CN110684688B - 一株希瓦氏菌st2及其在偶氮染料降解中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株希瓦氏菌ST2，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2019770，可用于偶氮染料活性黑5、直接蓝2B、刚果红、甲基橙、活性绿19、酸性橙7的降解。本发明的希瓦氏菌ST2可对不同结构的偶氮染料进行高效降解，并能耐受高浓度的染料，且能适应相较广泛的环境因子变化范围；为偶氮染料的生物降解提高可能的菌株来源，为印染废水的工业化处理提供发展潜能，也为染料排放后的自我降解和修复提供了研究依据。

Description

一株希瓦氏菌ST2及其在偶氮染料降解中的应用
技术领域
本发明涉及希瓦氏菌，尤其涉及一株希瓦氏菌ST2及其在偶氮染料降解中的应用。
背景技术
在流域常见的污染物中，合成染料是常见的污染物之一。根据染料发色基团的化学结构，可以将染料分为8大类，分别为偶氮染料、蒽醌染料、三苯甲烷染料、靛族染料、杂环染料、菁系染料、硫化染料以及酞菁染料，其中，偶氮类染料是最常用的一大类染料，约占全部染料的50％-70％。染料废水是较难处理的工业废水之一，具有色度深、碱性大、有机污染物含量高和水质变化大的特点。大部分染料结构极其稳定，进入环境水域后难以自然降解，造成受污染水域色度增加，导致入射光线量大大减少，影响水生动植物的正常生命活动，破坏水体生态平衡。更为严重的是，大多数染料为有毒、难降解的有机物，化学稳定性强，具有致癌、致畸、致突变作用，排放到环境中对人类和其他生物的健康构成极大的威胁。
用于印染废水的处理方法，主要有物理法、化学法和生物法。物理法包括吸附法、膜分离法和磁分离法等，化学法包括电化学法和氧化法等。这两类方法成本高，处理效果较差，且受到许多条件的限制。相比之下，利用生物法降解染料，是十分经济，高效和环保的，因此，国内外仍然以生物法处理废水为主，且很多单一的物理化学法联合了生物法，大大提高印染废水的脱色效果。目前，生物法使用的微生物，主要是细菌、丝状真菌、酵母菌和藻类等。这些微生物中，丝状真菌生长周期长；酵母菌对染料的脱色方式主要为吸附，若处理不当，会对环境造成二次污染；藻类需要进行光合作用，且藻体对染料的吸附会产生二次污染。而由于细菌的种类最繁多，繁殖周期短，降解效率高，在染料废水的处理中发挥极为重要的作用。因产品类型及生产工艺流程的不同，印染废水环境复杂多变，包括污染物的成分与含量、pH、温度、有氧/无氧、盐度和金属离子等，都可能影响细菌降解染料的能力。此外，不同微生物对同一种染料的最佳降解条件不同，同一种微生物对不同种染料的最佳降解条件也有所差异。由于河口及近岸生态系统理化环境复杂多变，且沉积物汇集大量的污染物，生存于其中的细菌长期受到环境及各种污染物的胁迫，可能逐渐形成相应的响应机制来适应压力。因此，从河口及近岸海洋沉积物中，寻找可高效降解偶氮染料的功能菌株，以应用于印染废水的处理。
发明内容
本发明的目的在于提供一株希瓦氏菌ST2及其在偶氮染料降解中的应用，本发明以8种偶氮染料为底物，从河口沉积物中筛选可高效降解染料的菌株希瓦氏菌ST2，并对其降解特性进行研究，为偶氮染料的生物降解提高可能的菌株来源，为印染废水的工业化处理提供发展潜能，也为染料排放后的自我降解和修复提供了研究依据。
一株希瓦氏菌ST2(Shewanella indica strain ST2)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉大学，保藏日期为2019年9月30日，其保藏编号为CCTCC M2019770。
上述希瓦氏菌ST2的培养方法，培养基的组成为：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl10.0g、去离子水1.0L、pH＝7.4。
优选的，培养条件为：温度设35℃、pH值为6，NaCl的浓度为10g/L。
上述希瓦氏菌ST2的应用，用于偶氮染料的降解。
优选的，所述偶氮染料包括活性黑5、直接蓝2B、刚果红、甲基橙、活性绿19、酸性橙7。
与现有技术相比，本发明的希瓦氏菌ST2可对不同结构的偶氮染料进行高效降解，并能耐受高浓度的染料，且能适应相较广泛的环境因子变化范围；为偶氮染料的生物降解提高可能的菌株来源，为印染废水的工业化处理提供发展潜能，也为染料排放后的自我降解和修复提供了研究依据。
附图说明
图1是本发明的菌株筛选采样站点分布图；
图2是本发明的希瓦氏菌ST2菌株形态电镜图；
图3是本发明的希瓦氏菌ST2的系统进化树；
图4是本发明的希瓦氏菌ST2对8种偶氮染料的脱色效果图；
图5是染料初始浓度对本发明的希瓦氏菌ST2的染料脱色率的影响；
图6是温度对本发明的希瓦氏菌ST2的生长与脱色的影响；
图7是pH对本发明的希瓦氏菌ST2的生长与脱色的影响；
图8是盐度对本发明的希瓦氏菌ST2的脱色率的影响；
图9是金属离子对本发明的希瓦氏菌ST2的脱色率的影响；
图10是本发明的希瓦氏菌ST2对直接蓝2B的降解途径。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
希瓦氏菌ST2(Shewanella indica strain ST2)的筛选和培养方法：
(1)筛选和培养所用的的培养基
2216E液体培养基：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g、NaCl19.45g、柠檬酸铁0.1g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶0.034g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、硝酸钠0.0016g、磷酸氢二钠0.008g、去离子水1.0L，pH7.4；
2216E固体培养基：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g、NaCl19.45g、柠檬酸铁0.1g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶0.034g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、硝酸钠0.0016g、磷酸氢二钠0.008g、20.0g琼脂、去离子水1.0L，pH7.4；
LB液体培养基(筛选、分离、富集与脱色用，g.L-1):蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl10.0g、去离子水1.0L、pH＝7.4；
LB固体培养基：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl10.0g、20.0g琼脂、去离子水1.0L、pH＝7.4。
(2)偶氮染料脱色菌筛选分离过程
按照图1的菌株筛选采样站点标注所示，每个点取约5g近岸沉积物样品于无菌离心管中，加入20ml无菌水，充分震荡，使无菌水与沉积物样品充分混合，将震荡后的悬浊液静置，使颗粒物沉淀，取1ml上清悬液于装有25ml 2216E液体培养基(含20mg/L偶氮染料)的50ml试管中，用灭菌封口膜封口(所有操作于超净工作台中完成)，于30℃的恒温培养箱中培养24h。
选取脱色明显的实验管，将10ml培养液转接于新的含染料的2216E培养基中培养，如此反复3-5次，染料浓度逐步提高致100mg/L，驯化培养结束。取反应液梯度稀释后，均匀涂布于含有染料的2216E固体培养基上，30℃恒温培养，待菌落长出后，挑取其中有无色透明圈的单菌落，用接种环挑取至2216E液体培养基中培养。于不同时间段测其脱色率，选取脱色率大于85％的菌株在LB固体培养基上划线，挑单菌落，进行多次纯化。获得单菌株后加20％(v:v)甘油，于-86℃冰箱保存备用。
(3)、环境条件影响实验脱色菌培养方法和条件
接种脱色菌株种子液于5mL含有100mg/L染料的LB液体培养基中，分别放置在不同的环境条件下，静置培养6或12h，测定脱色率与OD600值。温度梯度分别设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃。pH值梯度设置为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，用盐酸和氢氧化钠调节培养基初始pH值。盐度影响实验则是往培养基中添加NaCl，浓度梯度设置为0g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L和110g/L。染料初始浓度梯度设置为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L。金属离子的影响实验，则是在含染料的LB培养基中分别加入Mn2+、Pb2+、Fe3+、Ca2+、Ba2+、Ag+、Cd2+、Ni+、Zn2+、Cu2+、Mg2+和Co2+，调节各离子浓度为1mmol/L。
最终成功分离出一株对多种偶氮染料具有较高脱色率的菌株，命名为希瓦氏菌ST2(Shewanella indica strain ST2)，其部分16S rDNA序列成功上传至美国国立生物技术信息中心(NCBI)，accession number为MK894860。
S.indica strain ST2(Shewanella indica strain ST2)可对不同结构的偶氮染料进行降解，并能耐受高浓度的染料，且能适应相较广泛的环境因子变化范围。革兰氏阴性细菌，杆状，周身纤毛，细胞表面有瘤粒状的凸起，形态电镜图如图2所示。在LB培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，肉红色，透明。在LB液体培养基中培养24h后，菌体粘稠，明显可见。希瓦氏菌ST2的系统进化树如图3所示。
在静置缺氧培养条件下，发现S.indica strain ST2难以利用染料为单一营养源，在LB培养基中，对活性黑5(RB5)、直接蓝2B(DB2)、刚果红(CR)、甲基橙(MO)、活性黄84(RY84)、直接黑38(DB38)、活性绿19(RG19)、酸性橙7(AO7)8种偶氮染料有较高的脱色效率，如图4所示。在30℃静置培养的条件下，除DB38和RY84外，S.indica strain ST2对其余6种染料(100mg/L)12h内的脱色率均大于80％。
理化因子(温度、盐度、pH、染料初始浓度、金属离子)对菌株的影响研究如图5-9所示，随着温度的上升，S.indica strain ST2脱色菌株的OD600值持续上升，在35℃处达到最大，培养12h后，OD600达到最大值。当温度继续升高，OD600值下降。当温度升至45℃度时，S.indica strain ST2菌株对直接蓝2B的脱色率仍大于40％。S.indica strain ST2的最适合pH为6，在pH为6-8范围内脱色率大于60％。S.indica strain ST2生长的最适含盐量为20g/L，当盐含量为40g/L时，脱色率大于70％。当直接蓝2B的浓度为2000mg/L时，S.indicastrain ST2在30℃静止培养24h时的脱色率约为80％。金属离子Mn2+、Pb2+、Fe3+、Fe2+、Ca2+、Ba2+、Ag+、Cd2+、Ni+、Zn2+、Cu2+、Mg2+和Co2+对S.indica strain ST2的影响效果各异，其中Pb2 +、Cd2+和Co2+3种离子对S.indica strain ST2的抑制效果较明显，Fe3+、Fe2+、Zn2+和Cu2+4种离子对S.indica strain ST2有轻微的抑制作用，而其他离子对S.indica strain ST2的影响较小。S.indica strain ST2对直接蓝2B脱色后，直接蓝2B的最大吸收峰消失，在200-400nm之间有新的吸收峰产生。通过高效液相色谱和气相色谱-质谱联用仪等手段，对偶氮染料降解产物进行分析，推测出S.indica strain ST2对偶氮染料直接蓝2B的降解通路，如图10所示。

Claims (3)

1.一株希瓦氏菌ST2的应用，其特征在于，用于偶氮染料的降解；希瓦氏菌ST2保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为 CCTCC M 2019770；所述偶氮染料为活性黑5、直接蓝2B、刚果红、甲基橙、活性绿19和酸性橙7。
2.根据权利要求1所述应用，所述希瓦氏菌ST2的培养方法中，培养基的组成为：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl 10.0g、去离子水1.0L、pH=7.4。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，培养条件为：温度为35℃、pH值为6，NaCl的浓度为10 g/L。
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微生物对偶氮染料脱色降解的研究进展;花莉等;《西北农林科技大学学报(自然科学版)》;20151010;第43卷(第10期);参见第105页右栏第2、3段，表1 *
脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)S12~T的脱色特性;许玫英等;《微生物学通报》;20050228(第01期);第1页第1段-第5页第2段 *

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