CN110343620B - 一株能吸附镉离子的植物根际真菌f9及其应用 - Google Patents

一株能吸附镉离子的植物根际真菌f9及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株能吸附镉离子的植物根际真菌F9及其应用，属于微生物领域。本发明的植物根际真菌F9，是污水处理厂中人工湿地的植物根际土壤中筛选，经分子生物学鉴定获得，分类命名为Westerdykella dispersa，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17480；保藏时间为：2019年04月08日。植物根际真菌F9对镉离子具有高效吸收作用，能够应用于生物吸附污水中的镉离子，为城市综合性重金属污水处理系统中高效菌种的选择提供依据。

Description

一株能吸附镉离子的植物根际真菌F9及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株能吸附镉离子的植物根际真菌F9及其应用。
背景技术
随着矿产资源的开发利用、工业发展和农业生产的现代化，重金属对环境造成的污染日趋严重，尤其是重金属Cd作为一个典型的有毒元素，在水环境中较易迁移，并能在生物体内富集，对人体有致突变、致癌、致畸的作用。而且，在我国当前经济高速发展阶段，重金属镉污染危害人体健康和造成重大经济损失的事故时有发生。因此，研究水体重金属镉污染治理技术是非常有必要的。
治理水体重金属镉污染刻不容缓，各种修复技术和措施正在研究和应用中。其中利用微生物对重金属的抗性和解毒作用，将微生物活细胞及其生物量作为廉价、高效的吸附剂用于净化重金属污水是一个研究热点。陈明等研究表明，微生物主要通过吸附和转化净化重金属污水。微生物通过物理化学作用将重金属离子积累在细胞的不同部位或吸附到胞外聚合物的结合位点上，或轻度鳌合在微生物多聚物上。Sarret G等研究表明，吸附后的重金属或在细胞壁表面(如啤酒酵母吸附Pb2+)，或在细胞内形成针状纤维(如假单胞菌EPS-5028吸附Pb2+)，或在细胞内形成团聚颗粒(如铜绿假单胞菌吸附Ag)。梁峙等研究发现，在重金属进入真核微生物和一些原核微生物细胞后可通过区域化作用分布在细胞内的不同部位，体内可合成重金属结合肤（如MTs）。Kefala等研究了放线菌Actinomycetes对Cd2+的吸附和富集情况，发现菌体能去除水中95%的Cd2+。Zouboulis等应用Bacillus licheniformiss和Bacillus laterosporus菌株对Cd2+进行吸附研究，发现两者的死细胞对Cd2+最大吸附量分别为142. 7 mg•g-1和159. 5mg•g-1。但是，前人研究大多针对单一金属离子。单一污水浓度进行，与实际污水情况有差异。
本发明筛选获得一株能够高效生物吸附镉离子的植物根际真菌F9。该根际真菌能有效吸附污水中的镉离子，从而为城市综合性重金属污水处理系统中高效菌种的选择提供依据，也为微生物菌剂的研发提供参考。
发明内容
本发明的目的在于针对现有重金属污染废水处理中存在的问题，提供一株能吸附镉离子的植物根际真菌F9及其应用。该根际真菌能有效吸附污水中的镉离子，而为城市综合性重金属污水处理系统中高效菌种的选择提供依据。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株能吸附镉离子的植物根际真菌F9，该菌株是污水处理厂中人工湿地的植物根际土壤中筛选，经分子生物学鉴定获得，其分类命名为Westerdykella dispersa，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17480；保藏时间为：2019年04月08日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，检测为存活菌株并保藏。
植物根际真菌F9的分离纯化方法：
供试土壤采集：于2015年11月采集武夷山市生活污水处理厂中人工湿地植物再力花、香根草、花叶芦荻的根际土壤。采用5点取样法采集土壤，取样深度为0-20 cm，将根系及黏附其上的根际土壤混合均匀后取土500 g装入无菌袋中，于4 ℃冰箱保存，其中部分新鲜土样用以菌株筛选。
真菌培养基：改良马丁琼脂固体培养基，其组成为：蛋白胨5.0 g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖20.0 g， KH2PO41.0 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，琼脂15.0 g，超纯水1000 mL，pH 为6.2-6.6。液体培养基同上，但不加琼脂。
植物根际真菌F9的筛选过程：
（1）根际土壤悬浊液的制备：
在无菌室中，准确称取新鲜土壤样品5.0g，放入装有95mL无菌水的250mL三角瓶中，置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再按10倍逐步稀释的方法，连续稀释，制成10-2、10-3、10-4系列稀释菌液，用于微生物的分离。
（2）根际真菌的分离、纯化和优势菌株筛选
1）分离：用无菌移液枪从10-2、10-3、10-4稀释菌液中各自吸取100 μL的土壤悬浮液均匀涂布在改良马丁琼脂固体培养基上。每个样品设3个重复。平板封口倒置于29 ℃恒温培养箱中，培养3-5 d。
2）纯化：用接种环挑取单菌落在培养基上进行划线纯化，每个单菌落划线3个平板。平板封口倒置于29 ℃恒温培养箱中，培养3-5 d。反复进行纯化2到3次，直至获得纯培养，分离后纯化的单菌落可进行斜面保种和甘油保种。
3）高效菌株筛选：在纯化过程中记录微生物数量，并以在最高稀释度平板上出现的5-10个菌落的菌株作为根际中的优势菌株。并从优势菌株中筛选出高效菌株，具体方法如下：取0.5 mL菌悬液接种到内装200 mL中等浓度污水(已灭菌)的三角瓶中，并以加等量无菌超纯水为空白对照，29 ℃、160 r·min-1恒温振荡培养48 h后，参照《水和废水监测分析方法》（第四版）测定污水Cd2+浓度，比较各菌株对Cd2+的吸附率，筛选出吸附效率高的菌种。
植物根际真菌F9形态特征：
菌株编号 形状 菌落质地 正面颜色 反面颜色 菌丝特征 边缘特征
F9 圆形 厚絮状 肉粉 橙红 致密厚实 羽毛状
植物根际真菌F9培养特性：高营养、高温（29 ℃）、高湿度
植物根际真菌F9的分子生物学鉴定：将植物根际真菌F9菌株用改良马丁琼脂培养基活化后，提取菌株的总DNA。利用真菌ITS序列通用引物ITS1： 5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇和ITS4 ： 5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇进行ITS序列PCR扩增。PCR扩增产物经回收、测序，获得植物根际真菌F30菌株ITS核苷酸序列，其长度为 546bp。将所得序列提交到GenBank 数据库进行BLAST 分析比对，发现与F9同源性达到99%的菌株均为韦斯特壳属，结合形态学特征和培养特征，最终将菌株F9鉴定为韦斯特壳（Westerdykella dispersa）。
植物根际真菌F9应用于生物吸附污水中的镉离子。
上述植物根际真菌F9应用于生物吸附污水中的镉离子，所述污水中镉离子的浓度为1-10 mg·L-1。
优选的上述污水中镉离子的浓度为1 mg·L-1。
本发明的优点在于：本发明从污水处理厂中人工湿地的植物根际土壤中筛选获得一株吸附镉离子的植物根际真菌F9。植物根际真菌F9能有效吸附镉离子，能够应用于生物吸附污水中的镉离子。污水中镉离子浓度在1-10 mg·L-1时，根际真菌F9对镉离子都有高效的生物吸附作用。尤其对镉离子浓度为1 mg·L-1的低浓度污水，接种根际真菌F9 48h后对镉离子的吸附率达59.23%。本发明的植物根际真菌F9为城市综合性重金属污水处理系统中高效菌种的选择提供依据。
附图说明：
图1植物根际真菌F9菌落形态图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于此。
实施例1 植物根际真菌F9的分离纯化
供试土壤采集：于2015年11月采集武夷山市生活污水处理厂中人工湿地植物再力花、香根草、花叶芦荻的根际土壤。采用5点取样法采集土壤，取样深度为0-20 cm，将根系及黏附其上的根际土壤混合均匀后取土500 g装入无菌袋中，于4 ℃冰箱保存，其中部分新鲜土样用以菌株筛选。
真菌培养基：改良马丁琼脂固体培养基：蛋白胨5.0 g，酵母浸出粉2.0 g，葡萄糖20.0 g， KH2PO41.0 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，琼脂15.0 g，超纯水1000 mL，pH 6.2-6.6。液体培养基同上，但不加琼脂。
植物根际真菌F9的筛选过程：
（1）根际土壤悬浊液的制备：
在无菌室中，准确称取新鲜土壤样品5.0g，放入装有95mL无菌水的250mL三角瓶中，置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再按10倍逐步稀释的方法，连续稀释，制成10-2、10-3、10-4系列稀释菌液，用于微生物的分离。
（2）根际真菌的分离、纯化和优势菌株筛选
1）分离：用无菌移液枪从10-2、10-3、10-4稀释菌液中各自吸取100 μL的土壤悬浮液均匀涂布在改良马丁琼脂固体培养基上。每个样品设3个重复。平板封口倒置于29 ℃恒温培养箱中，培养3-5 d。
2）纯化：用接种环挑取单菌落在培养基上进行划线纯化，每个单菌落划线3个平板。平板封口倒置于29 ℃恒温培养箱中，培养3-5 d。反复进行纯化2到3次，直至获得纯培养，分离后纯化的单菌落可进行斜面保种和甘油保种。
3）优势菌株筛选：在纯化过程中记录微生物数量，并以在最高稀释度平板上出现的5-10个菌落的菌株作为根际中的优势菌株。并从优势菌株中筛选出高效菌株，具体方法如下：取0.5 mL菌悬液接种到内装200 mL中等浓度污水(已灭菌)的三角瓶中，并以加等量无菌超纯水为空白对照，29 ℃、160 r·min-1恒温振荡培养48 h后，参照《水和废水监测分析方法》（第四版）测定污水Cd2+浓度，比较各菌株对Cd2+的吸附率，筛选出吸附效率高的菌种。筛选获得植物根际真菌F9对Cd2+的吸附效率最高。
实施例2 植物根际真菌F9的分子生物学鉴定
（1）菌株F9总DNA的提取
将菌株用改良马丁琼脂培养基活化后，采用OMEGA 基因组DNA提取试剂盒（D3485-01）、（DP302-02）提取菌株的总DNA。
（2）真菌ITS序列的PCR扩增
利用真菌ITS序列通用引物ITS1：5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇和ITS4： 5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇为正、反引物，扩增其ITS序列。
25μL PCR扩增反应体系
Figure 609081DEST_PATH_IMAGE001
PCR反应条件：93°C预变性3min；93°C变性45s，55°C复性45s，72°C延伸1.5min，35cycles；72°C终末延伸10min。
（3）PCR产物回收
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的条带，用天根回收试剂盒（DP214-03）进行纯化回收，最后测序。
植物根际真菌F9 ITS序列的核苷酸序列为：
5’-CTTCCGTAGGGTGACCTGCGGAAGGATCATTATCGTGGAGCTTCGGCTCCTTCGAGGGAGAACCCTTGCCTTTTCGAGCACCTGTTTGTTTCCTCGGCAGGCCCGCCTGCCAACGGGGACCATTTAAACTCTTGCAATCAACCTGAACAAAATCGTCTGAACAAAAAAAACTAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTATGGTATTCCGTAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTACACCTTCAAGCTCCGCTTGGTGTTGGGTGACTGTGGCCCCTCGGGGCCACTCGCCTCAAAGTCATTGGCGGCCGGTTTGTAGGCTTCGAGCGCAGCACATGTGCGTCTTCGTGCCTCGCGGATCGGCTCCCAGAAGCTAAATCTCACATTTTTGACCTCGAATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-3’
（4）真菌ITS序列分析
将所得ITS序列提交到GenBank 数据库进行BLAST 分析比对分析，选取与Genbank中同源性为99%以上的序列，初步确定菌株的属。发现与F9同源性达到99%的菌株均为韦斯特壳属，结合形态学特征和培养特征，最终将菌株F9鉴定为韦斯特壳（Westerdykella dispersa）。
实施例3植物根际真菌F9对污水中镉离子的生物吸附作用
将筛选鉴定获得的根际真菌F9接种于50 mL改良马丁液体培养基中，在29℃、160r/min条件下震荡培养36 h，然后将菌液在10000 r/min，4 ℃条件下离心5 min，弃去上清液，用无菌超纯水洗涤菌体3遍，弃去上清液后用无菌超纯水稀释菌体，并用血球计数法制成5×106CFU/mL的菌悬液。本试验设置高浓度、中浓度、低浓度3个污水浓度梯度，具体不同浓度污水各项指标浓度见表1。取0.5 mL制备的菌悬液加入200 mL灭菌的不同浓度污水中，对照组加等量无菌超纯水，在29 ℃、114 r/min恒温震荡培养箱中震荡培养。每个处理组设3个平行样。污水中重金属离子浓度的测定每12 h进行一次，连续测定48 h。
表1 不同浓度污水各项指标浓度（mg·L-1）
Figure 165702DEST_PATH_IMAGE002
重金属元素Cd2+浓度测定：取100 mL水样于200 mL烧杯中，加入5 mL硝酸，在电热板加热消解至10 mL，加入5 mL硝酸和2 mL高氯酸，消解至1 mL。冷却后定容至100 mL，最后用原子吸收分光光度计测定。
Figure 289647DEST_PATH_IMAGE003
表2植物根际真菌F9处理不同浓度 Cd2+的动态变化
Figure 264950DEST_PATH_IMAGE004
注：同列中不同小写字母表示同一处理时间不同处理在0.05水平下差异显著; 同行中不同大写字母表示同一菌株不同处理时间在0.05水平下差异显著。
表2结果显示，在3个污水浓度中，随着处理时间的推移，菌株F9处理下污水中Cd2+浓度呈明显下降趋势，且菌株F9处理下在不同处理时间Cd2+吸附率均显著高于对照组CK。接种菌悬液48h后，菌株F9对高、中、低浓度污水Cd2+吸附率分别为：54.60%、58.70%、59.23%均显著高于空白对照CK。表明菌株F9能显著降低Cd2+浓度范围为1-10 mg·L-1的污水中的Cd2+浓度，能够高效生物吸附Cd2+。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一株能吸附镉离子的植物根际真菌F9及其应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> ITS1
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> ITS4
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 546
<212> DNA
<213> F9 ITS
<400> 3
cttccgtagg gtgacctgcg gaaggatcat tatcgtggag cttcggctcc ttcgagggag 60
aacccttgcc ttttcgagca cctgtttgtt tcctcggcag gcccgcctgc caacggggac 120
catttaaact cttgcaatca acctgaacaa aatcgtctga acaaaaaaaa ctaaatcaaa 180
actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa 240
gtagtgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgccctat 300
ggtattccgt agggcatgcc tgttcgagcg tcatttacac cttcaagctc cgcttggtgt 360
tgggtgactg tggcccctcg gggccactcg cctcaaagtc attggcggcc ggtttgtagg 420
cttcgagcgc agcacatgtg cgtcttcgtg cctcgcggat cggctcccag aagctaaatc 480
tcacattttt gacctcgaat caggtaggga tacccgctga acttaagcat atcaataagc 540
ggagga 546

Claims (4)

1.一株能吸附镉离子的植物根际真菌F9，其特征在于：所述植物根际真菌F9，是污水处理厂中人工湿地的植物根际土壤中筛选，经分子生物学鉴定获得，其分类命名为Westerdykella dispersa，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17480，保藏时间为：2019年04月08日。
2.如权利要求1所述的植物根际真菌F9在生物污水中吸附镉离子中的应用。
3.根据权利要求2所述的植物根际真菌F9在生物污水中吸附镉离子中的应用，其特征在于：所述污水中镉离子的浓度为1-10 mg·L-1。
4.根据权利要求3所述的植物根际真菌F9在生物污水中吸附镉离子中的应用，其特征在于：所述污水中镉离子的浓度为1 mg·L-1。
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