CN103710284A

CN103710284A - 具有氨氮降解能力的菌合剂及其应用

Info

Publication number: CN103710284A
Application number: CN201310714344.4A
Authority: CN
Inventors: 张志成; 沈志远; 戴鼎震
Original assignee: Jinling Institute of Technology
Current assignee: Jiangsu Yangxian Technology Co ltd
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: CN103710284B

Abstract

本发明公开了一种具有氨氮降解能力的菌合剂，它是由枯草芽孢杆菌CCTCC M2013490与类球红细菌CCTCC M2013491按细菌数1：1的混合物。上述具有氨氮降解能力的菌合剂在降解水体中氨氮的应用以及在治理水产养殖水体中的应用。本发明的一种具有氨氮降解能力的菌合剂，可迅速有效的降低水体中的硝酸盐、亚硝酸盐含量，可以改善由于污染造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能，具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分。

Description

具有氨氮降解能力的菌合剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有氨氮降解能力的菌合剂及其应用。

背景技术

随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，由于工业污水排放、畜禽业养殖污水排放、水产养殖污水排放、生活污水排放等引起的水体氨氮污染有加重的趋势，不仅会引起水体中藻类及其它微生物大量繁殖，形成富营养化污染，严重时会引起水中溶解氧的大量消耗，导致水生动物大量死亡，造成生态破坏和一定程度的经济损失。在氨的致死、半致死浓度下，氨可引起养殖动物的肾、脾、甲状腺和血液组织的变化；亚硝酸盐对养殖动物有很强的毒性，严重影响养殖动物的生长、发育。水体中存在的氨氮对养殖的水产品具有一定的毒性，影响了水产品的品质，限制了水产养殖的可持续发展，特别是随着高密度工厂化养殖技术的推广，氨氮污染治理的需求日益突出。

国内外大量研究表明，硝化细菌、光合细菌、芽孢杆菌及诺卡氏菌等均对养殖水体中的氨氮具有较强的去除能力，且光合细菌和硝化细菌已在实践中取得良好效果^[4]。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供具有氨氮降解能力的菌合剂。

本发明还要解决的技术问题是提供上述菌合剂的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种具有氨氮降解能力的菌合剂，它是由枯草芽孢杆菌CCTCC No：M2013490与类球红细菌CCTCC No：M2013491按细菌数1：1的混合物。

本发明所述的枯草芽孢杆菌是发明人于2012年8月从江苏省南京市排污口淤泥中分离出来的菌株，经过形态学观察、生理生化实验和PCR鉴定，确认为枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No：M2013490，保藏日期：2013年10月23日。

本发明所述的类球红细菌是发明人于2012年8月从江苏省南京市污水处理厂活性污泥中分离出来的菌株，经过形态学观察、生理生化实验和PCR鉴定，确认为类球红细菌，其分类命名为类球红细菌（Rhodobacter Sphaeroides），现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No:M2013491，保藏日期：2013年10月23日。

类球红细菌是一种光合细菌，它与枯草芽孢杆菌均能分解水体有机物、控制水体氮含量，起到净化水质的作用，并且无污染、高效率，是比较理想的净化水质的生物制剂。然而在将其应用之前，需要进行一系列的实验来确定其最佳的使用浓度，目的是为了用最低的投资成本来达到最好的净化效果。

上述具有氨氮降解能力的菌合剂在降解水体中氨氮的应用。

上述具有氨氮降解能力的菌合剂在治理水产养殖水体中的应用。

有益效果：本发明的一种具有氨氮降解能力的菌合剂，可迅速有效的降低水体中的硝酸盐、亚硝酸盐含量，可以改善由于污染造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能，具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分。

附图说明

图1水样中氨氮的质量浓度的标准曲线。

图2类球红细菌氨氮降解的浓度曲线图。

图3枯草芽孢杆菌氨氮降解的浓度曲线图。

图4最佳组合比例氨氮降解的浓度曲线图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

1材料与仪器

1.1菌株来源

本实验所需的材料是从污水处理厂活性污泥中筛选分离得到一株类球红细菌CCTCC No：M2013491，配合常用细菌——枯草芽孢杆菌CCTCC No：M2013490，制备成类球红细菌合剂。实验采用的类球红细菌菌株，保存在LB固体培养基斜面上，保藏于4℃冰箱。

1.2培养基

1.2.1LB液体培养基

蛋白胨10g，酵母粉1g，NaCL10g，蒸馏水1000mL，PH7.2-7.4，121℃灭菌30分钟，4℃保存备用。

1.2.2LB固体培养基

蛋白胨10g，酵母粉1g，NaCL10g，蒸馏水1000mL，琼脂0.42g，PH7.2-7.4，121℃灭菌30分钟，4℃保存备用。

1.2.3氨氮培养基^[1]（模拟水体）

葡萄糖5.0g，(NH₄)₂SO₄0.25g，NaCL1.0g，K₂HPO40.5g，MgSO₄·7H₂O0.25g，水1000mL，pH值7.0，其中氨氮含量约为50mg/L，再取5mL稀释分装于50mL细胞培养管中，121℃条件下灭菌15min，待用。

1.3清洗溶液：

氢氧化钾100g，水100mL，乙醇900mL。

1.4氨氮测定所需试剂

蒸馏水、显色剂（水杨酸-酒石酸钾钠溶液）、亚硝基铁氰化钠溶液，ρ=10g/L、次氯酸钠。若水杨酸未全部溶解可加入数毫升的氢氧化钠。

1.5主要仪器、设备

YXQ-LS-755II立式压力灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）

MVS-1漩涡混合器（北京东方开物科学器材有限公司）

立式恒温振荡箱IS-RDV3

可见分光光度计：10～30mm比色皿

滴瓶：其滴管滴出液体积，20滴相当于1mL。

实验室常用玻璃器皿：所有玻璃器皿均应用清洗溶液（2.3）仔细清洗，然后用水冲洗干净。

2方法

2.1菌株的活化

用接种环挑取类球红细菌和枯草芽孢杆菌菌株分别接种到LB液体培养基中，35℃，120rpm，摇床培养18-20h后，4℃保存待用。

2.2活菌计数（倾注平板法）

用生理盐水逐级稀释，选取最后2个适宜的稀释梯度进行平板倾注，每个梯度设3个平行，培养24h后进行活菌记数。

2.3菌株的接种^[2]

2.3.1类球红细菌：

将活化的类球红细菌菌株按10⁴-10⁵CFU/ml的活菌量加至氨氮培养基中，35℃，120rpm，分别间隔0，12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，120h进行抽样，最后取其平均值。

2.3.2枯草芽孢杆菌：

将活化的枯草芽孢杆菌菌株按10⁴-10⁵CFU/ml的活菌量加至氨氮培养基中，35℃，120rpm，分别间隔0，12h，24h…以此类推抽样5天（方法同2.3.1），最后取其平均值。2.3.3类球红细菌合剂：

将活化的类球红细菌和枯草芽孢杆菌菌株按5种不同的比例混合，两种活菌数加起来在（10⁴-10⁵CFU/ml）之间，每组设两个平行，加至氨氮培养基中，35℃，120rpm，分别间隔0，12h，24h…以此类推抽样5天（方法同2.3.1），最后取其平均值。

2.4合剂中组合比例的氨氮测定^[3]

在碱性介质（pH=11.7）和亚硝基铁氰化钠存在下，水中的氨、铵离子与水杨酸盐和次氯酸离子反应生成蓝色化合物，在697nm处用分光光度计测量吸光度。

将类球红细菌和枯草芽孢杆菌按五种不同的比例混合：3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，最后根据结果选取一个最佳混合比例。每次抽样后用水杨酸分光光度法^[3]检测氨氮的浓度。

2.5结果的计算（用曲线图表示）

水样中氨氮的质量浓度按下式计算：

ρN=(A_s－A_b－a)×D／b×V

式中：ρN——水样中氨氮的质量浓度（以N计）mg/L；

As——样品的吸光度(波长为697nm处)；

Ab——空白试验的吸光度（蒸馏水作参比）；

a——校准曲线的截距；

b——校准曲线的斜率；

V——所取水样的体积；

D——水样的稀释倍数。

表1水杨酸分光光度法：标准氨氮浓度在波长697纳米处的值

标准曲线图见图1。

3结果与分析

3.1最大活菌数的测定结果

用稀释平板计数法测得类球红细菌稳定期的活菌量为：2.1×10⁹CFU/ml，枯草芽孢杆菌稳定期的活菌量为：9.0×10⁹CFU/ml。

3.2类球红细菌的氨氮降解能力测定结果

溶液中氨氮的浓度随时间的变化见表2。

表2类球红细菌对氨氮培养基的降解能力测定

由图2分析：0～36小时，类球红细菌对氨氮的降解速度最快，60h后降解速度显著降低，100小时以后几乎无降解氨氮效果。

3.3枯草芽孢杆菌的氨氮降解能力测定结果

溶液中氨氮的浓度随时间的变化：

表3枯草芽孢杆菌对氨氮培养基的降解能力测定

由图3分析：0～36h，氨氮的降解速度最快，随着时间的延长，逐渐降低。前36小时，加入类球红细菌降解氨氮培养基浓度比加入枯草芽孢杆菌的氨氮浓度低，说明类球红细菌对氨氮的降解能力比枯草芽孢杆菌强。

3.4类球红细菌与枯草芽孢杆菌最佳组合比例

3.4.1不同混合比例的氨氮的浓度

按下表的比例加入合适量的混合细菌，作用72小时后测定氨氮残留浓度

表4类球红细菌与枯草芽孢混杆菌按比例合后的氨氮残留浓度

由表4知：类球红细菌与枯草芽孢杆菌的组合比例为1∶1时，氨氮的残留浓度是最低的，所以1∶1为两者混合的最佳比例。

3.4.2最佳组合比例溶液中氨氮的浓度随时间的变化：

表5类球红细菌合剂对氨氮培养基的降解能力测定

分析：

随着时间的延长，氨氮的残留浓度逐渐下降，并且下降速度逐渐变慢，说明在接种细菌前期，菌株降解能力较强，其原因可能是营养物质充分，随着时间的推移，营养物质的消耗殆尽，直接导致菌株对氨氮的降解能力下降。

0～36小时，类球红细菌和枯草芽孢杆菌的氨氮降解速度都很快，36小时后，其降解能力的变化都很小，而且类球红细菌的降解能力比枯草芽孢杆菌的降解能力要强。0～60小时，类球红细菌合剂对氨氮的降解能力最强，80小时后氨氮浓度变化就不显著了，合剂高效降解氨氮的时间比两种细菌单独降解氨氮培养基持续的时间长。

4讨论与小结

4.1讨论

氨氮对水生生物的危害主要是指非离子氨的危害，非离子氨进入水生生物体内后，对酶水解反应和膜稳定性产生明显影响，表现出呼吸困难、不摄食抵抗力下降、惊厥、昏迷等现象，影响水生生物的生理、生化指标与生长状况严重时可导致养殖生物大批死亡，造成经济损失。氨氮对水生生物的危害机理目前还不是很清楚^[6]，一般比较认同的解释是认为高浓度的氨氮会取代生物体内的钾离子，影响神经，引起N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体结合活性明显降低，导致中枢神经系统中流入过量的钙离子并引起细胞死亡。有研究表明巨大芽孢杆菌在24h内的氨氮降解率最高^[7]，而本实验中的类球红细菌合剂在60小时内对氨氮都有很高的降解率,高效降解氨氮的持续时间比巨大芽孢杆菌高效降解氨氮的持续时间要长36小时。

4.2小结

类球红细菌与枯草芽孢杆菌均能分解水体有机物、控制水体氮含量，起到净化水质的作用，并且无污染、高效率，是比较理想的净化水质的生物制剂。本实验通过对类球红细菌配合常用细菌——枯草芽孢杆菌制成的合剂的氨氮降解功能及其最佳组合比例的研究，证实了类球红细菌与枯草芽孢杆菌都能起到降解氨氮的效果，并且通过对两菌合剂的最佳配合比例的试验，发现在氨氮去除方面类球红细菌比例大的组别要比枯草杆菌比例大的组别效果要好，当两者的组合比例为1∶1时，氨氮的残留浓度是最低的，即氨氮被降解的量是最多的，这说明在此比例时，类球红细菌合剂对氨氮的降解能力最强，其降解氨氮的能力发挥最佳，因此我们可以将之运用于畜禽养殖废水处理、水产养殖等，用最低的投资成本来达到最好的净化效果。

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Claims

1.一种具有氨氮降解能力的菌合剂，其特征在于，它是由枯草芽孢杆菌CCTCC No：M2013490与类球红细菌CCTCC No：M2013491按细菌数1：1的混合物。

2.权利要求1所述的具有氨氮降解能力的菌合剂在降解水体中氨氮的应用。

3.权利要求1所述的具有氨氮降解能力的菌合剂在治理水产养殖水体中的应用。