CN110283740A - 一种降解高氨氮污水复合菌剂及其在处理污水中的应用 - Google Patents

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Abstract

针对与目前传统光合细菌污水处理工艺中预处理带来的工艺流程复杂、二次污染严重、菌种优势不易保持等问题，本发明公开了一种能够有效地处理高氨氮污水的方法。本发明旨在于提供一种降解高氨氮污水复合菌剂，通过将荚膜红细菌3Z、类球状红杆菌发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液、Rhodobacter johrii发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液混合，获得降解高氨氮污水复合菌剂，该制备方法过程简单，能够高效地将无机氮转化为有机氮，显著提升污水处理效果的突出实用性。

Description

一种降解高氨氮污水复合菌剂及其在处理污水中的应用
技术领域
本发明涉及污水处理技术领域，具体涉及一种降解高氨氮污水复合菌剂及其在处理污水中应用的技术领域。
背景技术
近年来，由于人类活动频繁，污水排放量越来越多。其中高浓度氨氮污水造成的污染加剧，未经处理或处理不完全的高氨氮污水排放水体会造成水体中的溶解氧不断下降，水体富营养化日益严重，水质恶化。在氨氮过高的环境中，藻类及细菌等微生物大量死亡。在实际的工业污水处理过程中，高氨氮污水中含有较多的污染物质，其中包括可生物降解的有机物，难降解的污染物。在我国工业生产中针对氨氮污水的排放指标的规定限制日益严格，如何能够实现高效低成本的去除水中的氨氮污染物，已经成为我国污水处理领域中亟待解决的问题之一。目前处理高氨氮污水的常见方法有：物理化学法有吹脱、气提、折点加氯、离子交换、混凝沉淀、反渗透等。但以上方法技术经济费用高，处理流程复杂，反应过程中由于添加氯离子、磷等容易造成二次污染。
国内外针对高氨氮污水处理的技术研发主要集中在生物处理领域，生化处理法可以高效率低成本地处理含氨氮污水。光合细菌已被证明能在多种环境条件下去除各种污水中的有机物污染物，能够承受较高的有机负荷。现有传统光合细菌污水处理工艺中，需要预处理过程，其目的是为了将大分子物质降解为小分子物质，再由光合细菌同化处理小分子物质。但是预处理过程会消耗污水中营养物质，产生剩余污泥，并且会产生杂菌。另外，现有研究多集中在光合细菌单一菌株对高氨氮污水的处理，而单一菌株在处理高氨氮污水过程中环境抵抗力差、稳定性差。因此亟待一种操作简单易行、无二次污染、能够有效保持菌种优势的高氨氮污水生化处理方法。
发明内容
针对与目前传统光合细菌污水处理工艺中预处理带来的工艺流程复杂、二次污染严重、菌种优势不易保持等问题，提出一种能够有效地处理高氨氮污水的方法。本发明旨在于提供一种降解高氨氮污水复合菌剂，通过将荚膜红细菌3Z、类球状红杆菌发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液、Rhodobacter johrii发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液混合，获得降解高氨氮污水复合菌剂，该制备方法过程简单，能够高效地将无机氮转化为有机氮，显著提升污水处理效果的突出实用性。
本发明提供了一种降解高氨氮污水复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将4℃下保存的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z CGMCC No.17568、类球状红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和Rhodobacter johrii，在无菌状态下分别接种于灭菌的液体RCVBN培养基中，置于25℃的光照强度为3000-5000Lx的培养箱中静置培养72h，分别获得类球状红杆菌发酵液、荚膜红细菌3Z发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液，4℃下保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)在无菌状态下接种于灭菌的LB培养基中，置于25℃的培养箱中静置培养72h，获得枯草芽孢杆菌发酵液；
(2)按重量百分比计，将步骤(1)制备的荚膜红细菌3Z发酵液、类球状红杆菌发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液、Rhodobacter johrii发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液，混合，获得混合菌种发酵液，按重量百分比计，向混合菌种发酵液中加入1-2％海藻酸钠，3-5％葡萄糖，1-2％甘油，作为菌种保护剂，获得降解高氨氮污水复合菌剂。
优选的，本发明，所述混合菌种发酵液，按重量百分比计，枯草芽孢杆菌发酵液5％，类球状红杆菌发酵液10％，荚膜红细菌3Z发酵液65％，沼泽红假单胞菌发酵液15％，Rhodobacter johrii发酵液5％，进行混合。
优选的，本发明，所述降解高氨氮污水复合菌剂，储藏60天后，枯草芽孢杆菌有效活菌数为5.70±1.03×1010cfu/ml，荚膜红细菌3Z、类球状红杆菌、沼泽红假单胞菌和Rhodobacter johrii共同有效活菌数为8.3±0.82×109cfu/ml，即光合菌活菌数平均为8.3±0.82×109cfu/ml。
优选的，本发明，所述按重量百分比计，向混合菌种发酵液中加入1％海藻酸钠，4％葡萄糖，1％甘油，作为菌种保护剂，获得降解高氨氮污水复合菌剂。
本发明中，具体提供一种荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z CGMCCNo.17568。通过从新疆天山1号冰川退缩后新暴露出的土壤(43°06′N,86°49′E)中分离与筛选，从中筛选出一株编号为3Z的新菌种荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)，该菌株能在pH值为6.0～8.5环境活性较强，生长速度快，发酵过程中能够产生氢气，且对氨氮的降解效率较高，其生成的亚硝酸盐较低。
本发明根据新疆地理环境的特殊性，通过从通过从新疆天山1号冰川退缩后新暴露出的土壤(43°06′N，86°49′E)中进行微生物菌种的培养、分离，筛选一大批优良菌种，并从中优选出一株编号为3Z的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)，经微生物学分类与鉴定，属于荚膜红细菌属，该菌株最适生长条件为：温度30℃，最高生长温度为45℃，培养基为RCVBN培养基，培养时间为24-48h，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)等对菌株进行形态学、生理生化试验，确定3Z菌株为荚膜红细菌属中成员，但是具有与常见的荚膜红细菌属成员菌种不同的特点，具有新菌种的特性。
菌株荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z在RCVBN固体培养基上，培养24h菌落可达2～4mm，灰白色，光滑，圆形，扁平，半透明，边缘整齐，革兰氏染色结果为G-。
进一步，本发明通过对上述菌种荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z CGMCCNo.17568基因测序，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见网站进行比对分析，结果发现，菌株3Z的16S rRNA基因序列与Rhodobacter capsulatus SB 1003基因登录号CP001312的同源性最高，为96.37％，与Rhodobacter capsulatus strain XJ-1基因登录号HM370064的同源性较高为96.15％，菌株3Z与Rhodobacter capsulatus SB 1003的亲缘关系最近。利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法，bootstrap1000次重复，Kimura 2-parameter模型进行计算和构建系统发育树。Stenotrophomonassp.KJ452211作为outgroup序列，建立系统进化树，结果经比对分析发现，菌株3Z作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株3Z确定其为荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z。该新菌种已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2019年4月15日，保藏号是CGMCC No.17568。经微生物学鉴定暂命名为荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z。
进一步，本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、类球状红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、Rhodobacter johrii四种菌都为常见的公众熟知菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买获得，四种菌的培养条件及培养基都可采用本领域常见报道获得。
进一步，本发明提供一种降解高氨氮污水复合菌剂在处理污水中的应用。
本发明重点是通过实验证明采用此枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、类球状红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、Rhodobacter johrii和荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z CGMCC No.17568五种菌按照本发明提供的技术方案进行复配，在菌种保护剂的作用下，利用微生物菌种的特异性和复杂性，将各种不同的菌种能够复合配伍使用，通过各种菌种的相融性、配伍性与各菌种属性结合，考虑的复合菌种的安全性与选用菌种保护剂的复配性需求，在降解高氨氮污水复合菌剂的制备中创造性的通过实验证实的工艺，制备的降解高氨氮污水复合菌剂具有高效地将无机氮转化为有机氮，且特别是应用于高氨氮污水处理中获得显著突出的技术效果。
通过实施本发明的具体的发明内容，可以达到以下的技术效果。
(1)本发明制备的一种降解高氨氮污水复合菌剂，通过枯草芽孢杆菌、类球状红杆菌、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z CGMCC No.17568、沼泽红假单胞菌、Rhodobacter johrii混合制备的降解高氨氮污水复合菌剂，该制备方法过程简单，能够高效地将无机氮转化为有机氮，显著提升污水处理效果的突出实用性。
(2)本发明制备的一种降解高氨氮污水复合菌剂，按照枯草芽孢杆菌发酵液5％，类球状红杆菌发酵液10％，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z CGMCC No.17568发酵液65％，沼泽红假单胞菌发酵液15％，Rhodobacter johrii发酵液5％进行混合，制备的混合菌种发酵液，处理高氨氮池塘水体第6天污水氨氮含量为0.19mg/L，降解氨氮能力显著高于其他组合，降解污水第9天后氨氮含量为0.18mg/L，氨氮降解率基本保持稳定，比空白对照组第9天时的氨氮含量降低1.48mg/L，对高氨氮污水的降解氨氮更有效，作用时间更短。
(3)本发明制备的一种降解高氨氮污水复合菌剂，通过添加葡萄糖添加量4％、海藻酸钠添加量1％、甘油添加量1％，能起到较好的保护菌种效果，在长期储存中降低微生物的损伤，延长保质期，贮藏60天后光合菌活菌数平均为8.3±0.82×109cfu/ml，枯草芽孢杆菌活菌数平均为5.70±1.03×1010cfu/ml。
(4)本发明制备的一种降解高氨氮污水复合菌剂，应用于高氨氮池塘能够持续降解池塘中磷酸盐含量，并且其作用效果不受池塘中藻类影响，在使用本发明复合菌剂的时候应在光线充足，水体氧气充足时施用。
(5)本发明制备的一种降解高氨氮污水复合菌剂，应用于各种类型的池塘水体中，池塘水体pH未见有明显影响，水体pH基本维持在8.3以下。
附图说明
图1显示为荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z系统发育树图。
图2显示为不同温度培养枯草芽孢杆菌的生长曲线图。
图3显示为葡萄糖添加量和海藻酸钠添加量交互响应面图。
图4显示为葡萄糖添加量和甘油添加量交互响应面图。
图5显示为甘油添加量和海藻酸钠添加量交互响应面图。
图6显示为不同复合菌剂对鱼塘污水氨氮降解效果对比图。
图7显示为复合菌剂在不同池塘中降解磷酸盐效果对比图。
图8显示为复合菌剂在不同池塘中亚硝酸盐降解效果对比图。
图9显示为降解高氨氮污水复合菌剂在不同池塘中pH变化趋势图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明的方法不限于下述实施例。
主要培养基：RCVBN培养基：CH3COONa 3.0g，(NH4)2SO4 1.0g，MgSO4 0.2g，NaCl1.0g，KH2PO4 0.3g，K2HPO4 0.5g，CaCl2 0.05g，酵母膏0.1g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，固体培养基中加入1.5％琼脂。
主要仪器设备：SW-CJ-2FD超净工作台，YXQ-LS-75灭菌锅，UV-2550紫外分光光度计，S220pH仪，JY20002电子天平，20PR-52离心机。
主要试验方法：硝酸盐氮测定采用酚二磺酸分光光度法；亚硝酸盐氮的测定采用N一(1.萘基)一乙二胺分光光度法；氨氮含量测定用纳氏试剂法；COD测定采用用酸性高锰酸钾法。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一：降解高氨氮污水复合菌剂
本发明提供了一种降解高氨氮污水复合菌剂制备方法包括如下步骤：
(1)将4℃下保存的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z CGMCC No.17568、类球状红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和Rhodobacter johrii，在无菌状态下分别接种于灭菌的液体RCVBN培养基中，置于25℃的光照强度为3000-5000Lx的培养箱中静置培养72h，分别获得类球状红杆菌发酵液、荚膜红细菌3Z发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液，4℃下保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)在无菌状态下接种于灭菌的LB培养基中，置于25℃的培养箱中静置培养72h，获得枯草芽孢杆菌发酵液；
(2)按重量百分比计，将步骤(1)制备的荚膜红细菌3Z发酵液、类球状红杆菌发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液、Rhodobacter johrii发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液，混合，获得混合菌种发酵液，按重量百分比计，向混合菌种发酵液中加入1-2％海藻酸钠，3-5％葡萄糖，1-2％甘油，作为菌种保护剂，获得降解高氨氮污水复合菌剂。
优选的，本发明，所述混合菌种发酵液，按重量百分比计，枯草芽孢杆菌发酵液5％，类球状红杆菌发酵液10％，荚膜红细菌3Z发酵液65％，沼泽红假单胞菌发酵液15％，Rhodobacter johrii发酵液5％，进行混合。
优选的，本发明，所述降解高氨氮污水复合菌剂，储藏60天后，枯草芽孢杆菌有效活菌数为5.70±1.03×1010cfu/ml，荚膜红细菌3Z、类球状红杆菌、沼泽红假单胞菌和Rhodobacter johrii共同有效活菌数为8.3±0.82×109cfu/ml，即光合菌活菌数平均为8.3±0.82×109cfu/ml。
优选的，本发明，所述按重量百分比计，向混合菌种发酵液中加入1％海藻酸钠、4％葡萄糖、1％甘油，作为菌种保护剂，获得降解高氨氮污水复合菌剂。
实施例二：荚膜红细菌3Z的分离筛选
1、分离与纯化
称取5g冰川前缘土壤加入至250ml的锥形瓶中，加入灭菌的液体RCVBN培养基至瓶口，使用无菌的液体石蜡封口隔绝空气，放入25℃的光照强度为3000-5000Lx的培养箱中静置培养。观察瓶中培养基是否出现明显的红色，粉红色或黄色。待培养基变色后重复2-3次转接，直到瓶中光合细菌占明显优势后，进行下一步平板分离和纯化。
采用双层琼脂平板法，按照10倍逐级稀释富集液，将10-5，10-6两个梯度的稀释液用移液枪吸取100μL于固体RCVBN平板上，用涂布棒均匀涂布，室温放置30min，待菌液被培养基吸收完毕后，平铺一层无菌液体琼脂封闭，其凝固后，将平板置于30℃光照强度为3000-5000Lx的培养箱中培养。待平板中长出紫色菌落后，挑取不同生长速度的单菌落进行纯化。
2、分离纯化菌株生长形态观察
在纯化培养基上对已纯化的菌株进行菌落形态观察，进行革兰氏染色，显微镜下观察，革兰氏染色结果显示3Z菌株为革兰氏阴性杆状菌，3Z菌株在RCVBN固体培养基上，培养24h菌落可达2～4mm，灰白色，光滑，圆形，扁平，半透明，边缘整齐，符合荚膜红细菌菌落特征。
3、分子生物学鉴定
结合16S rDNA基因序列比对分析对3Z菌株进行鉴定。
特异性引物为：
上游引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',
下游引物1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
扩增体系(50μL)：上下游引物各1μL，模板DNA 3μL，Mix 25μL，Taq酶20μL。扩增条件：预变性95℃2min；35个循环包括变性95℃20s,引物退火58℃20s,引物延伸72℃1min；最后延伸72℃10min。PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序。
进一步，通过对上述菌种荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z CGMCCNo.17568基因测序，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见网站进行比对分析，结果发现，菌株3Z的16S rRNA基因序列与Rhodobacter capsulatus SB 1003基因登录号CP001312的同源性最高，为96.37％，与Rhodobacter capsulatus strain XJ-1基因登录号HM370064的同源性较高为96.15％，菌株3Z与Rhodobacter capsulatus SB 1003的亲缘关系最近。利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法，bootstrap1000次重复，Kimura 2-parameter模型进行计算和构建系统发育树，如附图1所示。Stenotrophomonas sp.KJ452211作为outgroup序列，结果经比对分析发现，菌株3Z作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株3Z确定其为荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)属中新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z。该新菌种已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2019年4月15日，保藏号是CGMCC No.17568。经微生物学鉴定暂命名为荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)3Z。
实施例三：枯草芽孢杆菌菌株性能
1、低温生长试验
如附图2所示，在培养温度为20℃时菌株在12h左右开始进入指数期，菌株在25℃培养下26h生长量与20℃培养的菌体量相当，说明枯草芽孢杆菌菌株在25℃和20℃培养26h菌体量相当。
2、产酶特性试验
对枯草芽孢杆菌进行产淀粉酶，蛋白酶和纤维素酶试验，淀粉酶活初筛采用卢卡氏碘液浸染平板法，蛋白酶活力采用考马斯亮蓝比色法；纤维素酶活性初筛采用刚果红浸染平板检测法。结果显示这该菌株能产生明显的蛋白酶和淀粉酶，但是不产纤维素酶。
3、对水体有机质(COD)和氨的降解效果评价
评价枯草芽孢杆菌菌株对池塘水中有机质和氨氮的降解效率。试验设置两个3L容器，1号为对照不加菌剂，2号为添加枯草芽孢杆菌，将二个容器放置于室外，测定水体COD和氨态氮，水体COD测定采用重铬酸钾法测定，氨氮测定采用纳氏试剂分光光度法。结果显示，5天的降解结果显示枯草芽孢杆菌的COD降解率为42％，氨氮降解率最高42.7％。
实施例四：降解高氨氮污水复合菌剂优化
(1)混合菌种发酵液的优化
本试验设置10个试验组，各试验组的5中菌种发酵液按照不同组合混合后获得混合菌种发酵液，将4℃下保存的荚膜红细菌3Z CGMCC No.17568、类球状红杆菌、沼泽红假单胞菌和Rhodobacter johrii，在无菌状态下接种于灭菌的液体RCVBN培养基中，置于25℃的光照强度为3000-5000Lx的培养箱中静置培养72h，分别获得类球状红杆菌发酵液、荚膜红细菌3Z发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液，4℃下保存的枯草芽孢杆菌在无菌状态下接种于灭菌的LB培养基中，置于25℃的培养箱中静置培养72h，获得枯草
芽孢杆菌发酵液；混合菌种发酵液的不同组合参见表1所示，将不同组合的混合菌种发酵液按照1kg/亩使用量用于高氨氮池塘水体，10个试验组的高氨氮池塘水体来自于同一个池塘，每组池塘污水体积为80L，每天检测污水中的氨氮含量。
表1：不同混合菌种发酵液组合对高氨氮污水中降解氨氮含量的试验
试验结果参见表1所示，在J组空白对照不添加任何混合菌种发酵液的况下污水中第9天氨氮含量为1.66mg/L，使用E组混合菌种发酵液的污水在第3天时氨氮含量为1.16mg/L，第6天污水氨氮含量为0.19mg/L，降解氨氮能力显著高于其他组合，降解污水第9天后氨氮含量为0.18mg/L，氨氮降解率基本保持稳定，比空白对照J组第9天时的氨氮含量降低1.48mg/L，说明第E组混合菌种发酵液(枯草芽孢杆菌发酵液5％，类球状红杆菌发酵液10％，荚膜红细菌3Z发酵液65％，沼泽红假单胞菌发酵液15％，Rhodobacter johrii发酵液5％)对高氨氮污水的降解氨氮更有效，作用时间更短。对于降解高氨氮污水具有一定的参考意义。
(2)响应面优化
在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验分别对降解高氨氮污水复合菌剂中光合菌活菌数(Y1)和枯草芽孢杆菌活菌数(Y2)影响的三个因素：葡萄糖添加量(A)、海藻酸钠添加量(B)甘油添加量(C)，按照表3的各组合制备的降解高氨氮污水复合菌剂放置60天后，分别对光合菌活菌数和枯草芽孢杆菌活菌数进行检测，利用响应面软件Design-Expert 8.05软件，根据Box-Behnken试验组合设计进行三因素三水平试验。响应面试验的因素和水平编码值参见表2所示。
表2：响应面试验的因素和水平编码值
发酵响应面优化分析：采用Box-Behnken响应面分析法对其进行优化，响应面试验设计及响应值结果参见表3所示。
表3：响应面试验及响应值
按照表3试验数据进行多元回归方程拟合，可建立以光合菌活菌数(Y1)对葡萄糖添加量(A)、海藻酸钠添加量(B)甘油添加量(C)的拟合方程为：
Y1＝8.3+0.059A+0.11B-0.013C-0.19AB-0.09AC-0.25BC-0.42A2-0.28B2-0.26C2
表4：响应面试验结果及方差分析
注：表3及表4中，“*”表示显著(0.01<p<0.05)；“**”表示极显著(p<0.01)。
回归方程中各变量对响应值影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表4可知，当模型F值为F＝65.27，P<0.001，说明模型是极显著的。失拟项为F＝5.17时，P＝0.0732>0.05说明模型失拟项不显著。决定系数R2＝0.9882，校正系数分别为R2 Adj＝0.9731，表明实测值与预测值之间具有很好的拟合度。由此可以说明模型的建立呈显著性，说明此模型的拟合程度较好，试验操作准确可信，因此可以利用此模型对抗病驱虫生物有机肥中活菌数进行分析和预测。利用Design-Expert 8.05软件对回归方程进行运算，作出交互项的响应面图，参见附图3、附图4和附图5所示。
按照表3试验数据进行多元回归方程拟合，可建立以枯草芽孢杆菌活菌数(Y2)对葡萄糖添加量(A)、海藻酸钠添加量(B)甘油添加量(C)的拟合方程为：
Y1＝5.78+0.1A+0.14B+0.06C-0.24AB-0.34AC-0.12BC-0.34A2-0.086B2-0.086C2
表5：响应面试验结果及方差分析
注：表3及表4中，“*”表示显著(0.01<p<0.05)；“**”表示极显著(p<0.01)。
回归方程中各变量对响应值影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表5可知，当模型F值为F＝50.03，P<0.001，说明模型是极显著的。失拟项为F＝2.45时，P＝0.2030>0.05说明模型失拟项不显著。决定系数R2＝0.9847，校正系数分别为R2 Adj＝0.965，表明实测值与预测值之间具有很好的拟合度。由此可以说明模型的建立呈显著性，说明此模型的拟合程度较好，试验操作准确可信，因此可以利用此模型对抗病驱虫生物有机肥中活菌数进行分析和预测。
分别对降解高氨氮污水复合菌剂中光合菌活菌数(Y1)和枯草芽孢杆菌活菌数(Y2)取最大值，由软件Design-Expert 8.05自动分析可得到最佳配比理论值为：葡萄糖添加量4.01％、海藻酸钠添加量1.17％、甘油添加量1.00％，所测光合菌活菌数为8.302×109cfu/g和枯草芽孢杆菌活菌数为5.818×1010cfu/g。考虑实际操作方便，选取葡萄糖添加量4％、海藻酸钠添加量1％、甘油添加量1％，进行3次平行试验，光合菌活菌数平均为8.3±0.82×109cfu/ml，枯草芽孢杆菌活菌数平均为5.70±1.03×1010cfu/ml。与理论预测值接近，说明方程与实际情况拟合良好，响应面分析所得到的优化模型是可靠的，该数学模型对优化降解高氨氮污水复合菌剂中光合菌活菌数和枯草芽孢杆菌活菌数是可行的，具有实用价值。
通过上述系列试验制备的降解高氨氮污水复合菌剂，通过添加葡萄糖添加量4％、海藻酸钠添加量1％、甘油添加量1％，能起到较好的保护菌种效果，在长期储存中降低微生物的损伤，延长保质期。
5.70±1.03×1010cfu/ml，荚膜红细菌3Z、类球状红杆菌、沼泽红假单胞菌和Rhodobacter johrii＝共同有效活菌数为8.3±0.82×109cfu/ml。
实施例六：本发明降解高氨氮污水复合菌剂的适用试验
1、氨氮降解效果
本试验设置两种菌剂，A组按实施例一的方法制备降解高氨氮污水复合菌剂，B组为单纯光合菌发酵液；将制备好的2种菌剂接种于鱼塘污水中，每天检测鱼塘污水中降解氨氮量，试验结果参见附图6所示，单纯光合细菌发酵液在鱼塘中降解氨氮需要六天左右的时间能完全降解氨离子，而本发明制备的复合菌剂比单纯的光合细菌降解氨氮更有效，作用时间更短，并且不会出现反复状况，因此发明制备的降解高氨氮污水复合菌剂降氨氮效果更佳显著。
2、磷酸盐降解效果
按实施例一的方法制备降解高氨氮污水复合菌剂，按复合菌剂1kg/亩使用量分别加入2个高氨氮池塘中，2号池塘的优势类群为硅藻、金藻、蓝藻，而3号池塘是以绿藻、硅藻为优势类群的池塘。试验结果如附图7所示，按降解高氨氮污水复合菌剂1kg/亩使用量分别加入2个池塘能够持续降解高氨氮污水池塘中磷酸盐含量，并且其作用效果不受池塘中藻类影响。
3、亚硝酸盐降解效果
按实施例一的方法制备降解高氨氮污水复合菌剂，按降解高氨氮污水复合菌剂1kg/亩使用量分别加入2个高氨氮池塘中，2号池塘的优势类群为硅藻，金藻，蓝藻，而3号池塘是以绿藻和硅藻为优势类群的池塘。如附图8所示，本发明制备的复合光合细菌1kg/亩使用量施用后对亚硝酸盐的降解效果与池塘藻类类型有关，2号池塘产氧能力较弱因此其施用后亚硝酸盐量呈现升高趋势，而3号绿藻塘产氧能力强，因此其亚硝酸盐含量呈现出较为稳定状态。因此在使用本发明复合菌剂的时候应在光线充足，水体氧气充足时施用。
4、对水体pH的影响
按实施例一的方法制备降解高氨氮污水复合菌剂，施用于1号、4号、6号和9号四个池塘中，四个池塘情况分别为：1号池塘：15亩，最大深度2.5m，最小深度1m，平均水深1.5m，水色浓绿，藻类主要是以绿藻门为主，水质比较稳定，pH 8.0左右，氨氮<0.5，饲养主要为鲤鱼、花鲢、草鱼，共计大约5万尾；4号池塘：14亩，最大深度2.0m，最小深度1.5m，平均水深1.5m，水色偏黄、偏瘦，藻类不丰富，主要是以硅藻门为主，饲养主要为鲤鱼、花鲢、草鱼，共计大约3万尾；6号池塘：10亩，最大深度2.0m，最小深度1m，平均水深1.5m，水色淡绿，藻类主要是以绿藻、硅藻门为主，饲养主要为鲤鱼、花鲢、草鱼，共计大约5万尾；9号池塘：11亩，最大深度2.0m，最小深度1m，平均水深1.5m，水色偏黑、偏瘦藻类不稳定，饲养主要为鲤鱼、花鲢、草鱼，共计大约3万尾。试验结果参见附图9所示，使用本发明制备的降解高氨氮污水复合菌剂后，对各种类型的池塘水体pH未见有明显影响，水体pH基本维持在8.3以下，1号池塘pH的升高主要是由于水体中藻类的快速生长造成的pH升高。
从上述测试结果可以看出，本发明制备的复合菌剂的有效活菌数中枯草芽孢杆菌为5.70±1.03×1010cfu/ml，光合细菌为8.3±0.82×108cfu/ml，且制备过程简单，应用于降解高氨氮污水处理，能够高效地将无机氮转化为有机氮，显著提升污水处理效果的突出实用性，对于高氨氮污水的处理具有良好应用前景。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
序列表
<110> 新疆天康饲料科技有限公司生物添加剂分公司
<120> 一种降解高氨氮废水复合菌剂及其在处理污水中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1378
<212> DNA
<213> 荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)
<400> 1
gtttgatcct ggctcagaac gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa gtcgagcgag 60
accttcgggt ctatcggcgg acgcgtgagt aacgcgtggg aacgtgccct tttctacgga 120
atagccccgg gaaactggga gtaataccgt atgtgccctt cgggggaaag atttatcggc 180
aaaggatcgg cccgcgttgg attaggtagt tggtggggta atggcctacc aagccgacga 240
tccatagctg gtttgagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300
tacgggaggc agcagtgggg aatcttagac aatgggggaa accctgatct agccatgccg 360
cgtgagcgat gaaggcctta gggttgtaaa gctctttcag gtgggaagat aatgacggta 420
ccaccagaag aagccccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagaaggcta 480
gcgttgttcg caattactgg gcgtacagcg cacgtaggcg gatcagaaag tcagaggtga 540
aatcccaggg ctcaaccttg gaactgcctt tgaaactcat ggtcttgagc acaagacagg 600
cgagtggaat ttcgagtgta gaggtgaact tcgtagatat tcggagtaac accagtggcg 660
aaggcggctc actggctcga tactgacgct gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga 720
ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgcc agtcgtcggc aggcatgcct 780
gtcggtgaca cacctaacgg attaagcatt ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa 840
actctacgga attgacgccg gcccgcacta gcggtggagc atgtggtata attcgacgca 900
acgcgcagat ccttaccaag ccttgacatc aggatcgcgg ttaccagaga tggtttcctt 960
cagttccgct ggatcttaga caggtgcagc atcgctctcg tcagcccgtg tcgtgaggtg 1020
ttcggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc acactttcag ttgccatcat tcagttgggc 1080
actctggaag aactgccgat gatatgtcgg aggaaggtgt ggatgacgtc aagtcctcat 1140
ggcccttacg ggttgggcta cacacgtgct acaatggtgg tgacaatggg ccaatcccaa 1200
acagccatct cagttcggat tgcggtctgc aactcgactt catgaagtcg gactcgctag 1260
tgatcgcgta acagcatgac gccgtgaata cgctcccggg ccttgtacac accggccgtc 1320
acaccatcgg aattcggtct agcctaagat ggtgcgccaa accgcaatgg aggcagcc 1378

Claims (8)

1.一种降解高氨氮废水复合菌剂的制备方法，其特征在于，通过如下制备方法获得：
（1）将4℃下保存的荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）3Z CGMCC No.17568、类球状红杆菌（Rhodobacter sphaeroides）、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）和Rhodobacter johrii，在无菌状态下分别接种于灭菌的液体RCVBN培养基中，置于25℃的光照强度为3000-5000Lx的培养箱中静置培养72h，分别获得类球状红杆菌发酵液、荚膜红杆菌3Z发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液，4℃下保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在无菌状态下接种于灭菌的LB培养基中，置于25℃的培养箱中静置培养72h，获得枯草芽孢杆菌发酵液；
（2）按重量百分比计，将步骤（1）制备的荚膜红细菌3Z发酵液、类球状红杆菌发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液、Rhodobacter johrii发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液，混合，获得混合菌种发酵液，按重量百分比计，向混合菌种发酵液中加入1-2%海藻酸钠，3-5%葡萄糖，1-2%甘油，获得降解高氨氮污水复合菌剂。
2.如权利要求1所述的一种降解高氨氮废水复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述混合菌种发酵液，按重量百分比计，枯草芽孢杆菌发酵液5%，类球状红杆菌发酵液10%，荚膜红细菌3Z发酵液65%，沼泽红假单胞菌发酵液15%，Rhodobacter johrii发酵液5%，进行混合。
3.如权利要求1所述的一种降解高氨氮废水复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述按重量百分比计，向混合菌种发酵液中加入1%海藻酸钠，4%葡萄糖，1%甘油，获得降解高氨氮污水复合菌剂。
4.如权利要求1所述的一种降解高氨氮废水复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述降解高氨氮废水复合菌剂，储藏60天后，枯草芽孢杆菌有效活菌数为5.70±1.03×1010 cfu/ml，荚膜红细菌3Z、类球状红杆菌、沼泽红假单胞菌和Rhodobacter johrii共同有效活菌数为8.3±0.82×109cfu/ml。
5.如权利要求1所述的一种降解高氨氮废水复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）3Z，菌种保藏编号为CGMCC No.17568。
6.如权利要求1所述的一种降解高氨氮废水复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）3Z，基因序列如SEQ ID NO:1所示。
7.如权利要求1至6任意一项所述的制备方法制备的降解高氨氮废水复合菌剂。
8.如权利要求7所述的降解高氨氮废水复合菌剂在处理污水中的应用。
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Patentee before: BIOLOGICAL ADDITIVES BRANCH OF XINJIANG TIANKANG FEED TECHNOLOGY Co.,Ltd.