CN106011046A

CN106011046A - 一种亚硒酸钠还原细菌的培养驯化方法

Info

Publication number: CN106011046A
Application number: CN201610618604.1A
Authority: CN
Inventors: 袁志辉; 周海燕; 雍婕; 程益; 肖红仕; 吴永尧
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan University of Science and Engineering
Priority date: 2016-07-30
Filing date: 2016-07-30
Publication date: 2016-10-12

Abstract

一种亚硒酸钠还原细菌的培养驯化方法。本发明公开了一种亚硒酸钠还原细菌的培养驯化方法，包括：筛选亚硒酸钠还原细菌；利用培养基通过两步法培养，第一步，以5%的接种量接种，在其中逐步逐量添加重金属盐，20‑25℃培养，培养3天，至OD₆₀₀≥2；第二步，按1%的量补充新鲜培养基，在培养体系中逐步逐量添加抗生素，20‑25℃继续培养3天，得到具有双重广谱抗性的亚硒酸钠还原细菌。驯化菌株能使硒污染土壤中的亚硒酸盐含量从86.21 mg/kg降低至5.1 mg/kg，能使含硒废水中的硒含量从305 μg/L降低至85 μg/L，并能在这两种硒污染环境中稳定存活。本发明能有效驯化亚硒酸钠还原细菌，增强菌株的环境适应能力和存活能力，解决了硒污染环境生物修复过程中菌株适应力和生活力不强的问题。

Description

一种亚硒酸钠还原细菌的培养驯化方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别是提供了一种亚硒酸钠还原细菌的培养驯化方法。

背景技术

我国有些地区如湖北恩施和陕西安康则属于高硒地区，其土壤中硒含量严重超标而导致硒中毒如脱毛、贫血等情况的发生。目前土壤硒污染治理的主要方式是植物修复，但植物生长周期长，收获植物难以处理等缺陷。近年来研究发现，许多微生物能够将土壤中毒性最强的亚硒酸钠和硒酸钠还原为毒性较低的单质纳米硒，成为植物不易吸收的状态，降低植物的含硒量，是进行硒污染土壤修复的环境友好、成本低廉的方法。另外，在工业生产如纯硒的制备、铝电解着色工艺、静电复印机用的硒鼓感光元件生产和旧鼓脱膜复镀等过程中，都会产生大量含硒废水。为了消除硒污染，回收硒资源，工业上一般采用离子交换法达到含硒废水处理的目的。这种方法耗时费力，成本也较高。而采用微生物还原氧化态硒和进行含硒废水治理，方式和设备要求较低，成本低廉，产生的单质硒通常处于胞内或附着于细胞表面，易于回收处理。

利用微生物进行硒污染环境治理的过程中，存在一个突出的问题就是硒污染环境的条件十分复杂，常常含有多种重金属离子和多种抗生素，而所采用的微生物对这些重金属和抗生素不具备抗性，从而降低了其环境适应能力，使得所采用的微生物在环境中生活力下降甚至完全不能存活，最终导致硒污染环境的微生物修复效率下降，甚至完全不能进行修复。目前市场上和文献中尚没有克服此类难题的实用技术的公开报道。因此，如在筛选出亚硒酸钠还原菌株的基础上开发出一种培养驯化方法，提高功能菌种在复杂环境中的稳定性、存活率和除硒能力，则能有效解决修复菌种环境适应力差的问题，有效发挥微生物除硒优势和解决硒污染环境微生物修复效率低下的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种亚硒酸钠还原细菌的培养驯化方法，该方法培养驯化的亚硒酸钠还原菌株使用时环境适应能力强，能有效去除硒污染复杂环境中的亚硒酸盐。

本发明提供的一种亚硒酸钠还原细菌的培养驯化方法，包括：

筛选亚硒酸钠还原细菌；

利用培养基通过两步法培养，第一步，以5%的接种量接种亚硒酸钠还原细菌，在其中逐步逐量添加重金属盐，20-25℃培养，培养3天，至OD600≥2；第二步，按1%的量补充新鲜培养基，在培养体系中逐步逐量添加抗生素，20-25℃继续培养3天，得到具有双重广谱抗性的亚硒酸钠还原细菌。检测结果表明，驯化培养后的菌株对多种重金属和抗生素均有较强的耐受性和抗性。

在两步法中逐步逐量加入的重金属盐离子为Ag²⁺ 、Cd²⁺ 、Ni²⁺ 、Cu²⁺ 、Fe³⁺ 、Pb²⁺ 、Co²⁺ 、Mn²⁺ 、Zn²⁺；逐步逐量加入的抗生素为四环素、氨苄青霉素、红霉素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、壮观霉素。逐步逐量加入的方法为：重金属盐每次加入一种，每次加入的量为0.1-10 mmol/L，直至培养基中含有全部上述9种重金属离子；抗生素每次加入一种，每次加入的量为1-2000 μg/mL，直至培养基中含有全部上述7种抗生素。

亚硒酸钠还原细菌的筛选方法：

以含0.2 mM Na₂SeO₃的LB平板为分离培养基，将采集的土壤样品稀释成10^-1至10^-8悬液，取适宜稀释度涂布在分离平板上，25℃培养1-15d。挑选能够还原Na₂SeO₃产生红色单质硒的细菌（初步判断依据为红色菌落）作为下一步研究的目标菌。将初筛获得的细菌重新接种至含与不含Na₂SeO₃的LB平板上进一步确定是否具有还原Na₂SeO₃产生红色单质硒的能力，记录形态并保藏。在0-100 Mm Na₂SeO₃浓度梯度的LB平板上进行耐硒能力测定，挑选耐硒能力最强的菌株作为后续研究的目标菌株。在含2 mM Na₂SeO₃的LB培养液中进行Na₂SeO₃还原能力测定及复筛，经过比较得到还原能力强的菌株。

所获菌株为革兰氏阴性菌，在显微镜呈杆状，大小为0.5 μm×1 μm。在LB 培养基上生长良好，12 h形成淡黄色、圆形、光滑、隆起、边缘整齐、直径约为2-3 mm的菌落，为严格好氧菌。

本发明在筛选出亚硒酸钠还原菌株的基础上，采用两步法对其进行驯化培养，得到对多种重金属和抗生素均有较强的耐受性和抗性的菌株。经在硒污染土壤和含硒废水中的试验表明，3天内，驯化菌株能使土壤中亚硒酸盐含量从86.21 mg/kg降低至5.1 mg/kg；3天内，驯化菌株能使含硒废水中的硒含量从305 μg/L降低至85 μg/L。两种硒污染环境样品经过驯化菌株处理后，均符合国家标准。此外，驯化菌株加入到高硒土壤中24 h后的细菌细胞数量为1.2×10⁶个/g土壤，远远大于驯化培养前的1.1×10³个/g土壤；驯化菌株加入到含硒废水中24 h后的细菌细胞数量为1.5×10⁵个/mL废水，远远大于驯化培养前的1.2×10²个/mL废水。本发明具有操作简单，效率高等特点，解决了修复菌种环境适应力差、存活率低和硒污染环境微生物修复效率低下的问题，

具体实施方式

实施例1：

亚硒酸钠还原细菌的筛选：

经测定，筛选出的该菌株没有重金属耐受性和抗生素抗性。

实施例2：

筛选的出发菌株的驯化培养：

利用培养基通过两步法驯化培养出发菌株，第一步，以5%的接种量接种，在其中逐步逐量添加重金属盐，20-25℃培养，培养3天，至OD600≥2；第二步，按1%的量补充新鲜培养基，在培养体系中逐步逐量添加抗生素，20-25℃继续培养3天，得到具有双重广谱抗性的亚硒酸钠还原细菌。

实施例3：

驯化培养后菌株的重金属耐受性和抗生素抗性检测：

检测驯化培养后的Stenotrophomonas sp. EGS12的重金属耐受性和抗生素抗性：将Stenotrophomonas sp. EGS12菌株用点接法接种于含有不同浓度不同重金属和不同浓度不同抗生素的LB琼脂平板上，观察其生长状态，菌株不生长的浓度为该菌对该重金属和抗生素的MIC。检测结果表明，Stenotrophomonas sp. EGS12对多种重金属和抗生素均有较强的耐受性和抗性。

Stenotrophomonas sp. EGS12的重金属和抗生素抗性

测试项目	耐受浓度 (mmol/L)	测试项目	耐受浓度 (μg/mL)
				Ag²⁺	0.1	四环素	50
Cd²⁺	0.1	氨苄青霉素	＞2000
				Hg²⁺	-	红霉素	400
Ni²⁺	3	氯霉素	300
				Cu²⁺	3	卡那霉素	100
Fe³⁺	＞5	庆大霉素	＞100
				Pb²⁺	＞5	壮观霉素	＞100
Co²⁺	0.3
				Mn²⁺	＞10
Zn²⁺	5

应用实例一：

利用驯化培养后的菌株修复硒污染土壤，检测其存活数量和修复效率：

A. 制备LB平板，划线活化驯化培养后的菌株，在37℃下培养24 h；

B. 种子液制备，将在活化平板上生长的单菌落接种于LB液体培养基中，在37℃下培养24 h作为种子培养液；

C. 将制备好的种子液按3%的接种量接种于LB液体培养基中，37℃、120 rpm培养48h；

D. 采用国标GB 15618-1995检测土壤样品中重金属种类和含量，采用孙奉翠等（2013）的加速溶剂萃取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(ASE-SPE-HPLC-MS/MS)分析方法检测土壤样品中抗生素的种类和含量。检测后表明，采集自湖北省恩施自治州鱼塘坝的高硒土壤中的Cd²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺和Co²⁺超过国家标准，四环素、氨苄青霉素、庆大霉素含量均大于50 μg/kg；

E. 取培养好的菌悬液采用喷壶对硒污染土壤进行喷淋，按一定的速度将菌悬液均匀的喷淋到土壤中。土壤中所有+4价硒大部分能被驯化菌株还原，试验中采用的土壤为采集自湖北省恩施自治州鱼塘坝的高硒土壤，+4价硒含量为86.21 mg/kg，土壤干燥粉碎后过20目筛，装进一个长5 m，宽2 m，高1.5 m的木质槽中，采用喷淋法对槽中土壤喷淋制备好的菌悬液（约6.5×10¹⁰cfu/L），恒温25℃，喷淋速度为50 mL/min，每天早晚各喷淋1次，每次20 mL，3 d后土壤+4价硒含量降低到5.1 mg/kg；

F. 采用荧光显微镜计数法检测驯化菌株加入到高硒土壤中24 h后的细菌细胞的数量为1.2×10⁶个/g土壤，远远大于驯化培养前的1.1×10³个/g土壤。

应用实例二：

利用驯化培养后的菌株治理含硒废水，检测其存活数量和修复效率：

A. 制备LB平板，划线活化驯化培养后的菌种纯培养物，在37℃下培养24 h；

D. 采用国标GB 15618-1995检测含硒废水样品中重金属种类和含量，采用孙奉翠等（2013）的加速溶剂萃取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(ASE-SPE-HPLC-MS/MS)分析方法检测土壤样品中抗生素的种类和含量。检测后表明，采集自石化企业炼厂电脱盐单元废水中的Ag²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、Co²⁺、和Mn²⁺均超过国家标准，不含抗生素；

E. 将菌悬液以8%的比例加入到含硒废水中，恒温振荡培养。含硒废水中所有+4价硒均能被还原，试验中采用的含硒废水采集自石化企业炼厂电脱盐单元废水，含硒量约为305 μg/L。将采集到的含硒废水装入恒温水浴振荡器中，按8%的比例加入培养好驯化菌株菌悬液，30 ℃恒温振荡培养，3 d后废水中硒含量降低至85 μg/L，到达国家排放标准100 μg/L；

F．取加入驯化菌株 24 h后的含硒废水，采用荧光显微镜计数法检测驯化菌株细菌细胞的数量为1.5×10⁵个/mL废水，远远大于驯化培养前的1.2×10²个/mL废水。

Claims

1.一种亚硒酸钠还原细菌的培养驯化方法，包括：

筛选亚硒酸钠还原细菌；

利用培养基通过两步法培养，第一步，以5%的接种量接种，在其中逐步逐量添加重金属盐，20-25℃培养，培养3天，至OD₆₀₀≥2；第二步，按1%的量补充新鲜培养基，在培养体系中逐步逐量添加抗生素，20-25℃继续培养3天，得到具有双重广谱抗性的亚硒酸钠还原细菌。

2.根据权利要求1所述的一种亚硒酸钠还原细菌的培养驯化方法，其特征在于，以含0.2 mM Na₂SeO₃的LB平板为分离培养基，将采集的土壤样品稀释成10^-1至10^-8悬液，取适宜稀释度涂布在分离平板上，25℃培养1-15d；挑选能够还原Na₂SeO₃产生红色单质硒的细菌（初步判断依据为红色菌落）作为下一步研究的目标菌；将初筛获得的细菌重新接种至含与不含Na₂SeO₃的LB平板上进一步确定是否具有还原Na₂SeO₃产生红色单质硒的能力，记录形态并保藏；在0-100 Mm Na₂SeO₃浓度梯度的LB平板上进行耐硒能力测定，挑选耐硒能力最强的菌株作为后续研究的目标菌株；在含2 mM Na₂SeO₃的LB培养液中进行Na₂SeO₃还原能力测定及复筛，经过比较得到还原能力强的菌株。

3.根据权利要求1所述的添加重金属盐离子为Ag²⁺ 、Cd²⁺ 、Ni²⁺ 、Cu²⁺ 、Fe³⁺ 、Pb²⁺ 、Co²⁺ 、Mn²⁺ 、Zn²⁺。

4.根据权利要求1所述的添加抗生素为四环素、氨苄青霉素、红霉素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、壮观霉素。

5.根据权利要求1所述的逐步逐量加入的方法为：重金属盐每次加入一种，每次加入的量为0.1-10 mmol/L，直至培养基中含有全部上述9种重金属离子；抗生素每次加入一种，每次加入的量为1-2000 μg/mL，直至培养基中含有全部上述7种抗生素。