CN105861393A - 类球红细菌k73菌株及其在地表水体生态净化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物应用领域，具体而言，涉及一株可用于地表水生态净化的细菌菌株及含有该菌株细菌的菌剂和应用。本发明提供了一株细菌菌株，所述菌株为类球红细菌K73，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12310；保藏时间为：2016年3月28日。该菌株可以有效地降低水体中的氮和磷等物质含量、明显提高水体透明度，达到提高水体水质的技术效果。与传统的基于动植物的水体生态净化技术相比，该菌株的使用以及管理方式更为简单；与传统的基于微生物菌剂的水质净化技术相比，该菌株的生态净化效果更加明显；与传统的物理或化学方面的处理手段相比，其没有生态副作用，而且净化成本低。

Description

类球红细菌K73菌株及其在地表水体生态净化中的应用

技术领域

本发明涉及微生物应用领域，具体而言，涉及一株类球红细菌K73菌株及其在地表水体生态净化中的应用。

背景技术

在完成截污纳管和雨污分流的地区，因为大气降尘和面源污染等原因，地表水体也经常处于一个发黄发绿甚至发黑发臭的状态。

为了保持一个好的水环境，各种水处理技术都在发展和使用，其中人为构建以水生动植物为主体的水体生态系统来净化水质是比较流行的一种形式，得到了比较普遍的应用。然而，以水体动植物为主的生态净化手段有费用低、绿色环保等优点，但维护管理比较麻烦、受气候影响比较大、净化能力较弱、抗水质波动能力较低。

另外，针对地表水的净化技术，也有一些物理或化学方面的处理手段，比如过滤、吸附、絮凝等。但是该几种方法(过滤、吸附以及絮凝)都难以在一个稍微长的时间内保持比较好的净化效果，而且该几种技术费用往往比较高，并存在一些副作用。此外，对于一些富含氮、磷的水体，其非常容易由于水体富营养化而导致藻类爆发性生长，采用常规的物化法虽然可以对水体中悬浮有机物等具有较好的去除效果，但是，对溶解性有机物的去除率却很低，难以有效地降低水中有机物污染。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

基于现有技术中，水体净化所存在的净化成本高、水体污染物难去除等问题，本发明的第一目的在于提供一株能够有效净化地表水的新菌株，该菌株可以有效地利用水体中的动物排泄物、动植物残骸的分解产物以及其他悬浮或溶解于水的污染物，进而有效地分解或去除水体中的污染物，达到降低水体中的氮和磷浓度、明显改善水体的透明度的技术效果。

本发明的第二目的在于提供一种含有该菌株的微生物菌剂，从而使得该菌株在水体净化的应用更加方便和有效。

本发明的第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法，该制备方法中，通过将菌株菌种逐步放大操作从而实现微生物菌株的制备，制备方法简单易行，而且由于培养液选择合理，所获的菌剂活菌数高，并且所获的微生物菌剂还可短时间保存，并方便运输。

本发明的第四目的在于提供上述微生物菌株以及菌剂的用途，用于克服水体富营养化和提高水质，尤其可用于透明度较差的水体净化中，效果非常显著。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一株可用于水体净化的新菌株，所述菌株为类球红细菌K73，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.12310；保藏时间为：2016年3月28日。

该菌种拉丁学名为Rhodobacter sphaeroides，中文学名为类球红细菌，菌株名为K73，来源于北京小清河河底淤泥中。

经过鉴定，该类球红细菌属于变形菌门α变形菌纲红细菌目红细菌科红细菌属细菌，其具有广泛的能量代谢机制，在光照条件下能光合作用，在黑暗条件下好氧生长；可充分利用水体中的动物排泄物、动植物残骸的分解产物以及其他悬浮或溶解于水的污染物，从而达到去除水中污染物、提高水质的效果。通过该菌株，可实现对水体进行微生物净化的处理效果，其来源知悉后，后续扩大培养的方式简单，并在应用的过程中，将制备的菌剂施加到待处理的水体中即可，其去磷效果比较明显，更为关键的是，其提高水体透明度的效果非常明显。

与传统的基于动植物的水体生态净化技术相比，该菌株的使用以及管理方式更为简单；与传统的基于微生物菌剂的水质净化技术相比，该菌株的生态净化效果更加明显；与传统的物理或化学方面的处理手段相比，其没有生态副作用，而且净化成本低。

上述的经过分离纯化的类球红细菌，其单个细胞为放线状，在光照厌氧、黑暗好氧及微好氧条件均能生长，液体培养物由最初的浅黄色变为棕红色，瓶底和瓶壁出现少量的棕红色沉淀物，在固体培养基上形成2-3mm的点状菌落、边缘整齐。

另外，对于该菌株，经过纯化后测序，其16S rRNA基因序列如SEQ IDNO:1所示。含有该序列的经过纯化的培养物，其与相同的种间微生物细菌相比，其可以实现水体的净化效果，尤其是对提高水体透明度有非常高的应用效果。

含有所述的水体净化菌株的微生物菌剂也属于本申请要求保护的范围。对于该菌株而言，是只要能够加入到需要净化的水体即可发挥净化的效果。然而在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将其扩大培养制成微生物菌剂的形式以扩大其应用范围。

上述的微生物菌菌剂，优选为液体菌剂，该液体菌剂中，培养液可优选为LB液体培养基、或者进一步添加葡萄糖、硫胺素、生物素和烟酸等营养物。

对于该微生物菌剂而言，通过适宜的培养液扩大培养后即可得到微生物菌剂。更为优选的，在微生物菌剂(一般为液态)中，为了保证水体净化的效果，以实现良好的降低氮磷等元素以及提高水体透明度的效果，活菌的数量优选为1×10^10-11CFU/ml。

本发明基于上述的液态微生物菌剂提供了一种制备方法，包括如下步骤：

1)、将含有所述类球红细菌的菌种接种于LB液体培养基中进行培养，得到培养液；

2)、将所述培养液中的细菌培养物过滤浓缩，得到液体菌剂。

该方法中，将类球红细菌的菌种接入LB培养基培养获得菌液，再将菌液进行扩大培养，再经过浓缩即可获得。整个微生物菌剂的制备方法简单，可以短时间保存和方便运输，使用的时候直接以一定的比例添加到待净化的水体中，使用非常方便。

需要注意的是，在保存和运输的过程中，为了保证菌液中细菌的存活，应尽量减少保存和运输的时间，且避免高温和日晒。

此外，具体的，对于上述的LB液体培养基，其组成如下：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5-10g/L，pH 7.0左右，使用前进行灭菌操作，以防止杂菌污染。

优选的，对于上述的制备方法，优选的，在步骤1)和步骤2)中，其制备方法可包括：

将该菌株菌种接种至LB液体培养基获得菌液，然后将获得的菌液再次接入LB液体培养基中进行放大培养即得；且，以体积百分比计，所述菌液接种量为5-10％。

在扩大培养的过程中(即步骤1的操作)，为了快速有效地实现菌体的大量增殖，优选的，在步骤1)中，所述培养具体包括：将接种有菌液的LB液体培养基搅拌并曝气，并于28-32℃培养48-72小时。

通过不断的搅拌以及曝气的操作，从而增大菌体与空气的接触面积，以保证菌体能够快速高效繁殖。另外，再通过28-32℃培养48-72小时，即可达到菌体增殖的峰值，此时的培养液中含有大量的活菌体，在进行后续培养，活菌数基本不再增加，因此综合考量时间成本、培养效率之后，确定28-32℃培养48-72小时的培养条件。

通过步骤1)的操作后，需要对细菌培养物进行过滤浓缩处理；优选的，在步骤2)中，过滤浓缩的过程中采用400目的滤网进行。因所滤出的细菌因容易脱水死亡、不方便保存，所以应将滤出的细菌洗入适量LB培养基中保存。

通过上述的操作之后，细菌培养物被浓缩以减小体积来方便保存和运输，同时也减少了使用时投放至水体中的培养基营养物。制成的菌剂中活菌含量相应较高，其可以直接应用，也可以在使用时应采用待处理水体中的地表水进行稀释再应用。

可选的，所述微生物菌剂为固体菌剂，所述固体菌剂由所述类球红细菌附加固态载体制备而成。

可选的，所述固态载体包括滑石粉、细沙以及粘土中的一种或多种；其中以滑石粉作为优选载体。

一种所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将经过纯化后得到的所述类球红细菌混于固态载体中既得。

所述的细菌菌株在作为地表水体净化菌株中的应用；优选的，所述地表水体为透明度较低的水体。

所述的微生物菌剂在净化地表水体中的应用；优选的，所述地表水体为透明度较低的水体。

在应用的过程中，需要将该液体菌剂经过稀释或者直接泼洒到需要生态净化的地表水中，以实现水体净化的效果。

鉴于上述的菌剂其在降低水体中磷含量以及提高水体透明度(即降低水体浊度)等方面具有非常好的应用效果，优选的，所净化的水体为磷含量较高的水体或者透明度较低的水体。

另外，在具体使用的过程中，可选的，将液体菌剂按一定比例稀释到一定体积的地表水中，然后投放或泼洒到需要生态净化的地表水中，以方便投放或泼洒均匀。

在使用过程中，该菌剂的使用量的选择可根据水体的污染程度适应选择，如可以选择原培养液体积:待处理水体体积为千分之一的比例加入到待净化的水体中。

另外，在应用的过程中，优选在待净化水体中的水生植物已经种植完毕但水生动物尚未投放的时机进行喷洒菌液。也可以在气温骤然升高、日照骤然加强的时间进行投放菌液以避免藻华发生；且出于强化效果的目的，可以多次泼洒，也可以在待净化的水体中增加曝气装置以促进细菌的水质净化效果。所泼洒的细菌在水体生态系统中汇入正常的水体物质和能量流动和循环，不需要回收和控制手段。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、提供了一株可应用于地表水体净化的菌株，该菌株具有较为宽泛的生长条件，可有效地实现水体净化的目的，为地表水体的净化提供了一种新的途径。

2)、该菌株具有广泛的能量代谢机制，在光照条件下能光合作用，在黑暗条件下好氧生长；可充分利用水体中的污染物质来生长，具有良好的水体净化效果，尤其适合降低水体的磷含量，可有效地提高水体的透明度。

3)、本发明提供的以类球红细菌或者其菌液净化水体的方式，其与传统的基于动植物的水体生态净化技术相比，该菌株的使用以及管理方式更为简单；与传统的基于微生物菌剂的水质净化技术相比，该菌株的生态净化效果更加明显；与传统的物理或化学方面的处理手段相比，其没有生态副作用，而且净化成本低。

4)、该类球红细菌在扩大培养的过程中，所用的培养基成分简单，而且生长条件易于控制，因此非常易于实现菌剂的制备，为其大规模地应用到水体净化领域中提供了基础。

本申请提供的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，菌株名为K73，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间为：2016年3月28日，保藏编号CGMCC NO.12310。经保藏中心于2016年3月28日检测为存活菌株。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种含有水体净化菌株的微生物菌剂及其制备方法，该方法包括如下步骤：

S11：将类球红细菌菌种加入少量LB液体培养基中于28℃培养60小时获得菌液。将获得的菌液以5％的体积比接种于LB液体培养基中于28℃培养60小时，得到放大培养液；

S12：将放大培养液采用400目的滤网过滤，并将滤得的菌洗入适量LB液体培养基中，得到液体菌剂。

其中，所述及到的LB液体培养基含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5-10g/L，pH 7.0，使用前均进行灭菌处理。

实施例2

本实施例提供了含有水体净化菌株的微生物菌剂及其制备方法，该方法包括如下步骤：

S21：类球红细菌的分离纯化；

具体的，在该步骤中，以北京小清河的河底淤泥为样本，将所取的样本进行梯度稀释后涂平板培养，其中所用培养基为固态的LB培养基；最后收集经过培养后得到的单菌落，得到类球红细菌。

对于所收集得到的类球红细菌，采用常规方法扩增其16srRNA，并进行测序，其序列如SEQ ID NO:1所示。

S22：分离纯化后的类球红细菌制成菌液；

在S22步骤中，将S21步骤中分离纯化后的单菌落接入少量到LB液体培养基中于25-30℃下培养，即得菌液。

S23：将含有类球红细菌的菌液以8％的体积比接种于LB液体培养基中，搅拌并曝气，且于30℃培养60小时，得到培养液。

S24：将所述培养液采用400目的滤网过滤，并将滤得的菌洗入LB液体培养基中，得微生物菌剂。

该步骤中，所用的LB液体培养基的体积为步骤中S22中所用LB液体培养基体积的10％。

其中，所述及到的LB液体培养基含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5-10g/L，pH 7.0，使用前于121℃高压蒸汽灭菌。

实施例3

本实施例提供了一种含有水体净化菌株的微生物菌剂及其制备方法，该方法包括如下步骤：

S31：将分离纯化后的类球红细菌制成菌液；

在S31步骤中，所用到的单菌落为实施例2中步骤S21提供；

将S21步骤中分离纯化后的单菌落接入到少量LB液体培养基中于28-30℃下摇瓶培养60小时，即得菌液。

S32：将含有类球红细菌的菌液以6％的体积比接种于LB液体培养基中于32℃培养65小时，得到培养液；

S33：将所述培养液采用400目的滤网过滤，并将滤得的菌洗入LB液体培养基中，得微生物菌剂。

其中，所述及到的LB液体培养基含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5-10g/L，pH 7.0，使用前均进行灭菌处理。

实施例4

本实施例提供了一种含有水体净化菌株的微生物菌剂及其制备方法，该方法包括如下步骤：

S41：将分离纯化后的类球红细菌制成菌液；

在S41步骤中，所用到的单菌落为实施例2中步骤S21提供；

将S21步骤中分离纯化后的单菌落接入到少量LB液体培养基中于25-28℃下培养60小时，即得菌液。

S42：将含有类球红细菌的菌液以7％的体积比接种于LB液体培养基中于30℃培养65小时，得到培养液；

S43：将所述培养液采用400目的滤网过滤，并将筛得的菌洗入LB液体培养基中，得微生物菌剂。

该步骤中，所用的LB液体培养基的体积为步骤中S42中所用LB液体培养基体积的10％。

其中，所述及到的LB液体培养基含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5-10g/L，pH 7.0，使用前均进行灭菌处理。

实施例5

本实施例提供了一种含有水体净化菌株的微生物菌剂及其制备方法，该方法包括如下步骤：

S51：将分离纯化后的类球红细菌制成菌液；

在S51步骤中，所用到的单菌落为实施例2中步骤S21提供；

将S21步骤中分离纯化后的单菌落接入到少量LB液体培养基中于26-28℃下摇瓶培养，即得菌液。

S52：将含有类球红细菌的菌液以9％的体积比接种于LB液体培养基中于32℃培养70小时，得到培养液。

S53：将所述培养液采用450目的滤网过滤，并将筛得的菌洗入LB液体培养基中，得微生物菌剂。

该步骤中，所用的LB液体培养基的体积为步骤中S52中所用LB液体培养基体积的8％。

其中，所述及到的LB液体培养基含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5-10g/L，pH 7.0，使用前均进行灭菌处理。

实施例6

本实施例提供了一种含有水体净化菌株的微生物菌剂及其制备方法，该方法包括如下步骤：

S61：将分离纯化后的类球红细菌制成菌液；

在S61步骤中，所用到的单菌落为实施例2中步骤S21提供；

将S21步骤中分离纯化后的单菌落接入到少量LB液体培养基中于28℃下摇瓶培养，即得菌液。

S62：将含有类球红细菌的菌液以10％的体积比接种于LB液体培养基中于30℃培养72小时，得到培养液。

S63：将所述培养液采用400目的筛网过滤，并将筛得的菌洗入LB液体培养基中，得微生物菌剂。

该步骤中，所用的LB液体培养基的体积为步骤中S62中所用LB液体培养基体积的6％。

其中，所述及到的LB液体培养基含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5-10g/L，pH 7.0，使用前均进行灭菌处理。

需要强调的是，在上述实施例中，过滤后再加入少量的LB液体培养基培养的目的是为了方便保存。

实施例7

本实施例提供了一种固体菌剂及其制备方法，具体包括以下步骤：

将上述实施例2制成的液体菌剂按照每1千克液体菌剂配20克滑石粉(作为固体载体)的比例加入至滑石粉中充分搅拌混匀，过滤、干燥、粉碎，即得固体菌剂。

实施例8

本实施例中，制备操作同实施例7，与实施例7不同的是，在本实施例中，所用的固体载体为滑石粉、细沙以及粘土等比例的混合物。

实验例1

将实施例2中所制成的微生物菌剂作为实验菌剂进行应用(具体的，所制成的液体菌液以千分之一的体积比加入)，单独使用于某河道河水，在投放后第8天，统计高锰酸盐指数、总氨、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐等指标，从而监测其净化水体的效果。

表1实施例2水体净化检测数据

在表1中，处理1和处理3为加入了实验菌剂后的检测结果，而处理2和处理4则作为对照，未加入任何处理菌剂。其中，处理1和处理2为第1天(大概加菌6个小时后取水样)，处理3和处理4为第8天取水样。每个处理由三个水样同比例混合而成。监测标准为《水和废水监测分析方法(第四版)》。

通过表1的数据可知，经过净化处理后，相对对照组，实验组的高锰酸盐指数、总氨、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐下降3-6％，总磷下降17％，浊度下降33％。

实验例2

将实施例5中所制成的微生物菌剂作为实验菌剂进行应用(具体的，所制成的液体菌液以千分之一的体积比加入)，单独使用于某地表水生态修复水体(已经进行了以动植物为主的生态净化)，在投放后第8天，统计高锰酸盐指数、总磷、氨氮以及浊度等指标，从而监测其净化水体的效果。

表2实施例5水体净化检测数据

其中，在表2中，处理1为加菌当天原水水质，处理2为投放后第8天对照组水质(未加入任何处理菌剂)，处理3为实验组第8天水质。每个处理的水样由三个水样同比例混合。监测标准为《水和废水监测分析方法(第四版)》。

通过表2可知，在投放后第8天，相对对照组，实验组的高锰酸盐指数、总氨、氨氮下降10％，总磷下降18％，浊度下降57％。

以上实验例表明，通过投放本发明提供的细菌，对总磷的去除作用比较明显，而磷往往是水体富营养化和藻类爆发性生长的限制性因素，所以该细菌对水体生态净化效果良好。同时，该细菌的投放对减小水体浊度、提高透明度效果非常明显。

还需说明的是，本发明分离纯化的这种类球红细菌，在自然环境的生存能力较强，此外其还具有多种生理功能，如硫化物氧化、固碳、固氮和脱氮，将该菌或者菌剂应用到水体净化后，适应性非常广，可以满足处理各种生境的污染水体，进一步的使得该菌株在水体净化领域得到推广。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一株细菌菌株，其特征在于，所述菌株为类球红细菌K73，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.12310；保藏时间为：2016年3月28日。

2.如权利要求1所述的细菌菌株，其特征在于，所述菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.含有要求1或2所述的细菌菌株的微生物菌剂。

4.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该液体菌剂中，活菌的数量是1×10^10-11CFU/ml。

5.一种如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将类球红细菌K73的菌种接种于LB液体培养基中进行培养，得到培养液；

将所述培养液中的细菌培养物过滤浓缩后，得到液体菌剂。

6.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固体菌剂，所述固体菌剂由所述类球红细菌附加固态载体制备而成。

7.如权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述固态载体包括滑石粉、细沙以及粘土中的一种或多种。

8.一种如权利要求6或7所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将经过纯化后得到的所述类球红细菌混于固态载体中既得。

9.权利要求1或2所述的细菌菌株在净化地表水体中的应用。

10.权利要求3、4、6或7所述的微生物菌剂在净化地表水体中的应用。