CN102337229A

CN102337229A - 一种耐重金属细菌的分离及其在煤矸石复垦中的应用

Info

Publication number: CN102337229A
Application number: CN2010102370556A
Authority: CN
Inventors: 张玉秀; 柴团耀; 胡振琪; 宋小庆
Original assignee: China University of Mining and Technology Beijing CUMTB
Current assignee: China University of Mining and Technology CUMT; China University of Mining and Technology Beijing CUMTB
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明公开了一株从矿区煤矸石中筛选分离得到的耐重金属镉的铜绿假单胞细菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株ZGKD2，属假单胞菌属(Pseudomonadaceae)。利用菌落形态观察、常规生理生化指标和16S rDNA序列相似性分析对ZGKD2菌株进行了系统研究，其与已知铜绿假单胞菌16S rDNA序列同源性为99％，判断为铜绿假单胞菌的一种新菌株。ZGKD2能耐多种重金属复合污染，重金属吸附实验表明ZGKD2对Cd²⁺的吸附效率为76.7％-82.4％；ZGKD2能在添加煤矸石粉末的培养基中生长，并且可以提高培养基的pH值，表明ZGKD2可防止煤矸石山的酸化，从而降低环境中重金属的生物有效性。本发明为煤矸石山的复垦、重金属污染土壤的修复和开发生物修复菌剂提供材料和理论依据。

Description

一种耐重金属细菌的分离及其在煤矸石复垦中的应用

技术领域：

本发明涉及一种铜绿假单胞菌新菌株，可耐镉等多种重金属，特别涉及到煤矸石山的复垦和重金属污染环境的生物修复。

背景技术：

煤矸石是煤炭生产和加工中所排放的固体废弃物，煤矸石山经自然氧化和风吹雨淋作用，不断产生酸性废水，其中含有的微量有毒重金属元素如镉、铅、铬和汞等被溶解释放出来，并随降雨形成地表径流或渗入土壤，造成煤矿区周边的土壤、地表水或地下水等严重的酸性和重金属污染，矿区生态环境破坏，严重威胁当地居民的生活和健康。煤矸石淋滤模拟实验研究表明：内蒙古某矿区煤矸石淋滤液中Cd和Cr最高，其质量浓度超过了地面水类水质标准。煤矸石周围土壤的污染状况调查表明：广东大宝山矿区土壤中主要的重金属元素Cu、Zn、As和Cd的含量严重超过土壤环境质量二级标准；山东鲁西南某矿区煤矸石周围土壤中Pb污染较严重，并且土壤表层重金属含量与矸石堆距离呈非线性负相关关系。说明土壤对煤矸石山造成的重金属具有富集性和迁移性。重金属污染不仅降低土壤肥力，影响农作物产量，并且通过食物链进入动物和人体，危害人类的健康。因此，煤矸石山的复垦和矿区周边的土壤重金属污染治理对于矿区生态环境恢复和可持续发展具有重要的意义。

土壤微生物是土壤生态系统的重要生命体，不仅可以指示污染土壤的生态系统稳定性，而且还具有巨大的潜在环境修复功能。土壤细菌种类繁多、数量庞大，对土壤中动植物的残体和有机质及有害物质的分解、生物化学循环和土壤结构的形成起着重要的调节作用，不仅能够通过代谢活动促进重金属的溶解，提高重金属在土壤中的生物有效性，还可以吸附重金属等污染物。某些微生物也可以分泌吲哚乙酸、含铁细胞等促进植物的生长，提高植物修复土壤重金属污染的效率。土壤细菌在长期的重金属污染的环境中产生了由基因决定的重金属耐性系统，利用转基因技术提高重金属耐性基因拷贝数、增强操纵子调控基因的表达、或者协同表达已有的耐性基因，可以进一步提高转基因生物对重金属的适应能力和土壤修复能力。

微生物可通过表面络合、离子交换、氧化还原及酶促等作用吸附重金属，近二十年来，微生物修复技术成为土壤重金属污染修复研究的热点之一。土著微生物的适应能力大于外来微生物，因此，从受重金属污染土壤中分离筛选耐重金属的高效吸附效能的微生物是可行的。Breierova等从镉污染的土壤中分离出耐镉的欧文氏菌(Erwinia)，在含200mg/L Cd的培养基中其每g干菌体能吸收14.3mg Cd；Monhn等把耐寒微生物混合菌种接种到北极冻原油滴污染土壤中，一年后土壤中油浓度减少了一半。耐Cd菌株苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)能在281mg/L Cd²⁺的ESB培养基中生长；从废水中分离的大肠杆菌(E.coli ASU7)最大耐Cd浓度为4.4mmol/L；从污泥中分离得到荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens能在50mg/L Cd²⁺培养基中生长；从重金属污染的稻田土壤中分离的伯克霍德菌属(Burkholderia sp.)，在含2000mg/L Cd²⁺的固体培养基中生长良好；已报道铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)能耐40mg/L Cr⁶⁺；将耐镉铜剂J5添加到安徽铜陵镉铜污染尾矿土壤中，可提高尾矿土中土著微生物的活性和群落丰富度。淮南谢家集煤矿区煤矸石中Cd、Cu、Zn、Ni、Sn和Hg含量均大于土壤背景值，尤其是Cd的含量严重超标，分离筛选耐重金属的细菌，并研究其生物特性及其在煤矸石山修复中的作用，可为微生物治理重金属污染提供优质的资源，为煤矸石山复垦和绿化提供科学依据和技术支持。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种可耐重金属Cd的铜绿假单胞菌新菌株，该菌株具有多种重金属耐性，可用于重金属复合污染土壤环境的生物修复和煤矸石山的复垦绿化。

本发明人从淮南谢家集煤矿区随机取12个样点混合组成代表样，经过富集驯化及筛选，得到一重金属镉耐性菌株，经鉴定该菌株16S rDNA序列与已知铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)16S rDNA序列同源性为99％，命名为ZGKD2。该菌株可用于重金属污染环境的生物修复和煤矸石山的复垦。

本发明中，富集驯化、筛选和分离该菌株的过程为：将5g矸石样装入45ml液体牛肉膏蛋白胨培养基中富集培养，30℃，200rpm培养24h；取2ml富集培养液于含Cd²⁺浓度为100mg/L的新鲜液体培养基中，同样条件培养，观察富集瓶是否混浊，若混浊，取1ml富集培养液于含Cd²⁺浓度为200mg/L的新鲜液体培养基中培养；依次类推，逐级提高重金属离子的浓度，在300～1000mg/L Cd²⁺的条件下进行多次富集培养；取0.2ml 1000mg/L条件下的富集培养液连续涂布在含Cd²⁺浓度为1000～1400mg/L的固体平板上，倒置于恒温培养箱中，30℃下培养72h～120h，分离出耐高浓度Cd的细菌菌株。

所述液体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，具体配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水1000ml，pH 7.2～7.4。调节pH值所用的NaOH浓度为3mol/L，HCl浓度为1mol/L。重金属筛选培养基是在此培养基中加入不同浓度的重金属盐。

附图说明：

图1：ZGKD2菌株的菌落形态图；

图2：根据16S rDNA部分序列构建的ZGKD2菌株的系统发育分析树；

图3：ZGKD2在Cd培养液中的生长曲线(图例中1，2，3，4，5分别表示含Cd²⁺浓度为0、400、800、1000和1200mg/L)；

图4：ZGKD2在不同浓度Cd²⁺培养基中的吸附效率；

图5：ZGKD2在不同浓度Cd²⁺培养基中的吸附量和干菌体量；

图6：ZGKD2对其他重金属的耐性。

图7：煤矸石对ZGKD2生长的影响

具体实施方式

1.微生物和煤矸石样品采集

淮南谢家集煤矿区随机取12个样点混合组成代表样，样品装入无菌封口塑料袋内，带回实验室进行富集筛选。

2.培养和分离鉴定所需培养基配方

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水1000ml，pH7.2～7.4。调节pH值所用的NaOH浓度为3mol/L，HCl浓度为1mol/L。重金属筛选培养基是在此培养基中加入不同浓度的重金属盐。

3.耐镉菌株的筛选、分离和鉴定

3.1耐镉菌株的富集驯化及筛选

将5g矸石样装入45ml液体牛肉膏蛋白胨培养基中富集培养，30℃，200rpm培养24h，取2ml富集培养液于含Cd²⁺浓度为100mg/L的新鲜液体培养基中，同样条件培养，观察富集瓶是否混浊，若混浊，取1ml富集培养液于含Cd²⁺浓度为200mg/L的新鲜液体培养基中培养；依次类推，逐级提高重金属离子的浓度，在300～1000mg/L的条件下进行多次富集培养，取0.2ml 1000mg/L条件下的富集培养液连续涂布在含Cd²⁺浓度为1000～1400mg/L的固体平板上，倒置于恒温培养箱中，30℃下培养72h～120h，筛选出耐高浓度Cd的菌株。

3.2菌株的鉴定

菌株的形态和生理生化特征鉴定参见《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》和《微生物分类学》。

菌株的16S rDNA序列比对鉴定：采用CTAB法提取细菌基因组。使用16S rDNA通用引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(正向引物f27)和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(反向引物r1492)进行DNA扩增(PCR)。50μL的PCR反应体系：10X PCR缓冲液(含Mg²⁺)5μL，10mmol/L dNTP mix 0.25μL，引物(45pmol/μL)0.5μL，DNA模板1μL，灭菌去离子水42.25μL和DNA聚合酶Taq(2.5U/μL)0.5μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸90s，40个循环，72℃最终延伸5min。PCR产物直接送公司处理。所测序列使用NCBI BLAST(http://www.ncbi.Nlm.Nih.gov/BLAST)比对分析，并使用ClustalW进行多序列比对绘制进化树。

3.3不同Cd²⁺浓度对菌株生长的影响

将对数生长期的菌株以5％的接种量分别接种到含不同浓度Cd²⁺的液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养7天，用分光光度计比色法和pH计测定每天菌体悬浮液的OD₆₀₀值和pH。

3.6菌株对Cd²⁺的吸附试验

菌株对Cd²⁺的吸附试验是在最佳温度、pH和NaCl浓度的条件下进行的。将培养至对数生长期的菌株以5％的接种量接种至含有不同Cd²⁺浓度的10mL细菌培养基中，37℃，200rpm振荡培养20h，冷冻离心(10000rpm，4min)，上清液用ICP-AES法测定Cd²⁺的浓度，菌体沉淀物干燥后称菌体干重。按下面公式计算吸附率A和吸附量q：

A＝(C₀-ce)/C₀×100％

q＝(C₀-Ce)×V/W

式中C₀、Ce分别为重金属离子起始和平衡浓度(mg/L)；V为溶液体积(L)；W细胞干重(g)。

3.7其他重金属对菌株生长的影响

将对数生长期的菌株以5％的接种量分别接种到含不同浓度重金属Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和pb²⁺溶液的液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养20h，用分光光度计比色法测定菌体悬浮液的OD₆₀₀值。

3.8复合重金属对菌株生长的影响

按照L₁₆(4⁵)正交试验设计配制含不同重金属浓度(Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Cd²⁺)的培养液，将对数生长期的菌株以5％的接种量接种于复合重金属液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养20h，分光光度计比色法测定菌体悬浮液的OD₆₀₀值。

3.9不同浓度煤矸石对ZGKD2生长的影响

将对数生长期的菌株以5％的接种量接种到含不同0-250g/L矸石质量的液体培养基中，分别以不加菌液为对照，37℃，200rpm振荡培养20h，分光光度计比色法测定菌体悬浮液的OD₆₀₀值和pH。

4.ZGKD2菌株的鉴定结果

4.1形态特征及生理生化特征鉴定

风化矸石粉末样品经浓度梯度驯化培养，筛选分离获得一株在液体培养基中耐1000mg/L Cd²⁺的菌株ZGKD2。在固体培养基上划线分离单菌落，37℃培养18h后形成1～3mm的黄棕色菌落，边缘整齐，湿润，中间凸起，菌落形态见图1。革兰氏染色后，镜检观察到菌株ZGKD2为革兰氏阴性细菌，形状为杆状。菌株ZGKD2的生理生化特征见表1。

表1 ZGKD2的生理生化特征

4.216S rDNA分子鉴定结果

为了更加精确的鉴定ZGKD2，以ZGKD2的总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1500kb的扩增产物。序列的测定由北京华大基因完成。最后将测定的序列在NCBI数据库中进行BLAST分析。比对结果显示ZGKD2的16S rDNA序列与铜绿假单胞菌(Pseudomnoas aeruginoas)同源性为99％，系统进化树见图2。

4.3Cd²⁺对ZGKD2生长的影响

ZGKD2在不含Cd的培养液中生长7d，OD₆₀₀表现为先升高后下降再升高(图3)，可能原因是当培养基中的营养成分还没有消耗完前，在前一代菌体细胞衰亡的同时，新一代菌体开始生长，并且活菌体的生物量大于衰亡菌体，致使OD₆₀₀值上升。在400mg/L和800mg/L的Cd²⁺浓度的培养液中，ZGKD2生长曲线相似，延滞期较长，培养3d后进入指数期，第5天时培养液的OD₆₀₀值达到峰值，分别是2.56、2.292，之后开始下降，ZGKD2进入衰亡期。与对照相比，在400mg/L和800mg/L Cd²⁺培养液中，ZGKD2达到最大值的培养时间滞后了三天，并且峰值分别是对照最大值的1.2和1.1倍。ZGKD2在Cd²⁺浓度为1000mg/L时，OD₆₀₀值在第4d开始升高，6-7d时达到最大，但远低于0mg/L、400mg/L和800mg/L时的峰值；在1200mg/L Cd²⁺时，ZGKD2几乎没有生长的趋势，说明ZGKD2最大能耐1000mg/L Cd²⁺。

4.4ZGKD2对Cd²⁺的吸附

ZGKD2在不同浓度的Cd培养基中培养20h，结果表明随着Cd浓度(100-800mg/L Cd²⁺)的增加，ZGKD2增殖细胞的吸附效率逐渐减小(图4)，如ZGKD2在100mg/L Cd²⁺时的吸附效率为82.4％；800mg/L Cd²⁺时的吸附效率是76％。ZGKD2增殖细胞的干菌体量随着Cd浓度的增加逐渐减少，而增殖细胞对Cd的吸附量表现为先增加后减小(图5)，在400mg/L Cd²⁺时，Cd的吸附量达到最大值(1.76mg/g干菌体)。说明在400mg/L Cd²⁺时，所有ZGKD2增殖细胞的Cd吸附量达到最大值，当Cd²⁺＞400mg/L时，增殖细胞的干菌体量降低，活力降低，最终导致吸附量随之降低。

4.5ZGKD2菌株对其他重金属的耐性

ZGKD2在不同浓度重金属(Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Pb²⁺)液体培养基中培养20h，结果表明随着重金属浓度的增大，ZGKD2的OD₆₀₀值减小，然而，不同重金属对菌株的抑制效果不同(图6)。ZGKD2的OD₆₀₀值分别在0～0.5mmol/L Cu²⁺或Zn²⁺时骤减，之后随着浓度的增加，OD₆₀₀值缓慢减小，3.5mmol/L Zn²⁺时几乎不能生长，4mmol/L Cu²⁺时几乎不能生长；OD₆₀₀值在0～1mmol/L Pb²⁺时几乎呈直线下降，之后随着浓度的增加，OD₆₀₀值缓慢减小，2mmol/L Pb²⁺时几乎不能生长；随着Ni²⁺浓度的增加，OD₆₀₀值几乎呈直线下降，2.5mmol/LNi²⁺时几乎不能生长；OD₆₀₀值随着Mn²⁺和Cd²⁺浓度的增加而缓慢减小，4.0mmol/L Mn²⁺时几乎不能生长。说明单一重金属Cd²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺和Pb²⁺对ZGKD2菌株的最小抑制浓度大小依次为：8.9mmol/L，4mmol/L，4mmol/L，3.5mmol/L，2.5mmol/L和2mmol/L)，表明该菌株对多种重金属均有一定的耐性。

ZGKD2是否具有耐复合重金属污染的能力？为此，设计了正交试验[L₁₆(4⁵)](表2)，测定ZGKD2在复合重金属液体培养基中生长20h时的OD₆₀₀值。根据极差(R)的大小分析得出不同重金属对ZGKD2生长抑制作用大小依次为：Ni²⁺＞Cu²⁺＞Zn²⁺＞Mn²⁺＞Cd²⁺(表3)；方差分析(表4)表明Ni²⁺(F＝361.005，Sig.＝0.000)，Cu²⁺(F＝63.941，Sig.＝0.000)，Zn²⁺(F＝33.073，Sig.＝0.000)和Mn²⁺(F＝7.703，Sig.＝0.000)对ZGKD2生长有显著的抑制作用，而Cd²⁺(F＝1.386，Sig.＝0.265＞0.05)对ZGKD2生长没有明星影响。直观分析(表3)表明在浓度2mmol/L Zn²⁺、2mmol/L Mn²⁺、0.2mmol/L Cu²⁺、0.5mmol/L Ni²⁺和1mmol/L Cd²⁺等的复合重金属组合对ZGKD2生长的抑制作用小于其他组合。表明Cd耐性菌株对复合重金属具有一定的耐性。

表2 正交试验方案及ZGKD2的OD₆₀₀值

表3正交试验的直观分析

表4正交试验的方差分析

a.R²＝0.978(校正后的R²＝0.967)

4.7不同浓度煤矸石对ZGKD2生长的影响

ZGKD2在不同浓度的煤矸石中培养20h，结果表明随着煤矸石浓度0-250g/L的增加，ZGKD2的生长(OD₆₀₀值)呈递增趋势，培养基的pH值随ZGKD2的生长缓慢减小，但总是高于未加菌的矸石对照(图7)，表明煤矸石不仅没有抑制ZGKD2的生长，反而促进其生长；同时，ZGKD2的生长引起培养基中的pH值升高，表明ZGKD2可以阻止煤矸石山的酸化淋溶作用，具有用于煤矸石山的微生物修复和复垦绿化。

Claims

1.一株铜绿假单胞菌菌株，其特征在于，该菌株属于假单胞菌属，命名为ZGKD2；

2.如权利要求书1所述的铜绿假单胞菌新菌株ZGKD2，该菌株的形态及生理生化特征：

a.在固体培养基上划线分离单菌落，37℃培养18h后形成1～3mm的黄棕色菌落，边缘整齐，湿润，中间凸起。革兰氏染色后，镜检观察到菌株为革兰氏阴性细菌，形状为杆状。

b.细胞色素氧化酶试验阳性；过氧化氢酶试验阳性；硝酸盐还原试验阳性，产氮气；吲哚试验阴性；V.P.试验阴性；精氨酸双水解酶试验阳性；柠檬酸盐试验阳性；淀粉水解试验阴性；明胶液化试验阳性；糖发酵试验中对葡萄糖和木糖阳性，对乳糖阴性。

3.如权利要求书1所述的铜绿假单胞菌新菌株ZGKD2，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求书1所述的铜绿假单胞菌新菌株ZGKD2应用于煤矿区煤矸石山的复垦和重金属污染环境的生物修复。