絮凝剂所需要的一些底物，如蔗糖、葡萄糖和果糖等成本过高，产量低，絮凝活性低等问题导致难于规模化应用及产业化，尚处于实验室研究阶段，离大规模推广应用还相差较大。以往研究者们都研究集中于分离高效的、具有制取絮凝剂功能的微生物，优化培养驯化条件及解析其絮凝机理和化学结构的研究。忽视了寻找新型廉价的替代原料作为制取生物絮凝剂的底物也是有效解决应用这一难题的有效途径之一。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用速生杆菌菌株及由其产生的胞外多糖制备具有吸附效率高、性能稳定、生产简单、成本低廉的絮凝剂的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明所用的速生杆菌菌株Celeribacter sp.GHF1031是从菲律宾蛤仔吐出的污泥中分离提纯获得，经实验发现该速生杆菌菌株Celeribacter sp.GHF1031的分泌物主要是具有絮凝功能的胞外多糖。
上述速生杆菌菌株Celeribacter sp.GHF1031已于2017年11月16日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.：14920，建议的分类命名为Celeribacter baekdonensis；上述速生杆菌菌株Celeribacter sp.GHF1031的16S rDNA全序列(1290bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702264，全序列如下：
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一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
a)将速生杆菌菌株接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成速生杆菌菌种液；
b)将速生杆菌菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；
c)向发酵菌液中加入改性膨润土并继续发酵培养得到原料液；
d)将原料液静置沉降，然后分离沉降物，将沉降物干燥后制得絮凝剂。
将速生杆菌菌株Celeribacter sp.GHF1031的菌种扩大培养后制成菌种液，将菌种液经发酵培养后制成发酵菌液，发酵菌液中含有丰富的胞外多糖，然后向发酵菌液中加入经改性处理的膨润土再继续发酵一段时间，利用改性膨润土表面表现为正电性的特点，将发酵菌液中的菌株和胞外多糖富集，这样可以优化后续胞外多糖的提取工艺，使胞外多糖提取不用经过操作复杂的醇提而能够直接富集获得吸附效率高、性能稳定、生产简单、成本低廉的絮凝剂的方法。
步骤a固体培养基培养可以获得足够的菌种，满足菌种液的浓度要求；步骤b发酵培养可以促进菌种充分分泌胞外多糖，提高胞外多糖的产率。
作为优选，所述的液体培养基由以下组分组成，秸秆水解液200～260mL/L、尿素0.4～0.6g/L、硫酸铵0.1～0.3g/L、酵母膏0.4～0.6g/L、磷酸氢二钾3.8～4.0g/L、磷酸二氢钾1.5～2.5g/L、柠檬酸三钠0.5～1.5g/L、蛋白胨2～3g/L，余量为陈化海水。
作为优选，固体培养基为由向液体培养基中添加液体培养基重量1.5～2.0％的琼脂并凝固后制得的斜面培养基。
作为优选，秸秆水解液由以下方法制得，将新鲜的芦苇用水清洗2～3次，然后将其切成12～17cm长的小段并在100～110℃下干燥，干燥后将其粉碎至粒径为0.5～1cm，制得干燥芦苇颗粒，将干燥芦苇颗粒浸泡在其重量7～11倍的重量浓度为1.7wt％稀硫酸中，并在115～125℃下高温反应100～140分钟制得混合液，接着将混合液过滤制得秸秆水解液。
秸秆水解液采用新鲜芦苇经酸化处理制得，其中含糖量较高，可以代替培养基中的葡萄糖，降低培养基的成本。
作为优选，改性膨润土由以下原料制得，将膨润土与膨润土重量1.5～2.0倍的无水乙醇混合并球磨2～4小时烘干后过800～1000目筛，然后与1.0～1.5倍重量的1mol/L乙酸钾溶液混合然后以1000～2000rpm转速下球磨1～1.5小时，然后静置1～2小时制得膨润土混合浆，然后将膨润土混合浆干燥并在300～400℃下处理30～40分钟制得改性膨润土。
膨润土为层状硅酸盐结构，其层间具有丰富的可交换离子。上述处理主要是为了扩大膨润土的层间距并改善其表面电性；采用将膨润土和乙酸钾溶液混合并球磨的方法进行，膨润土层间具有丰富的层间离子，这些层间离子具有较高的活性，将乙酸钾与膨润土混合球磨后，膨润土能够被机械破碎，成为尺寸更小的颗粒并能够活化其层间离子的活性，这一过程中，乙酸钾也能部分进入膨润土的层间，球磨之后的静置是为了使更多的乙酸钾替换膨润土层间具有高活性的离子，也即使更多的乙酸钾进入膨润土的层间并稳定存在，静置后高温处理，将膨润土层间的乙酸钾除去，进而完成了膨润土层间距的扩大，同时也由此改善了膨润土的表面电性，使其表面成为正电性表面，进而能够在加入到发酵菌液后能够吸引具有负电性表面的菌种和胞外多糖，使菌种和胞外多糖能够富集，使得后续处理更将简便。
作为优选，步骤a中，速生杆菌菌株的培养温度为25～30℃，培养时间为36～48小时，无菌水与固体培养基的体积比为1.0～1.5：1。
作为优选，步骤b中，速生杆菌菌种液接种浓度为每100mL液体培养基接种1.5～2.5mL速生杆菌菌种液，培养温度为23～27℃，培养时间为3～5天，摇床转速为100～160rpm。
作为优选，步骤c中，改性膨润土的添加量为每100mL发酵菌液添加5～15g，并按步骤b中培养条件继续培养1～2天。
作为优选，步骤d中，在1～5℃静置6～10小时，干燥温度为90～105℃，干燥时间1～2小时。
步骤d中，分离沉降物可以采用撇去上层液的方法实现，也可以采用过滤等方式分离沉降物。
因此，本发明具有以下有益效果：通过本发明中的速生杆菌菌株Celeribactersp.GHF1031及相关制备方法制备获得的絮凝剂具有高絮凝率的特点，同时其性能稳定、无毒副作用，安全性高，可以作为重金属废水絮凝剂使用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，若非特指，所有的设备和原料均可从市场上购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
本发明中所指的陈化海水为取新鲜海水在23℃静置沉降7天后所得的海水的上清液。
实施例1
一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
a)将速生杆菌菌株接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成速生杆菌菌种液；速生杆菌菌株的培养温度为25℃，培养时间为36小时，无菌水与固体培养基的体积比为1.0：1；
b)将速生杆菌菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；速生杆菌菌种液接种浓度为每100mL液体培养基接种1.5mL速生杆菌菌种液，培养温度为23℃，培养时间为3天，摇床转速为100rpm；
c)向发酵菌液中加入改性膨润土并继续发酵培养得到原料液；改性膨润土的添加量为每100mL发酵菌液添加5g，并按步骤b中培养条件继续培养1天；
d)将原料液在1℃下静置沉降6小时，然后分离沉降物，将沉降物干燥后制得絮凝剂，干燥温度为90℃，干燥时间1小时。
其中，液体培养基由以下组分组成，秸秆水解液200mL/L、尿素0.4g/L、硫酸铵0.1g/L、酵母膏0.4g/L、磷酸氢二钾3.8g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、柠檬酸三钠0.5g/L、蛋白胨2g/L，余量为陈化海水；固体培养基为由向液体培养基中添加液体培养基重量1.5％的琼脂并凝固后制得的斜面培养基；秸秆水解液由以下方法制得，将新鲜的芦苇用水清洗2次，然后将其切成12cm长的小段并在100℃下干燥，干燥后将其粉碎至粒径为0.5～1cm，制得干燥芦苇颗粒，将干燥芦苇颗粒浸泡在其重量7倍的重量浓度为1.7wt％稀硫酸中，并在115℃下高温反应100分钟制得混合液，接着将混合液过滤制得秸秆水解液。
改性膨润土由以下原料制得，将膨润土与膨润土重量1.5倍的无水乙醇混合并球磨2小时烘干后过800目筛，然后与1.0倍重量的1mol/L乙酸钾溶液混合然后以1000rpm转速下球磨1小时，然后静置1小时制得膨润土混合浆，然后将膨润土混合浆干燥并在300℃下处理30分钟制得改性膨润土。
实施例2
一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
a)将速生杆菌菌株接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成速生杆菌菌种液；速生杆菌菌株的培养温度为27℃，培养时间为42小时，无菌水与固体培养基的体积比为1.25：1；
b)将速生杆菌菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；速生杆菌菌种液接种浓度为每100mL液体培养基接种2.0mL速生杆菌菌种液，培养温度为25℃，培养时间为4天，摇床转速为130rpm；
c)向发酵菌液中加入改性膨润土并继续发酵培养得到原料液；改性膨润土的添加量为每100mL发酵菌液添加10g，并按步骤b中培养条件继续培养1.5天；
d)将原料液在3℃下静置沉降8小时，然后分离沉降物，将沉降物干燥后制得絮凝剂，干燥温度为97℃，干燥时间1.5小时。
其中，液体培养基由以下组分组成，秸秆水解液230mL/L、尿素0.5g/L、硫酸铵0.2g/L、酵母膏0.5g/L、磷酸氢二钾3.9g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、柠檬酸三钠1.0g/L、蛋白胨2.5g/L，余量为陈化海水；固体培养基为由向液体培养基中添加液体培养基重量1.75％的琼脂并凝固后制得的斜面培养基；秸秆水解液由以下方法制得，将新鲜的芦苇用水清洗2次，然后将其切成14cm长的小段并在105℃下干燥，干燥后将其粉碎至粒径为0.5～1cm，制得干燥芦苇颗粒，将干燥芦苇颗粒浸泡在其重量9倍的重量浓度为1.7wt％稀硫酸中，并在120℃下高温反应120分钟制得混合液，接着将混合液过滤制得秸秆水解液。
改性膨润土由以下原料制得，将膨润土与膨润土重量1.75倍的无水乙醇混合并球磨3小时烘干后过900目筛，然后与1.25倍重量的1mol/L乙酸钾溶液混合然后以1500rpm转速下球磨1.25小时，然后静置1.5小时制得膨润土混合浆，然后将膨润土混合浆干燥并在350℃下处理35分钟制得改性膨润土。
实施例3
一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
a)将速生杆菌菌株接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成速生杆菌菌种液；速生杆菌菌株的培养温度为30℃，培养时间为48小时，无菌水与固体培养基的体积比为1.5：1；
b)将速生杆菌菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；速生杆菌菌种液接种浓度为每100mL液体培养基接种2.5mL速生杆菌菌种液，培养温度为27℃，培养时间为5天，摇床转速为160rpm；
c)向发酵菌液中加入改性膨润土并继续发酵培养得到原料液；改性膨润土的添加量为每100mL发酵菌液添加15g，并按步骤b中培养条件继续培养2天；
d)将原料液在5℃下静置沉降10小时，然后分离沉降物，将沉降物干燥后制得絮凝剂，干燥温度为105℃，干燥时间2小时。
其中，液体培养基由以下组分组成，秸秆水解液260mL/L、尿素0.6g/L、硫酸铵0.3g/L、酵母膏0.6g/L、磷酸氢二钾4.0g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、柠檬酸三钠1.5g/L、蛋白胨3g/L，余量为陈化海水；固体培养基为由向液体培养基中添加液体培养基重量2.0％的琼脂并凝固后制得的斜面培养基；秸秆水解液由以下方法制得，将新鲜的芦苇用水清洗3次，然后将其切成17cm长的小段并在110℃下干燥，干燥后将其粉碎至粒径为0.5～1cm，制得干燥芦苇颗粒，将干燥芦苇颗粒浸泡在其重量11倍的重量浓度为1.7wt％稀硫酸中，并在125℃下高温反应140分钟制得混合液，接着将混合液过滤制得秸秆水解液。
改性膨润土由以下原料制得，将膨润土与膨润土重量2.0倍的无水乙醇混合并球磨4小时烘干后过1000目筛，然后与1.5倍重量的1mol/L乙酸钾溶液混合然后以2000rpm转速下球磨1.5小时，然后静置2小时制得膨润土混合浆，然后将膨润土混合浆干燥并在400℃下处理40分钟制得改性膨润土。
絮凝剂性能测定
分别用蒸馏水配制4g/L的高岭土悬浊液与10g/L的氯化钙溶液，取100mL高岭土悬浊液与5mL氯化钙溶液混匀得到混合液，用3支10mL的比色管各盛取5mL的混合液，依次标记为管1、管2、管3，然后分别取实施例1、实施例2、实施例3中制备的絮凝剂0.3g各自对应加入管1、管2、管3中，300r/min下搅拌10分钟，再50r/min下搅拌2分钟，然后静置10分钟，在波长550nm处测量吸光度，对照样为配制混合液所用蒸馏水，根据吸光度计算絮凝率。其中絮凝率为测试样的吸光度值排除对照样的吸光度值后相对测试样的吸光度值的百分比，结果如表1所示。
表1
实施例 实施例1 实施例2 实施例3
絮凝率/％ 86 88 89
絮凝剂的应用
取对数期生长的小球藻的藻液100mL，加入由速生杆菌菌株Celeribactersp.GHF1031制备的絮凝剂0.3g，在23℃下快速搅拌2～3分钟，搅拌速率150r/min，然后静置30分钟，小球藻的沉降率达到70％～77％，具体结果如表2所示。
表2小球藻絮凝率
实施例 实施例1 实施例2 实施例3
絮凝率/％ 70.5 73 77.6
应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1290
<212> DNA
<213> 速生杆菌(Celeribacte)
<400> 1
cttcggatct agcggcggac gggttagtaa cgcgtgggaa cgtacccaga tctacggaat 60
agcctcggga aactgagagt aataccgtat acgcccttcg ggggaaagat ttatcggatt 120
tggatcggcc cgcgtaagat tagatagttg gtggggtaat ggcctaccaa gtctacgatc 180
tttagctggt ttgagaggat gatcagcaac actgggactg agacacggcc cagactccta 240
cgggaggcag cagtggggaa tcttagacaa tgggcgcaag cctgatctag cgatgccgcg 300
tgagtgatga aggccttagg gtcgtaaagc tctttcgcct gtgaagataa tgacggtagc 360
aggtaaagaa accccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggggttagc 420
gttgttcgga attactgggc gtaaagcgca cgtaggcgga ctagtcagtc agaggtgaaa 480
tcccagggct caaccctgga actgcctttg atactgctag tcttgagttc gagagaggta 540
agtggaattc cgagtgtaga ggtgaaattc gtagatattc ggaggaacac cagtggcgaa 600
ggcggcttac tggctcgata ctgacgctga ggtgcgaaag tgtggggagc aaacaggatt 660
agataccctg gtagtccaca ccgtaaacga tgaatgccag acgtcgggta gcatgctatt 720
cggtgtcaca cctaacggat taagcattcc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac 780
tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 840
gcgcagaacc ttaccaaccc ttgacatcct gatcgcggat cgtagagata ctttccttca 900
gttcggctgg atcagtgaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 960
cggttaagtc cggcaacgag cgcaacccac atccttagtt accagcggtt aggccgggga 1020
ctctagggaa actgcccgtg ataagcggga ggaaggtgtg gatgacgtca agtcctcatg 1080
gcccttacgg gttgggctac acacgtgcta caatggcagt gacaatgggt taatcccaaa 1140
aagctgtctc agttcggatt ggggtctgca actcggcccc atgaagtcgg aatcgctagt 1200
aatcgcgtaa cagcatgacg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1260
caccatggga gttgggtcta cccgacggcc 1290

Claims (9)

1.一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
a）将速生杆菌菌株接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成速生杆菌菌种液；
b）将速生杆菌菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；
c）向发酵菌液中加入改性膨润土并继续发酵培养得到原料液；
d）将原料液静置沉降，然后分离沉降物，将沉降物干燥后制得絮凝剂；
所述速生杆菌菌株的保藏号为CGMCC No. 14920。
2.根据权利要求1所述的一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述的液体培养基由以下组分组成，秸秆水解液200～260mL /L、尿素0.4～0.6g/L、硫酸铵0.1～0.3g/L、酵母膏0.4～0.6g/L、磷酸氢二钾3.8～4.0g/L、磷酸二氢钾1.5～2.5g/L、柠檬酸三钠0. 5～1.5g/L、蛋白胨2～3 g/L，余量为陈化海水。
3.根据权利要求1所述的一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述固体培养基为向液体培养基中添加液体培养基重量1.5～2.0%的琼脂并凝固后制得的斜面培养基。
4.根据权利要求2所述的一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述的秸秆水解液由以下方法制得，将新鲜的芦苇用水清洗2～3次，然后将其切成12～17cm长的小段并在100～110℃下干燥，干燥后将其粉碎至粒径为0.5～1cm，制得干燥芦苇颗粒，将干燥芦苇颗粒浸泡在其重量7～11倍的重量浓度为1.7wt%稀硫酸中，并在115～125℃下高温反应100～140分钟制得混合液，接着将混合液过滤制得秸秆水解液。
5.根据权利要求1所述的一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述的改性膨润土由以下方法制得，将膨润土与膨润土重量1.5～2.0倍的无水乙醇混合并球磨2～4小时烘干后过800～1000目筛，与1.0～1.5倍重量的1mol/L乙酸钾溶液混合后以1000～2000rpm转速下球磨1～1.5小时，静置1～2小时制得膨润土混合浆，将膨润土混合浆干燥并在300～400℃下处理30～40分钟制得改性膨润土。
6.根据权利要求1所述的一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述步骤a）中，速生杆菌菌株的培养温度为25～30℃，培养时间为36～48小时，无菌水与固体培养基的体积比为1.0～1.5：1。
7.根据权利要求1所述的一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述步骤b）中，速生杆菌菌种液接种浓度为每100mL液体培养基接种1.5～2.5mL速生杆菌菌种液，培养温度为23～27℃，培养时间为3～5天，摇床转速为100～160rpm。
8.根据权利要求1所述的一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述步骤c）中，改性膨润土的添加量为每100mL发酵菌液添加5～15g，并按步骤b中培养条件继续培养1～2天。
9.根据权利要求1所述的一种利用速生杆菌菌株制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述步骤d）中，在1～5℃静置6～10小时，干燥温度为90～105℃，干燥时间1～2小时。
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