CN106754578B - 一株氯霉素降解菌株lms-cy及其生产的菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株氯霉素降解菌株LMS‑CY及其生产的菌剂和应用。该菌株LMS‑CY为革兰氏反应阳性菌，经鉴定为类诺卡氏菌属(Nocardioides sp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年10月24日，保藏编号为CCTCC NO:M 2016591。本发明经分离筛选获得的氯霉素降解菌株LMS‑CY，能将无机盐培养基中的氯霉素残留降解90％以上，同时该菌株制备的降解菌剂能在短时间内降解土壤或水体中氯霉素残留达85％以上，解决残留氯霉素对土壤水体环境、农作物和人体健康的危害问题。

Description

一株氯霉素降解菌株LMS-CY及其生产的菌剂和应用
技术领域
本发明涉及环境污染微生物修复，具体涉及一株氯霉素降解菌株LMS-CY及其生产的菌剂和应用。
背景技术
抗生素作为一类抗菌性药物广泛用于预防和治疗人类和动物疾病，并且在畜牧和水产养殖业中用于促进动物的生长，进入人和动物体内的抗生素不能被生物体完全吸收，部分以原药或代谢物的形式经由尿液和粪便排出体外进入环境中，造成环境染。由于进入环境的抗生素残留对生态环境和人类健康构成威胁，其残留危害日益收到广泛关注。氯霉素是一种广谱抗菌药，对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用，被广泛应用于人类以及动物的疾病治疗，特别对各类家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品的各种传染性疾病的控制和治疗起重要作用。中国科学院广州化学地球研究所调查结构显示2013年我国氯霉素的使用总量为1230吨。随着氯霉素使用量的不断增加，进入环境的氯霉素残留问题也日趋严重。进入土壤的氯霉素及其分解产物往往会从土壤进入地下水，造成生产、生活水源的污染。目前，环境中氯霉素残留的去除主要是物理化学方法，如光催化降解、电化学氧化还原技术、零价双金属纳米颗粒吸附法、臭氧氧化法、微波辐射法等，这些方法往往能耗大，成本高。相比之下，微生物修复方法无二次污染、成本较低，是比较理想的消除环境中氯霉素污染的方法。
国内外对氯霉素抗生素降解菌的报道较少，目前已报道的降解菌仅有假单胞菌属、克雷伯氏菌属、嗜血杆菌属。由于目前报道的氯霉素降解菌株很少，制约了氯霉素污染环境微生物修复技术的进一步发展和应用。因此，驯化筛选氯霉素高效降解菌株，研究其生物学特性与降解特性，并应用于氯霉素污染环境的生物治理，对于治理和修复氯霉素污染具有重要意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一株氯霉素降解菌株LMS-CY，该菌株可以降解氯霉素残留；本发明的另一目的是提供该氯霉素降解菌株生产的降解菌剂及其应用；该菌株制备的降解菌剂可在短时间内使土壤或水体环境中残留的氯霉素降解。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一株氯霉素降解菌株LMS-CY，经鉴定为类诺卡氏菌属(Nocardioides sp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏时间为2016年10月24日，保藏编号为CCTCC NO:M2016591。菌株LMS-CY在LB固体平板上菌落形态为奶油白、菌落边缘光滑，中间略微凸起。菌株LMS-CY无鞭毛，大小为0.3-0.7μm×1.0-1.6μm，革兰氏反应阳性，可以抗大观霉素、头孢氨苄、林可霉素、青霉素。
本发明所述的菌株LMS-CY在降解氯霉素中的应用。降解菌株LMS-CY 16h能将无机盐培养基中的氯霉素残留降解90％以上。
进一步地，菌株LMS-CY在降解土壤或水体环境中氯霉素的应用。
本发明所述的菌株LMS-CY生产的降解菌剂。
本发明所述菌株LMS-CY生产的降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将降解菌株LMS-CY培养到对数期的试管液接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期，制得发酵菌种；
(2)将上述制得发酵菌种接种于种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；
(3)将种子液接种于生产罐的培养基中培养发酵，发酵完成后的培养液即为降解菌剂。
其中，步骤(1)中所述接种为按发酵培养基体积的0.5-1.5％接种量进行接种；步骤(2)中所述接种为按种子罐的培养基体积的5-10％接种量进行接种；步骤(3)中所述接种为按生产罐的培养基体积的8-10％接种量进行接种。
进一步地，在步骤(2)所述种子罐和步骤(3)所述生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:(1-1.3)，搅拌速度为180-250rpm，培养温度为27-30℃；步骤(2)和步骤(3)的培养全流程时间为48-72小时。
其中，发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、NaCl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，pH7.2-7.5。
本发明所述的降解菌剂在降解氯霉素中的应用。
进一步地，所述降解菌剂在降解土壤或水体环境中氯霉素的应用。
有益效果：与现有技术相比较，本发明经分离筛选获得氯霉素降解菌株LMS-CY，能将无机盐培养基中的氯霉素残留降解90％以上，同时该菌株制备的降解菌剂能在短时间内降解土壤或水体中高浓度的氯霉素残留达85％以上，解决残留氯霉素对土壤水体环境、农作物和人体健康的危害问题。
本发明的降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适用于畜禽养殖厂周围受氯霉素污染的土壤与水体修复，以及氯霉素制药厂的废水处理；本发明对于保护生态环境，保护人体的身体健康具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明的菌株LMS-CY的菌落照片；
图2为本发明的菌株LMS-CY的透射电镜照片；
图3为菌株LMS-CY 16h降解氯霉素的HPLC分析图谱(A：CK；B：12h处理；C：16h处理)；
图4为不同温度对菌株LMS-CY降解氯霉素的影响；
图5为不同pH对菌株LMS-CY降解氯霉素的影响；
图6为不同重金属离子对菌株LMS-CY降解氯霉素的影响；
图7为不同接种量对菌株LMS-CY降解氯霉素的影响；
图8为不同初始浓度对菌株LMS-CY降解氯霉素的影响。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
菌株LMS-CY的分离和鉴定：
采集长期受氯霉素污染的土壤，取15g土壤样品置于100mL添加100mg/L氯霉素的无机盐液体培养基(NH4NO3 1.0g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO40.2g，NaCl 1.0g，水1000mL，pH 7.0-7.2)中，30℃、150r/min培养7天，以5％的接种量转接到相同的添加50mg/L氯霉素的无机盐液体培养基，连续转接4次。通过紫外分光光度计和液相色谱法测定富集液氯霉素降解效果，获得有降解效果的富集液。取0.5mL有效果的富集液，10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释，每个梯度的稀释富集液取100μL涂布在含有100mg/L氯霉素的无机盐固体培养基平板上，30℃培养7d。挑取平板上长出的单菌落接种于液体LB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0-7.2)试管中，30℃、165r/min培养2天，取1mL LB培养液，5000rpm离心5min，无菌水洗去LB培养基后，取1mL无菌水重悬菌体，接种至加有50mg/L氯霉素的无机盐液体培养基中，30℃、165r/min培养3d，通过紫外分光光度计和高效液相色谱检测降解效果。对氯霉素有降解效果的菌株即为降解菌株。
紫外分光光度计降解效果的验证方法：采用UV-1700微量紫外分光光度计测定氯霉素的质量浓度。往待测降解菌液中加入等量体积的乙酸乙酯，剧烈振荡5-10min，然后静置直到水相和有机相完全分层，吸取下层水相，保留有机相，下层水相再一次用等体积的乙酸乙酯萃取，两次得到的有机相经无水硫酸钠去除残留的水分后，于紫外-可见分光光度计上在波长200-350nm范围内进行扫描。通过氯霉素在200nm-350nm处的特征吸收峰峰值的高低来判断降解液中氯霉素浓度的高低。
高效液相色谱降解效果的验证方法：在培养液中加入等体积的乙酸乙酯进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取1mL下层乙酸乙酯挥发完全后，加入1mL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。采用紫外和高效液相色谱测定提取液中氯霉素的含量，液相色谱条件：流动相已腈：水(50：5，V/V)，Zorbax C218 ODS Spherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Agilent，USA)，柱温为40℃，PDA检测器，测定波长272nm，进样量10μL，流速为1.0mL·min-1。外标法按峰面积定量。
从富集液中，通过验证得到1株氯霉素降解菌株，命名为LMS-CY。该菌株16h对100mg/L的氯霉素降解率达98％以上。菌株LMS-CY在LB固体平板上菌落形态为：奶油白、菌落边缘光滑，中间略微凸起，如图1所示。菌株LMS-CY的透射电镜照片如图2所示，无鞭毛，大小为0.3-0.7μm×1.0-1.6μm。菌株LMS-CY氧化酶为阳性，革兰氏反应阳性，可以抗大观霉素、头孢氨苄、林可霉素、青霉素。
以菌株LMS-CY的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度为1562bp的16S rDNA基因序列，如SEQ ID No：1所示。在EzTaxon数据库(www.ezbiocloud.net)中进行Blast，结果表明菌株LMS-CY与类诺卡氏菌属(Nocardioidessp.)菌株的同源性最近，与菌株Nocardioides soil mbc-2T、Nocardioides hankookensisDS-30T、Nocardioides aquiterrae GW-9T的同源性都达到97.6％以上，结合形态和生理生化特征，将菌株LMS-CY初步鉴定为类诺卡氏菌属(Nocardioides sp.)，命名为类诺卡氏菌LMS-CY(Nocardioides sp.LMS-CY)。将该菌株LMS-CY送交位于中国武汉，中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏时间为2016年10月24日，保藏编号为CCTCC NO:M2016591。
实施例2
在无机盐培养基中菌株LMS-CY对氯霉素的降解效果：
在无机盐液体培养基中降解菌株LMS-CY对氯霉素降解特性测定：挑取LMS-CY单菌落于50ml LB液体培养基中，30℃、165r/min振荡培养24h，获得新鲜菌液。将3ml培养好的新鲜菌液经6000r/min离心5min，弃去上清液，加入10ml无菌水重悬，为离心悬浮后的种子液，种子液的菌体量为6×107CFU/ml。
在无机盐培养基中加入终浓度为100mg/L的氯霉素，按3％体积比的接种量接入菌株LMS-CY的种子液；同时在无机盐培养基中加入终浓度为100mg/L的的氯霉素，按3％体积比的接种量接入灭活的菌株LMS-CY种子液作为对照，30℃恒温摇床中培养16h，采用实施例1中降解效果的验证方法通过高效液相色谱法检测菌株LMS-CY对氯霉素的降解情况，并计算降解率，如图3所示。菌株LMS-CY在16h内对氯霉素降解率可以达到98.8％以上。
实施例3
不同温度对LMS-CY降解氯霉素的影响：
在氯霉素的浓度为100mg/L的无机盐液体培养基中，以3％体积比的接种量接入菌株LMS-CY的种子液，分别在16℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃，165r/min培养16h后检测氯霉素的浓度，计算降解率。从图4可以看出，温度为30℃时氯霉素的降解率最高，为99.02％。
不同初始pH对LMS-CY降解氯霉素的影响：
在pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的无机盐液体培养基(氯霉素的浓度为100mg/L)中，以3％体积比的接种量接入菌株LMS-CY的种子液，于30℃，165r/min培养16h后检测氯霉素的浓度，计算降解率。从图5可以看出，在pH为7.0的条件下菌株LMS-CY对氯霉素降解的效果最好，为98.9％。
不同重金属离子对LMS-CY降解氯霉素的影响：
将菌株LMS-CY种子液按3％体积比接种量接种到装有100mL无机盐液体培养基中，氯霉素的浓度为100mg/L。培养基中分别加入1mmol/L重金属离子Cu2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Hg2+，置于30℃、165r/min恒温摇床培养16h后测定氯霉素浓度，计算降解率。结果如图6所示，在无重金属离子添加的培养基中，氯霉素的降解率为92.57％。在添加Mn2+、Ca2+的培养基中，氯霉素的降解率分别为86.86％、77.68％。重金属离子Hg2+、Co2+、Zn2+、Ni2+、Cu2 +对LMS-CY的降解具有不同程度的抑制作用。
不同接种量对LMS-CY降解氯霉素的影响：
将菌株LMS-CY的种子液分别按照0.5％、1％、2％、4％、6％、8％体积比的接种量接种到浓度为100mg/L无机盐液体培养基中，于30℃，165r/min培养48h，每隔6h测定氯霉素的浓度，计算降解率。由图7可见，氯霉素降解率与接种量成正相关。接种量为2％时，48h菌株LMS-CY对100mg/L氯霉素降解率为95％以上，当接种量达为4％时，18h菌株LMS-CY对100mg/L氯霉素降解率为95％以上。
不同初始浓度对LMS-CY降解氯霉素的影响：
在氯霉素的浓度分别为50、100、150、200、250、300mg/L的无机盐液体培养基中，以3％体积比的接种量接入菌株LMS-CY的种子液，于30℃，165r/min摇床振荡培养48h，每隔6h测定氯霉素浓度，计算氯霉素降解率。如图8所示，当氯霉素初始浓度小于150mg/L时，菌株LMS-CY的降解效率高，降解速度较快。当浓度高于150mg/L时氯霉素的降解速度变慢。
实施例4
菌株LMS-CY的降解菌剂的制备
1)将将实施例1分离筛选的降解菌株LMS-CY接种到含3mL的LB(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0-7.2)试管中培养到对数期，将试管液按0.5％体积比的接种量接种于100mL发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养至对数期，制得发酵菌种；
2)将上述制得发酵菌种按5％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种于装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养(培养基已经121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养至对数生长期，培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8，搅拌速度为180rpm，培养温度为30℃；制得种子液；
3)将种子液按8％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接入装液量为70％的5000升生产罐的培养基中培养发酵(生产罐培养基已经在1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养发酵过程中无菌空气的通气量为1:1.3，搅拌速度为250rpm，培养温度为27℃，培养全流程时间为48小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型即为降解菌剂。
其中，发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、NaCl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，pH7.2-7.5。
实施例5
菌株LMS-CY的降解菌剂的制备
1)将将实施例1分离筛选的降解菌株LMS-CY接种到含3mL的LB(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0-7.2)试管中培养到对数期，将试管液按1.5％体积比的接种量接种于100mL发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养至对数期，制得发酵菌种；
2)将上述制得发酵菌种按10％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种于装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养(培养基已经121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养至对数生长期，培养过程中无菌空气的通气量为1:1，搅拌速度为200rpm，培养温度为27℃；制得种子液；
3)将种子液按10％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接入装液量为70％的5000升生产罐的培养基中培养发酵(生产罐培养基已经在1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养发酵过程中无菌空气的通气量为1:1，搅拌速度为200rpm，培养温度为30℃，培养全流程时间为72小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型即为降解菌剂。
其中，发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、NaCl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，pH7.2-7.5。
实施例6
菌株LMS-CY降解菌剂对土壤中氯霉素的降解效果测定：
称取多份50g土壤，风干过筛，加入氯霉素，使土壤中氯霉素浓度为10mg/kg，加入实施例4或5制备的LMS-CY降解菌剂混匀，使土壤中的LMS-CY浓度为1.2×1010个细胞/克土，处理组都设有相应不加LMS-CY降解菌剂以及加入相同体积灭活LMS-CY降解菌剂的土壤为对照，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，期间土壤的持水量保持在60％，第4天取样测定氯霉素在土壤中的残留量，每组做平行实验3次，利用高效液相色谱测定残留量，计算多次平均降解率，结果见表1。
表1菌株LMS-CY降解菌剂对土壤中对氯霉素残留的降解效果
由表1可见，土壤中氯霉素浓度为10mg/kg时降解菌LMS-CY对氯霉素的降解率达到85.7％，并且对照中的氯霉素没有被降解。结果表明，LMS-CY降解菌剂可有效降解土壤中的氯霉素残留。
实施例7
菌株LMS-CY降解菌剂对水体中氯霉素的降解效果测定：
取多份100mL氯霉素制药厂废水，过滤后，调整氯霉素含量，使水体中氯霉素浓度分别为10mg/L(处理)，加入实施例4或5制备的LMS-CY降解菌剂混匀，使水体中的LMS-CY浓度为1.2×1010个细胞/毫升水，处理组都设有相应不加LMS-CY降解菌剂以及加入相同体积灭活LMS-CY降解菌剂的水体为对照，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，第2天取样测定氯霉素在水体中的残留量，每组做平行实验3次，利用高效液相色谱测定残留量，计算多次平均降解率，结果见表2。
表2菌株LMS-CY降解菌剂对水体中对氯霉素残留的降解效果
由表2可见，水体中氯霉素浓度为10mg/L时降解菌LMS-CY对氯霉素的降解率达到88.9％，并且对照中的氯霉素没有被降解。结果表明LMS-CY降解菌剂可有效降解水体中的氯霉素残留。
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<212> DNA
<213> 类诺卡氏菌属（Nocardioides sp.）
<400> 1
attagaactc ggtacgcgcg gatcttccag agattagagt ttgatcctgg ctcaggacga 60
acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgagcggaaa ggccctttcg ggggtactcg 120
agcggcgaac gggtgagtaa cacgtgagta atctgccctt ggctttggga taactatcgg 180
aaacggtggc taataccgga tacgacctat cactgcatgg tgtgttggtg gaaagttttt 240
tcggctgggg atgtgctcgc ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc ctaccaaggc 300
ttcgacgggt agccggcctg agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 360
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcggaagcct gatccagcaa 420
cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagtaccg acgaagcgcc 480
gatgatggtg gtgacggtag gtacagaaga agcaccggcc aactacgtgc cagcagccgc 540
ggtaatacgt agggtgcgag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgtaggcgg 600
tttgtcgcgt cgggagtgaa aacccagggc ttaactctgg gcttgctttc gatacgggca 660
gactagaggc atgcagggga gaacggaatt cctggtgtag cggtgaaatg cgcagatatc 720
aggaggaaca ccggtggcga aggcggttct ctgggcatgt cctgacgctg aggagcgaaa 780
gtgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac accgtaaacg ttgggcgcta 840
ggtgtgggat ccattccacg ggttccgtgc cgcagctaac gcattaagcg ccccgcctgg 900
ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga 960
gcatgcggat taattcgatg caacgcgaag aaccttacct gggtttgaca tacaccggaa 1020
agctgcagag atgtggcccc tttttgctgg tgtacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct 1080
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgtcc tatgttgcca 1140
gcgggttatg ccggggactc ataggagact gccggggtca actcggagga aggtggggat 1200
gacgtcaagt catcatgccc cttatgtcca gggcttcacg catgctacaa tggccggtac 1260
aaagggccgc gatgctgtaa ggcggagcga atcccaaaaa gccgatctca gttcggattg 1320
gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc agcaacgctg 1380
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa gtcggcaaca 1440
cccaaagcca gtggcctaac ccttgtgggg ggagctgtcg aaggtggggc t 1491

Claims (10)

1.一株氯霉素降解菌株LMS-CY，经鉴定为类诺卡氏菌属(Nocardioides sp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年10月24日，保藏编号为CCTCC NO:M2016591。
2.如权 利要求1所述的菌株LMS-CY在降解氯霉素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌株LMS-CY在降解土壤或水体环境中氯霉素的应用。
4.一种利用权利要求1所述的菌株LMS-CY生产的降解菌剂。
5.一种权利要求4所述的降解菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将降解菌株LMS-CY培养到对数期的试管液接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期，制得发酵菌种；
(2)将上述制得发酵菌种接种于种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；
(3)将种子液接种于生产罐的培养基中培养发酵，发酵完成后的培养液即为降解菌剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述接种为按发酵培养基体积的0.5-1.5％接种量进行接种；步骤(2)中所述接种为按种子罐的培养基体积的5-10％接种量进行接种；步骤(3)中所述接种为按生产罐的培养基体积的8-10％接种量进行接种。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)所述种子罐和步骤(3)所述生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:(1-1.3)，搅拌速度为180-250rpm，培养温度为27-30℃。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)的培养全流程时间为48-72小时。
9.如权利要求4所述的降解菌剂在降解氯霉素中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述降解菌剂在降解土壤或水体环境中氯霉素的应用。
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