CN113957013B

CN113957013B - 一株假单胞菌、包括假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113957013B
Application number: CN202111371438.7A
Authority: CN
Inventors: 陈金全; 梁琪; 叶敬旴; 李涵宇; 于利浩; 文宇倩; 杨若渺
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2021-11-18
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-11-18
Also published as: CN113957013A

Abstract

本发明提供了一株假单胞菌、包括假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用，属于微生物菌剂技术领域；所述假单胞菌的保藏编号为：CGMCCNO.18739。本发明从重金属污染的农田土壤中选育获得一株假单胞菌属植物促生细菌。本发明的菌株具有良好的抗汞性能，能通过生物挥发作用，降低土壤总汞含量，通过生物钝化作用降低土壤汞有效态含量，具有较强的实际应用潜力。

Description

一株假单胞菌、包括假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其涉及一株假单胞菌、包括假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

由于工业、采矿业等的快速发展，土壤汞污染日趋严重。汞污染不仅减少了可利用耕地面积，而且降低耕地质量，且大多数中轻度汞污染土壤依然承载着农业生产的功能，农产品安全形势严峻。

土壤中的汞主要以结合形态和化学形态存在，吸附、解吸、氧化、还原及络合等作用是影响土壤中含汞化合物迁移、残留、形态分异和生物有效性的主要过程。土壤汞污染的修复途径主要有两种：(1)一种是将汞固定在土壤中，通过吸附或改变汞的化学形态，降低汞的生物有效性，使其不易被植物吸收，抑制其进入生物链，称为钝化修复；(2)另一种是将土壤中的汞提取出来，降低汞在土壤中的浓度，称为提取修复。总体上，土壤汞污染修复技术可分为物理化学法和生物法，生物法包括植物修复和微生物修复。

物理化学修复方法，主要有化学淋洗、热解吸、电动修复等，能够有效且快速的修复受汞污染的土壤，具修复效果良好，但由于其成本高，消耗高，易产生二次污染等局限，故主要适用于污染严重、面积小的场地污染。对于污染面积较大的土壤则要消耗大量的人力和财力，且容易造成土壤结构破坏和土壤肥力下降等危害土壤健康的负面影响，尤其是当采用不恰当的修复方式时，修复所带来的环境负面影响可能会超过土壤中污染物暴露的危害，其发展与应用受到了严重制约。

植物修复即利用某些植物能忍耐和超量积累某种汞的特性来清除土壤中的汞。它具有良好的经济、生态效益，且被认为是一种新兴高效、绿色廉价的生物修复途径。国内外通过大量的研究，陆续发现了一些能够富集汞的植物，如苎麻、加拿大杨、小叶黄杨等，但目前尚未发现可有效用于修复汞污染土壤的超富集植物。尽管植物修复技术在汞污染土壤恢复中得到了广泛的应用，但用于修复土壤汞污染的植物生物量大，导致其后处理繁琐、耗资大等问题未能得到很好解决，且植物修复技术耗时过长，修复过程中污染土地必须闲置出来，治理目的地的经济价值几乎为零。

土壤中存在的汞主要以溶液或者吸附态的Hg²⁺为主，不能像有机污染物那样被微生物降解，但可以借助微生物对汞的还原、吸附、沉淀等作用，改变土壤中汞的赋存形态，影响其生物有效性；同时微生物也能调节植物的养分供应，促进植物生长发育，从而达到降低环境中的汞毒害和修复汞污染环境的目的。目前基于微生物的挥发和钝化的原位修复技术，因其环境的协调性，修复成本经济性，表现出了很大的发展潜力。目前，生物还原挥发脱Hg技术已经成功应用于含Hg废水的处理。但迄今为止，抗Hg细菌应用于土壤Hg污染修复的研究还较少。2017年Mahbub等人首次采用细菌修复重度Hg污染的土壤，针对不同类型的Hg污染土壤，生物还原挥发除Hg率在33％～48％之间，说明其应用于土壤Hg污染原位修复具有可行性(K.R.Mahbub,K.Krishnan,S.Andrews,H.Venter,R.Naidu,M.Megharaj,Bio-augmentation and nutrient amendment decrease concentration of mercury incontaminated soil,Sci.Total Environ.,576(2017)303-309.)。但是，由于重金属Hg污染土壤的微生物挥发强化修复起步晚，大多处于实验研究阶段，尚未见Pseudomonas属的细菌修复农田汞污染土壤的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株假单胞菌、包括假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用，该株假单胞菌可以有效修复汞污染土壤。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)AN-15，保藏编号为：CGMCCNO.18739。

本发明还提供了一种包括上述方案所述假单胞菌的菌剂。

本发明还提供了上述方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将所述假单胞菌接种于LB培养基，进行培养，得到菌剂。

本发明还提供了上述方案所述假单胞菌或者所述菌剂或者所述制备方法制备得到的菌剂在改良汞污染土壤中的应用。

优选的，所述改良重金属污染土壤包括降低土壤中的汞含量和/或有效态汞含量。

本发明还提供了上述方案所述假单胞菌或者所述菌剂在挥发除汞和/或钝化除汞中的应用。

优选的，所述汞为Hg²⁺。

本发明的有益效果：本发明提供了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)AN-15，保藏编号为：CGMCC NO.18739。AN-15具有良好的汞耐受性、汞抗性以及较高汞去除效能，对土壤汞污染具有较强的应用潜力。接种AN-15的高浓度汞污染土壤(80mg/Kg)，120d后，土壤中汞的去除率达56.38％，剩余总汞含量为34.90mg/Kg，与非接菌处理相比显著减少。接菌处理比非接菌处理的DTPA-Hg含量显著降低了42.62％，其含量由1.24mg/Kg减少为0.71mg/Kg，说明AN-15可以有效修复汞污染土壤。本发明可为完善土壤重金属修复手段提供参考，为经济有效的农田Hg污染土壤原位修复治理提供技术手段，具有重要的现实意义和应用价值。

附图说明

图1为AN-15对汞的抗性能力；

图2为AN-15系统发育树；

图3为AN-15的Hg去除效能；

图4为AN-15对汞污染土壤的修复效能。

生物保藏说明

假单胞菌(Pseudomonassp.)AN-15，于2019年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18739。

具体实施方式

在本发明中，假单胞菌AN-15的16S rRNA序列与韩国假单胞菌(Pseudomonas)的16S rRNA相似性达99％。

AN-15的16S rRNA和基因组序列已提交NCBI数据库，编号：MW216911(16S rRNA)和CP049737(基因组)。AN-15的16S rRNA序列与韩国假单胞菌(Pseudomonas)的16S rRNA相似性达99％，通过与相近的韩国假单胞细菌的基因组比较，平均核苷酸相似度都小于93％，说明该菌不属于已发现的假单胞菌，故而命名为Pseudomonas sp.，AN-15，如表1所示。

表1基因组平均核苷酸相似度

在本发明中，AN-15是从农田土壤中选育获得，采样地址位于云南省安宁市连然镇大屯的氯碱厂附近农田(26°53’53”N，102°27’54”E)，该氯碱厂早期采用水银烧碱法生产氯碱，产生大量的含汞盐泥，并堆存21于厂区渣场内，已于2011年停产，厂区主要重金属污染物为汞。AN-15具有良好的汞耐受性、汞抗性以及较高汞去除效能，对土壤汞污染具有较强的应用潜力。

本发明提供了一种包括上述方案所述假单胞菌的菌剂。

将所述假单胞菌接种于LB培养基，进行培养，得到菌剂。

本发明还提供了上述方案所述假单胞菌或者所述菌剂在改良汞污染土壤中的应用。

在本发明中，所述改良重金属污染土壤优选的包括降低土壤中的汞含量和/或DTPA-Hg含量。

本发明还提供了上述方案所述假单胞菌或者所述菌剂在挥发除汞和/或钝化除汞中的应用。在本发明中，所述钝化除汞优选的包括吸附除汞和/或沉淀除汞。在本发明中，AN-15的汞去除性能以汞挥发为主，钝化作用为辅。在本发明中，所述AN-15去除的汞优选为Hg²⁺。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

抗汞菌的分离和纯化

采样地址位于云南省安宁市连然镇大屯的氯碱厂(26°53’53”N，102°27’54”E)，该氯碱厂早期采用水银烧碱法生产氯碱，产生大量的含汞盐泥，并堆存21于厂区渣场内，已于2011年停产，厂区主要重金属污染物为汞。

采集受汞污染的农田土壤上种植的植物根部及其根际土壤，带回实验室用稀释涂布平板培养法分离植物内生菌及根际细菌。28℃培养7天后，根据菌落形态分离不同菌株，多次划线纯化后获得单独菌落。

把不同菌株分别接种到经不同重金属处理的LB培养基中，重金属含量分别是20mg/L(Hg²⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺)和40mg/L(Hg²⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺)。培养三天后观察菌落生长状况，最终只有一株细菌AN-15可以含有Hg²⁺(40mg/L)的平板上生长，故而选择细菌AN-15进一步测定其对重金属汞的抗性能力。将初始Hg²⁺浓度为0、10、20、40、45、50、55、60和65mg/L的无菌LB培养基10mL，接种5％(v/v)的AN-15菌液(OD₆₀₀＝1)，培养48h后测600nm下的吸光度。AN-15的汞抗性曲线如图1，表明其有较高的汞耐受性，MIC值为54.49mg/L。

实施例2

细菌的鉴定

细菌利用16S通用引物27F(5'-agagtttgatcmtggctcag-3'，如SEQ ID NO.1所示)；1492R(5'-acggctaccttgttacga-3'，如SEQ ID NO.2所示)。进行PCR扩增得到目的DNA片段，测得1439bp的16S rDNA部分序列，如SEQ ID NO.3所示，具体如下：

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上述序列已提交NCBI数据库，编号：MW216911。将各菌株测定的DNA序列进行同源性比较，并将比较结果运用MEGA软件以Neighbor-Joining计算方式生成系统发育进化树。为了进一步确定分类地位，进一步测定菌株的基因组，其序列已提交NCBI数据库，编号：CP049737，应用Pyani software(https://github.com/widdowquinn/pyani)计算该菌株与相关细菌的平均核苷酸相似度(ANI)。对AN-15的16S rDNA序列进行同源性比较，结果显示菌株AN-15的16S rRNA序列与韩国假单胞菌(P.koreensis)的16S rRNA相似性达99％(图2)，确定为假单胞菌属细菌。通过与相近的韩国假单胞细菌的基因组比较，平均核苷酸相似度都小于93％，说明该菌不属于已发现的假单胞菌，故而命名为Pseudomonas sp.，AN-15，如表1。

实施例3

AN-15的汞去除效能测定

去除土壤环境中的汞，减少土壤汞含量，降低土壤中汞的植物有效性，减弱土壤毒性是修复汞污染土壤的主要机制，也是微生物修复汞污染土壤的主要途径。之前有关微生物修复汞污染土壤有微生物挥发和微生物吸附两种方式。因而我们设计摇瓶实验来探究AN-15的汞去除途径和效能。

通过对AN-15在5mg/L浓度下的汞去除性能进行测定。在5mg/L浓度下，12h内89.56％的Hg²⁺被去除，其中挥发占62.32％，吸附和沉淀占27.26％。48h后，93.37％的Hg²⁺从LB培养基中去除，说明AN-15具有较强的以汞挥发为主，钝化作用为辅的汞去除性能。如图3。

实施例4

AN-15对汞污染土壤的修复效能

通过添加内生菌到汞污染土壤中，静置三个月后，测定土壤总汞含量和DTPA-Hg含量，来验证AN-15对土壤汞的直接去除效能。

土壤汞污染图4表明了AN-15对汞污染土壤的修复效能，高浓度汞污染土壤(80mg/Kg)在静置三个月后，其总汞含量由初始的80mg/Kg减少为57.82mg/Kg，去除了27.73％。接种AN-15的土壤去除率达56.38％，剩余总汞含量为34.90mg/Kg，与非接菌处理相比显著减少。接菌处理比非接菌处理的DTPA-Hg含量显著降低了42.62％，其含量由1.24mg/Kg减少为0.71mg/Kg，说明AN-15可以有效修复汞污染土壤。

结合之前的结果表明，AN-15可以还原和钝化土壤中的Hg²⁺，降低土壤中的汞含量和(有效态汞)DTPA-Hg含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一株假单胞菌、包括假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acggctacct tgttacga 18

<210> 3

<211> 1439

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcagattga acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggatg agaggagctt 60

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cggtgaaatg cgtagatata ggaaggaaca ccagtggcga aggcgaccac ctggactgat 720

actgacactg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgtcaacta gccgttggga gccttgagct cttagtggcg cagctaacgc 840

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gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

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acaccatggg agtgggttgc accagaagta gctagtctaa ccttcgggag gacggtacc 1439

Claims

1.一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）AN-15，保藏编号为：CGMCC NO.18739。

2.一种包括权利要求1所述假单胞菌的菌剂。

3.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将所述假单胞菌接种于LB培养基，进行培养，得到菌剂。

4.权利要求1所述假单胞菌或者权利要求2所述菌剂或者权利要求3所述制备方法制备得到的菌剂在改良汞污染土壤中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述改良汞污染土壤包括降低土壤中的汞含量和/或有效态汞含量。

6.权利要求1所述假单胞菌或者权利要求2所述菌剂在挥发除汞和/或钝化除汞中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述汞为Hg²⁺。