CN105567575A - 一株紫孢菌新菌株f1及其应用 - Google Patents

一株紫孢菌新菌株f1及其应用 Download PDF

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燕平梅
武晓英
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Abstract

本发明涉及一种微生物新菌株F1及其应用，具体得说是一株从山西省太原市杨家堡污水处理厂污水过滤后的淤泥中分离得到的紫孢菌新菌株F1，该菌株已于2015年12月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为紫孢菌，保藏号为，CGMCC？No.11813，本发明的紫孢菌新菌株在吸附重金属方面具有广阔的应用前景。

Description

一株紫孢菌新菌株F1及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物新菌株及其应用，具体的说是一株紫孢菌新菌株及其在吸附重金属方面的应用。
背景技术
水是生命之源，3月22日是联合国确定的“世界水日”。2015年，联合国发表的《世界水资源开发报告》中指出，当今世界面临着水资源危机的共同挑战，水一旦受到污染，就不能用于饮用、洗浴、工业或农业用途。水质不佳会损害人体健康，导致生态系统的服务功能退化。我国是世界上水资源污染比较严重的国家，尤其是重金属的积累，已经成为水污染的重要因素之一。
目前国内外已经出现了很多种清除水中重金属的方法，如化学修复法，活性炭吸附法和离子交换法等，这些方法虽然吸附效果很好，但是成本高，容易造成二次污染，不能彻底解决水资源再生利用问题。近年来，生物吸附技术越来越引起各国研究人员的重视，研究结果表明酵母菌、霉菌、细菌和藻类等具有较强的吸附重金属的能力。
霉菌在工业生产中是非常重要的一类微生物，它作为生物吸附剂具有很多优势：来源广泛，容易培养，价格低廉；操作简单，易于工业化；细菌制备吸附剂时，菌种扩大培养后必须通过大量离心收集生物量，操作麻烦。霉菌在扩大培养时，形成均匀的菌丝球且生物量高，易于收集。
目前，对霉菌作为吸附剂的研究主要集中在青霉菌(Penicillium.sp)，毛霉菌(Mucor.sp)，根霉菌(Rhizopus.sp)，曲霉菌(Aspergillus.sp)和木霉(Trichoderma.sp)等，湖南省农业生物技术研究中心发明的一种耐镉青霉菌(专利号CN104805021A)，陈雯莉等发明的一种高吸附镉的丝状真菌淡紫拟青霉(专利号CN103451103A)，马晨晨等利用橘绿木霉处理含Cr6+的水体，证明橘绿木霉对受污染水体有修复作用(专利号CN103740596A)。
目前，对于紫孢菌的研究在我国仅仅看到有关于紫孢菌防治线虫和害虫的报道，而对利用紫孢菌作为重金属吸附剂的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株紫孢菌新菌株F1，该菌株高度耐受重金属Cd2+，其菌
体可以大量吸附重金属Cd2+，在处理重金属污染水体中具有良好的应用前景。
本发明菌株是从山西省太原市杨家堡污水处理厂污水过滤后的淤泥中分离得到的紫孢菌新菌株，该菌株已于2015年12月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为紫孢菌，拉丁文学名为，Purpureocilliumsp，保藏号为，CGMCCNo.11813。
本发明的紫孢菌新菌株是一株属于子囊菌亚门，粪壳菌纲，肉座菌目，形虫草科，紫孢菌属的真菌，是一株首次发现的具有高耐受重金属的霉菌，本发明丰富了微生物作为吸附剂的种质资源。
本发明的紫孢菌新菌株F1具体是通过如下方法分离获得的：
(1)取太原市杨家堡污水处理厂污水过滤后的淤泥，装入自封袋，在实验室自然晾干。
(2)耐重金属Cd2+的紫孢菌新菌株F1诱捕分离：在100mL含有浓度为2mmol/LCd2+的PB液体培养基(土豆200g切块加水煮沸20min，过滤取滤液加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min)上，加入1g晾干后的淤泥置于摇床中，在30℃，180r/min的条件下振荡培养3天，得到悬浮液。
(3)取步骤(2)中的悬浮液做浓度梯度稀释至10-7，吸取10-5、10-6、10-7的菌悬浮液各150μl涂布于含Cd2+的PDA(土豆200g切块加水煮沸20min，过滤取滤液加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min)平板中，倒置于30℃培养箱中培养，平板上长出明显的白色菌落。
紫孢菌新菌株F1的筛选：
(1)待初筛平板中菌落长出后，挑取白色菌落的菌株转接入PB液体培养基(加入2mmol/LCd2+)，在30℃，180r/min的摇床中培养3-5天。
(2)取上述培养的菌悬浮液涂布在PDA平板上，30℃培养箱培养3-5天至长出单菌落，然后将单菌落保存在PDA试管斜面上得到纯培养的菌株，命名为F1。
对本发明的紫孢菌新菌株进行分子生物学鉴定：
(1)DNA分子的提取：采用Solarbio试剂盒提取
(2)PCR扩增丝状真菌18SrDNA区：引物序列为：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，共35个循环，所得的扩增产物用1％的琼脂糖凝胶板，在120V，60mA条件下进行电泳检测。
PCR反应体系见表1，反应程序见表2
表1PCR反应体系
表2PCR反应程序
(3)序列测定与分析：经由PCR扩增得到的18SrRNA，由基因公司进行纯化后，测序。将所测得序列登陆www.ncbi.nlm.nlh.gov进行同源性分析与比较，将所测序列提交至genbank，获取登陆号(KT809457)。经过比对后，发现F1与紫孢菌(PurpureocilliumKJ935014.1)之间的的相似性为100％，可以初步确定F1为紫孢菌(Purpureocillium)。
本发明的紫孢菌菌株F1对Cd2+耐受浓度的检测
将纯化保存的紫孢菌菌株F1接入PB培养液中培养获得菌悬液，分别取菌悬液1mL依次转移到含Cd2+浓度5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L······60mmol/L的三角瓶中，放于30℃培养箱中培养，150r/min培养5天，观察菌株的生长情况。若目的菌株能在培养基中生长，说明其能耐受相应的Cd2+浓度，不能生长则说明其不能耐受相应的Cd2+浓度。结果为紫孢菌菌株F1可以耐受大于60mmol/L的重金属镉离子。
紫孢菌菌株F1对其他重金属离子的耐受检测
将紫孢菌菌株F1接种在含有浓度为2mmol/L的Cu2+，Pb2+，Mn2+，Zn2+，Fe2+的PB培养液中进行培养，观察菌株的生长状况。若目的菌株能在培养基中生长，说明其能耐受相应的重金属离子，不能生长则说明其不能耐受相应的重金属离子。结果表明对Cu2+，Pb2+，Mn2+，Zn2+，Fe2+这些重金属离子都有一定的耐受性。
本发明的紫孢菌菌株F1在吸附重金属中的应用，其测定过程，具体包括如下步骤：
a.配制培养基，土豆200g切块加水煮沸20min，过滤取滤液加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min，得到PB液体培养基；
b.将紫孢菌菌株F1接种在含有浓度为1g/L的CdCl2的PB液体培养基中，得到所述菌株的培养液，培养液置于30℃条件下，180r/min的摇床中培养，连续培养24小时后，分别测定培养液中和菌体上吸附的Cd2+的浓度，判断紫孢菌菌株F1对重金属Cd2+的吸附能力。
结果表明，紫孢菌菌株F1对的Cd2+吸附率为50％，菌体上吸附Cd2+浓度为111g/g干菌体。
培养液经过稀释后直接进行原子吸收分光光度计测量Cd2+浓度。
菌丝体吸附浓度的测定方法是：培养好后，过滤，离心，将湿的菌丝体放在50℃烘箱中烘干，马弗炉500℃焚烧后，1：9盐酸定容，用原子吸收分光光度计测量Cd2+浓度。
本发明具有以下的有益效果：
本发明的紫孢菌菌株F1是首次从淤泥中分离得到的一株紫孢菌，紫孢菌菌株F1不仅耐受高浓度Cd2+，而且对其它重金属Cu2+，Pb2+，Mn2+，Zn2+，Fe2+都具有耐受性。
紫孢菌菌株F1菌丝体可以吸附浓度为1g/L的CdCl2培养液中50％的Cd2+，因此可以将其应用于重金属污染的水体。
附图说明
图1为紫孢菌菌株F1的菌落形态。
图2为紫孢菌菌株F1的菌丝体。
图3为紫孢菌菌株F1的分生孢子梗。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例：
紫孢菌新菌株的诱捕分离：
(1)从太原市杨家堡污水处理厂污水过滤后的淤泥，装入自封袋，在实验室自然晾干。
(2)耐重金属Cd2+的诱捕分离：在含浓度为2mmol/LCd2+的PB液体培养基(土豆200g切块加水煮沸20min，过滤取滤液加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min)上，加入1g晾干后的淤泥置于摇床中30℃，180r/min振荡培养3天。
(3)取(2)中的悬浮液做浓度梯度稀释至10-7，吸取10-5、10-6、10-7的菌悬浮液各150μl涂布于含Cd2+的PDA(土豆200g切块加水煮沸20min，过滤取滤液加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min)平板中，倒置于30℃培养箱中培养，平板上长出明显的白色菌落。
紫孢菌新菌株的筛选：
(1)待初筛平板中菌落长出后，挑取白色菌落的菌株转接入PB液体培养基(加入2mmol/LCd2+)，在30℃，180r/min的摇床中培养3-5天。
(2)取上述培养的菌悬浮液涂布在PDA平板上，30℃培养箱培养3-5天至长出单菌落，然后将单菌落保存在PDA试管斜面上得到纯培养的菌株，命名为F1。
紫孢菌菌株F1在吸附重金属中的应用，其测定过程，具体包括如下步骤：
a.配制培养基，土豆200g切块加水煮沸20min，过滤取滤液加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min，得到PB液体培养基；
b.将紫孢菌菌株F1接种在含有浓度为1g/L的CdCl2的PB液体培养基中，得到所述菌株的培养液，培养液置于30℃条件下，180r/min的摇床中培养，连续培养24小时后，分别测定培养液中和菌体上吸附的Cd2+的浓度，判断紫孢菌菌株F1对重金属Cd2+的吸附能力。
结果表明，紫孢菌菌株F1对的Cd2+吸附率为50％，菌体上吸附Cd2+浓度为111g/g干菌体。
培养液经过稀释后直接进行原子吸收分光光度计测量Cd2+浓度。
菌丝体吸附浓度的测定方法是：培养好后，过滤，离心，将湿的菌丝体放在50℃烘箱中烘干，马弗炉500℃焚烧后，1：9盐酸定容，用原子吸收分光光度计测量Cd2+浓度。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (4)

1.一株紫孢菌菌株F1，其特征在于，该菌株的保藏号为：CGMCCNo.11813。
2.根据权利要求1所述的一株紫孢菌菌株F1的应用，其特征在于，所述紫孢菌菌株F1在吸附重金属中的应用。
3.根据权利要求2所述的一株紫孢菌菌株F1的应用，其特征在于，所述紫孢菌菌株F1在吸附Cd2+中的应用。
4.根据权利要求2或3任一所述的一株紫孢菌菌株F1的应用，其特征在于，所述紫孢菌菌株F1在吸附重金属中的应用，其测定过程，具体包括如下步骤：
a．配制培养基，土豆200g切块加水煮沸20min，过滤取滤液加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min，得到PB液体培养基；
b.将紫孢菌菌株F1接种在含有浓度为1g/L的CdCl2的PB液体培养基中，得到所述菌株的培养液，将培养液30℃条件下，180r/min的摇床中培养，连续培养24小时后，分别测定培养液中和菌体上吸附的Cd2+的浓度，判断紫孢菌菌株F1对重金属Cd2+的吸附能力。
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