CN113151090B - 一种铜污染处理剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重金属处理技术领域，具体公开一种铜污染处理剂及其应用。所述铜污染处理剂包含菌种保藏编号为CCTCC NO:M2021331的罗氏假单胞菌PR415。本发明提供的铜污染处理剂在高浓度铜离子污染环境下，依然可以保持吸附活性。将该铜污染处理剂用于水体中可以实现对高浓度(100mg/L)铜离子污染水体的有效处理，并可在短时间内达到较佳的处理效果。该铜污染处理剂对浓度为50mg/L的铜离子污染水体仅需10min铜离子的去除率就可以达到93％以上，使得该铜污染处理剂在治理环境及养殖水体中的铜污染中具有广阔的应用前景。

Description

一种铜污染处理剂及其应用

技术领域

本发明涉及重金属处理技术领域，尤其涉及一种铜污染处理剂及其应用。

背景技术

近年来，随着工农业的飞速发展，人类对环境的开发和资源利用日益增加，许多富含铜、铅、锌等重金属的废水未经合理处理就直接输入了其它水体中，导致我国地表水体重金属污染现象日趋严重。

目前已知的对重金属废水的治理方法主要有:物理法、化学法、物理化学法和生物法。物理法、化学法和物理化学法虽然一定程度上能降低水体中的重金属含量，但其投入成本较高，且治标不治本，易引起对水体的二次污染。生物法主要是利用植物和微生物对重金属的吸附和钝化作用来降低环境中的重金属的含量，其具有成本低、高效率、对环境破坏小和无二次污染等优势。利用植物进行重金属处理主要是用于对土壤中的重金属进行处理，其无法实现对高浓度重金属污染的水体进行有效处理，且植物对重金属的吸附作用极其有限。目前公开的部分微生物可以实现对重金属污染水体的有效处理，但是其只能在低浓度的重金属污染水体中发挥作用，在高浓度中金属污染水体中无法保持正常生长及活性。尤其是用于处理高浓度铜离子污染水体的微生物，目前未见报道。

发明内容

针对现有处理高浓度铜离子污染水体存在的上述问题，本发明提供一种铜污染处理剂及其应用，该铜污染处理剂可以快速吸附高浓度铜污染水体中的铜离子，且去除率高，在治理环境及养殖水体中的铜污染领域中具有广阔的应用前景。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种铜污染处理剂，包含菌种保藏编号为CCTCC NO:M2021331的罗氏假单胞菌PR415，所述罗氏假单胞菌PR415菌株属于罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)，于2021年04月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址位于中国湖北省武汉市武汉大学。

相对于现有技术，本发明提供的铜污染处理剂中含有罗氏假单胞菌PR415，使得铜污染处理剂具有快速吸附铜离子的功能，且在高浓度铜离子污染环境下，依然可以保持吸附活性。将该铜污染处理剂用于水体中可以实现对高浓度(100mg/L)铜离子污染水体的有效处理，并可在短时间内达到较佳的处理效果。该铜污染处理剂对浓度为50mg/L的铜离子污染水体仅需10min铜离子的去除率就可以达到93％以上，使得该铜污染处理剂在治理环境及养殖水体中的铜污染中具有广阔的应用前景。

优选的，所述罗氏假单胞菌PR415的培养方法为：将所述罗氏假单胞菌PR415接种到液体培养基中，于25℃-37℃下恒温振荡培养16h-48h。

进一步优选的，所述振荡培养的时间为18h。

优选的，所述罗氏假单胞菌PR415的接种浓度为1×10⁸个/mL-5×10¹⁰个/mL、接种体积为2％-4％。

进一步优选的，所述接种浓度为5×10⁸个/mL，所述接种体积为2％。

优选的，所述液体培养基包括以下重量份的组分：蛋白胨4-6份、酵母浸粉1.5-2.5份、红糖8-12份、氯化钠6-8份和无菌水950-1050份。

优选的，所述振荡培养的震荡速度为180rpm-220rpm。

本发明还提供了所述铜污染处理剂在去除铜污染水体中的铜离子中的应用。

上述铜污染处理剂可以实现对铜污染水体中的铜离子的快速、高效去除。

优选的，所述铜污染处理剂在去除铜污染水体中的铜离子中的应用中，所述铜污染水体中的铜离子的浓度为2mg/L-100mg/L。

优选的，所述铜污染处理剂在去除铜污染水体中的铜离子中的应用方法为：将所述铜污染处理剂加入所述铜污染水体中。

所述应用方法操作简单、不会产生二次污染，适合大规模推广使用。

优选的，所述铜污染处理剂加入所述铜污染水体后，所述铜污染水体中的所述罗氏假单胞菌PR415的活菌数为0.5×10¹¹cfu/L-3×10¹¹cfu/L。

保持铜污染水体中的罗氏假单胞菌PR415的活菌数为0.5×10¹¹cfu/L-3×10¹¹cfu/L，可以进一步提高铜离子的去除率和罗氏假单胞菌PR415对铜离子的吸附速度。

优选的，所述铜污染处理剂加入所述铜污染水体后的处理时间为10min-40min。

附图说明

图1是本发明实施例1中构建的系统进化树图；

图2是本发明实施例3中罗氏假单胞菌PR415在含铜菌固体培养基上的生长状态图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1、罗氏假单胞菌PR415的分离和纯化

称取10g的土壤样品(取自广东省海陵岛红树林国家湿地公园红树林土壤)于超净工作台中，并向土壤样品中添加90ml无菌水，置于振荡器上振荡60min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；待土壤分散后，吸取100ul土壤悬液到900ul无菌水中得到10倍稀释液，然后依次稀释10倍，得到100倍、1000倍、10000倍、100000倍和1000000倍稀释液，整个过程均在超净工作台中进行。

取100ul不同稀释倍数的稀释液分别涂布于三个DTB固体培养板，然后将培养板置于培养箱37℃恒温培养2-3天，待培养板上长出菌斑。

根据菌落生长情况，从不同稀释梯度平板上挑取形状、颜色、大小等不同的单菌斑进行平板划线，最终分离出单克隆菌株。

从上述DTB平板上挑取已纯化培养的上述单克隆菌株，接种于内含200mlDTB液体培养基的500ml锥形瓶中，在37℃、200rpm恒温摇床中培养24h，得到种子液。

其中，所述DTB固体培养基配方为：蛋白胨5份、酵母浸粉2份、红糖10、氯化钠7份、琼脂粉15份、无菌水1000份；将培养基分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入10ml培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存。

所述DTB液体培养基配方为：蛋白胨5份、酵母浸粉2份、红糖10、氯化钠7份、无菌水1000份；制作方法为：准确添加各组分，最后定容，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。

2、PCR扩增上述单克隆菌株的16SrDNA序列并测序

2.1、取基因组DNA：采用Omega Bacterial DNA Kit(D3350-01)试剂盒进行提取上述单克隆菌株的基因组DNA，提取步骤与说明书完全相同，提取得到的基因组DNA保存-20℃冰箱备用；

2.2、PCR扩增ITS序列：以步骤S1所得基因组DNA为模板，以Eubac27F和Eubac1492R为引物，进行PCR扩增，PCR反应体系(50μl)如下：

上游引物Eubac27F的序列为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQIDNO:1)；

下游引物Eubac1492R的序列为：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQIDNO:2)。

PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，变性、复性和延伸循环30次；72℃延伸10min，得到PCR扩增产物，于4℃保存。

2.3、PCR产物进行核酸电泳

取5μL步骤2.2中所得的PCR产物点样后于120V电压下进行核酸电泳25min。得到模板扩增出的16SrRNA片段的条带，且单一、亮度高，扩增的16SrRNA序列长度约为1500bp。

2.4、对16SrRNA序列进行测序

对2.2所得的PCR产物纯化回收后，取30ul纯化产物送广州擎科生物技术有限公司进行序列双向测通测定，测序结果显示所述的16S rRNA序列长度为1453bp，具体序列如SEQIDNO:3所示。

2.5、构建系统进化树

将上述16S rRNA序列输入NCBI中，进行BLAST比对，其16SrRNA序列与罗氏假单胞菌Pseudomonas rhodesiaestrain DZXOTU1(MT998277.1)的序列相似度达到99％，并且其与罗氏假单胞菌属的16SrRNA条形码数据库中大部分序列高度相似但不存在完全重合，也没有唯一邻近的物种序列；同时基于条形码16SrRNA区段序列构建NJ系统进化树，如图1所示，通过BLAST比对和进化树构建可知，上述分离所得的菌株在分类上属于罗氏假单胞菌属Pseudomonas rhodesiae，且为一个新种，将其命名为罗氏假单胞菌PR415(Pseudomonasrhodesiae.PR415)，并于2021年04月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址位于中国湖北省武汉市武汉大学。

实施例2

罗氏假单胞菌发酵液的制备

将上述实施例1得到的罗氏假单胞菌PR415种子液，以5×10⁸个/mL的接种浓度、2％的接种体积接种于内含300ml DTB液体培养基的1000ml锥形瓶中，于37℃、200rpm的恒温摇床中培养18h，制得所述的罗氏假单胞菌PR415发酵液。经检测，发现该罗氏假单胞菌PR415发酵液具有吸附并降低水体中的铜离子的特性。

DTB液体培养基的配方和制备方法同实施例1。

实施例3

罗氏假单胞菌PR415的耐铜活性鉴定

吸取25ul实施例2得到的发酵液涂布于含铜菌固体培养基上，置于生化培养箱中37℃恒温培养48小时，观察罗氏假单胞菌PR415在培养基上是否生长，若有菌生长，则表明该菌株具有一定的耐铜特性；若无菌生长，则表明该菌株无耐铜特性。

培养结果如图2所示：罗氏假单胞菌PR415在含铜固体菌培养基上生长良好。表明本发明的罗氏假单胞菌PR415具有一定的耐铜特性。

所述含铜菌固体培养基包括以下重量份的组分：

胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、1000mg/L铜离子标准溶液200份、琼脂粉15份、无菌水1000份。

上述含铜菌固体培养基的配制方法为：

称取或量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中，并分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，取出保存备用。

实施例4

罗氏假单胞菌PR415吸附水体铜离子能力的检测

将实施例2得到的发酵液以12000r/min转速离心10min去除上清，保留沉淀；然后用无菌水吹打清洗沉淀，并以12000r/min转速离心10min，去上清，留沉淀，反复清洗三次，得到菌体沉淀；

将得到的菌体沉淀直接投入到配制的含有铜离子的水体样品中，设置条件。条件一：水体铜离子浓度分别为：2mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L；条件二：水体PH值分别为2、3、4、5和6，条件三：菌体投加量分别为0.5×10¹¹cfu/L、1×10¹¹cfu/L、2×10¹¹cfu/L和3×10¹¹cfu/L，从而进行投加菌体吸附水体样品铜离子的实验。

1、将菌体按照2×10¹¹cfu/L的投加量投入到内含100mL含有铜离子(2mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L)的水体样品玻璃锥形瓶容器中，搅拌混匀，调节pH至5，然后用400目纱布与报纸封口。按照震荡速度为220r/min，28℃的条件下，培养40min后取水样，再将水样以12000r/min的转速离心10min，取上清液，测定此时上清液(即水体样品)中的总铜的浓度，并计算其去除率，结果见表1。

表1

可见，罗氏假单胞菌PR415在上述条件下，对铜离子含量100mg/L的水体均有较好的去除效果。

2、将菌体按照0.5×10¹¹cfu/L、1×10¹¹cfu/L、2×10¹¹cfu/L和3×10¹¹cfu/L的投加量投入到内含100mL含有50mg/L铜离子的水体样品玻璃锥形瓶容器中，搅拌混匀，调节pH至5，然后用400目纱布与报纸封口。按照震荡速度为220r/min，28℃的条件下，培养40min后取水样，再将水样以12000r/min的转速离心10min，取上清液，测定此时上清液(即水体样品)中的总铜的浓度，并计算其去除率，结果见表2。

表2

菌体投加量cfu/L	最终铜离子浓度mg/L	铜离子去除率％
			0.5×10<sup>11</sup>	2.615	94.77
1×10<sup>11</sup>	2.270	95.46
			2×10<sup>11</sup>	1.615	96.77
3×10<sup>11</sup>	0.895	98.21

3、将菌体按照2×10¹¹cfu/L的投加量投入到内含100mL含有50mg/L铜离子的水体样品玻璃锥形瓶容器中，搅拌混匀，调节pH至5，然后用400目纱布与报纸封口。按照震荡速度为220r/min，28℃的条件下，分别在培养10min、20min、30min和40min后取水样，再将水样以12000r/min的转速离心10min，取上清液，测定此时上清液(即水体样品)中的总铜的浓度，并计算其去除率，结果见表3。

表3

4、将菌体按照2×10¹¹cfu/L的投加量投入到内含100mL含有50mg/L铜离子的水体样品玻璃锥形瓶容器中，搅拌混匀，分别调节pH至3、4、5和6，然后用400目纱布与报纸封口。按照震荡速度为220r/min，28℃的条件下，培养10min后取水样，再将水样以12000r/min的转速离心10min，取上清液，测定此时上清液(即水体样品)中的总铜的浓度，并计算其去除率，结果见表4。

表4

pH	最终铜离子浓度mg/L	铜离子去除率％
			3	6.3	87.40
4	4.47	91.06
			5	3.11	93.78
6	3.39	93.22

其中，上述罗氏假单胞菌PR415在pH为4-6的铜污染水体中均具有较好的铜离子去除效果。

综上，上述罗氏假单胞菌PR415菌体的投加量为2×10¹¹cfu/L、水体铜离子含量为50mg/L时，罗氏假单胞菌PR415处理10min，对铜离子的吸附效果就达到了93.78％；上述罗氏假单胞菌PR415菌体的投加量为2×10¹¹cfu/L、水体铜离子含量为100mg/L时，罗氏假单胞菌PR415处理40min，对铜离子的吸附效果达到了85.36％，吸附速度快。因此，其在水体及环境重金属铜污染的治理中具有良好的应用前景。

其中，火焰原子吸收分光光度计测定吸附实验后水体样品的上清液中的铜含量，具体方法如下：

a、样品预处理：取20mL罗氏假单胞菌PR415处理后的水体样品、利用冷冻离心机以12000r/min转速离心10min，取上清液4mL置于100mL容量瓶中，加入去离子水到刻度线，混匀后。立即取50mL稀释完毕的样品进行火焰原子吸收分光光度计检测；

b、本实验采用火焰原子吸收分光光度法来测定水体样品中的铜离子浓度，原子吸收分光光度计的组成部分有光源、试样原子化器、数据处理系统及单色仪，当待测样进入仪器中后，铜离子的浓度将按照吸收特征辐射光的大小程度来计算。反应原理为：待测样品通过雾化器后形成雾状并被出口处的乙炔火焰灼烧形成蒸汽，空心阴极灯在辐射过程中产生的特征谱线能在通过蒸汽时被基态原子所吸收，通过这种减弱的程度能够测出所需元素的浓度。

c、测量参数(如表5)

表5参数条件

d、铜离子标准曲线：使用从国家有色金属及电子材料分析测试中心购买的浓度为1000mg/L的铜标准溶液，分别取铜标准使用溶液0、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL，加去离子水定容至50mL；采用火焰原子吸收分光光度法，从而得到吸光度与铜离子含量关系的标准曲线。

e、当吸附处理后，根据水体样品的吸光度，将吸光度值带入吸光度与铜离子含量关系的标准曲线，得到处理后的水体中的铜离子含量。

实施例5

罗氏假单胞菌发酵液的制备

将上述实施例1得到的罗氏假单胞菌PR415种子液，以5×10¹⁰个/mL的接种浓度、3％的接种体积接种于内含300ml DTB液体培养基的1000ml锥形瓶中，于25℃、220rpm的恒温摇床中培养48h，制得所述的罗氏假单胞菌PR415发酵液。

DTB液体培养基的配方和制备方法同实施例1。

对该实施例中得到的罗氏假单胞菌PR415吸附水体铜离子能力的检测，检测方法与实施例4中的检测方法相同。

经检测，该罗氏假单胞菌PR415吸附水体铜离子能力与实施例4中的检测结果基本相当。

实施例6

罗氏假单胞菌发酵液的制备

将上述实施例1得到的罗氏假单胞菌PR415种子液，以1×10⁸个/mL的接种浓度、4％的接种体积接种于内含300ml DTB液体培养基的1000ml锥形瓶中，于30℃、180rpm的恒温摇床中培养16h，制得所述的罗氏假单胞菌PR415发酵液。

DTB液体培养基的配方和制备方法同实施例1。

对该实施例中得到的罗氏假单胞菌PR415吸附水体铜离子能力的检测，检测方法与实施例4中的检测方法相同。

经检测，该罗氏假单胞菌PR415吸附水体铜离子能力与实施例4中的检测结果基本相当。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳中绿环境集团有限公司

<120> 一种铜污染处理剂及其应用

<130> 2021

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Eubac27F

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Eubac1492R

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1453

<212> DNA

<213> 16S rRNA 1453bp

<400> 3

ggcgtcctcc ccccgggggg gcgcctacca tgcaagtcga gcggtagaga gaagcttgct 60

tctcttgaga gcggcggacg ggtgagtaat gcctaggaat ctgcctggta gtgggggata 120

acgttcggaa acgaacgcta ataccgcata cgtcctacgg gagaaagcag gggaccttcg 180

ggccttgcgc tatcagatga gcctaggtcg gattagctag ttggtggggt aatggctcac 240

caaggcgacg atccgtaact ggtctgagag gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg 300

gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcga aagcctgatc 360

cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggtctt cggattgtaa agcactttaa gttgggagga 420

agggccatta cctaatacgt gatggttttg acgttaccga cagaataagc accggctaac 480

tctgtgccag cagccgcggt aatacagagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt 540

aaagcgcgcg taggtggttt gttaagttgg atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac 600

tgcattcaaa actgactgac tagagtatgg tagagggtgg tggaatttcc tgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agatatagga aggaacacca gtggcgaagg cgaccacctg gactgatact 720

gacactgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg tcaactagcc gttgggagcc ttgagctctt agtggcgcag ctaacgcatt 840

aagttgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc 900

cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggcct 960

tgacatccaa tgaactttct agagatagat tggtgccttc gggagcattg agacaggtgc 1020

tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa 1080

cccttgtcct tagttaccag cacgttatgg tgggcactct aaggagactg ccggtgacaa 1140

accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc ttacggcctg ggctacacac 1200

gtgctacaat ggtcggtaca gagggttgcc aagccgcgag gtggagctaa tcccataaaa 1260

ccgatcgtag tccggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa 1320

tcgcgaatca gaatgtcgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccatgggagt gggttgcacc agaagtagct agtctaacct tcgggaggac ggtacccacg 1440

gttgatcaga cgc 1453

Claims (10)

1.一种铜污染处理剂，其特征在于：包含菌种保藏编号为CCTCC NO:M2021331的罗氏假单胞菌PR415。

2.如权利要求1所述的铜污染处理剂，其特征在于：所述罗氏假单胞菌PR415的培养方法为：将所述罗氏假单胞菌PR415接种到液体培养基中，于25℃-37℃下恒温振荡培养16h-48h。

3.如权利要求2所述的铜污染处理剂，其特征在于：所述罗氏假单胞菌PR415的接种浓度为1×10⁸个/mL-5×10¹⁰个/mL、接种体积为2％-4％。

4.如权利要求2所述的铜污染处理剂，其特征在于：所述液体培养基包括以下重量份的组分：蛋白胨4-6份、酵母浸粉1.5-2.5份、红糖8-12份、氯化钠6-8份和无菌水950-1050份。

5.如权利要求2所述的铜污染处理剂，其特征在于：所述振荡培养的震荡速度为180rpm-220rpm。

6.权利要求1所述的铜污染处理剂在去除铜污染水体中的铜离子中的应用。

7.如权利要求6所述的铜污染处理剂在去除铜污染水体中的铜离子中的应用，其特征在于：所述铜污染水体中的铜离子的浓度为2mg/L-100mg/L。

8.如权利要求6所述的铜污染处理剂在去除铜污染水体中的铜离子中的应用，其特征在于：所述应用的方法为将所述铜污染处理剂加入所述铜污染水体中。

9.如权利要求8所述的铜污染处理剂在去除铜污染水体中的铜离子中的应用，其特征在于：所述铜污染处理剂加入所述铜污染水体后，所述铜污染水体中的所述罗氏假单胞菌PR415的活菌数为0.5×10¹¹cfu/L-3×10¹¹cfu/L。

10.如权利要求8所述的铜污染处理剂在去除铜污染水体中的铜离子中的应用，其特征在于：所述铜污染处理剂加入所述铜污染水体后的处理时间为10min-40min。

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