CN101548007A - 可同化降解氯化、甲硫基化以及甲氧基化三嗪类农药的新型微生物 - Google Patents
可同化降解氯化、甲硫基化以及甲氧基化三嗪类农药的新型微生物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供能够降解作为农药等常用的甲硫基化三嗪类化合物(特别是西草净、排草净或扑草净)、氯化三嗪类化合物(特别是西玛津、莠去津或扑灭津)以及甲氧基化三嗪类化合物(特别是西玛通、莠去通、扑灭通)等的新型微生物,以及使用该微生物降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的方法。本发明提供具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物能力的新型细菌类诺卡氏菌属MTD22株,以及使用该细菌降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的方法,特别是降解西草净、排草净、扑草净、西玛津、莠去津、扑灭津、西玛通、莠去通和/或扑灭通等的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有降解选自甲硫基化三嗪类化合物(西草净(simetryn)、莠灭净(ametryn)、扑草净(prometryn)、排草净(dimethametryn)、敌草净(desmetryne)以及特丁净(terbutryn))、氯化三嗪类化合物(西玛津(simazine)、莠去津(atrazine)、扑灭津(propazine)以及特丁津(terbuthylazine))、以及甲氧基化三嗪类化合物(西玛通(simetone)、莠去通(atraton)以及扑灭通(prometon))的组中的至少1种物质的能力的新型微生物,更详细地说,涉及一种属于类诺卡氏菌(Nocardioides)属的微生物,还涉及使用该微生物或含有该微生物的复合微生物类降解上述三嗪类化合物的方法。
背景技术
近代农业中,农药是维持、稳定产量以及减少劳动力、削减生产成本所必不可少的。但事实表明,使用的农药的一部分流入河川、湖泊、地下水、用水等,担心对整体环境中的生物造成影响。土壤中栖息着多种多样的微生物,其中存在降解农药等有机化学物质、具有无害化处理能力的微生物。但是,由于这些降解菌在自然环境中的存在密度低、并且分布也不均匀,所以通常对于有机污染物质在环境中的蓄积和扩散还没有做到防患于未然。因此认为,将这种降解菌从土壤中选择性地富集并分离培养,然后对农药等有机污染物质进行降解的方法,即所谓的生物修复(bioremediation)法是有效的方法。
多年以来,三嗪类化合物作为农药、消泡剂或染料等在世界上得到广泛应用,但是现在作为环境污染物质引起关注。已知有多种微生物降解氯化三嗪类农药莠去津(专利文献1)。另一方面,以西草净为代表的甲硫基化三嗪类农药以及以西玛通为代表的甲氧基化三嗪类农药的降解难度更高,有关通过微生物降解甲硫基化三嗪以及甲氧基化三嗪的报道有限。据报道,Cook和Hutter使用以莠灭净或扑草净作为硫源配制的合成培养基,从土壤中富集降解菌,最终挑选出增殖速度快的3种细菌(非专利文献1)。使其中的2种降解莠灭净、另外的1种降解莠灭净和扑草净,生成脱甲硫基化的代谢物。但是,并没有关于这些菌株在菌学方面的研究报道。另外,据报道,Strong等从受到高浓度莠去津污染的垃圾堆存处分离具有莠去津降解能力的金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)TC1株,表明金黄节杆菌TC1株在含有以莠灭净或扑草净作为唯一氮源的培养基中生长(非专利文献2)。另外,Shapir等将来自金黄节杆菌TC1株的莠去津降解酶基因导入大肠杆菌中,使用获得表达的酶来降解莠灭净(非专利文献3)。据报道,Topp等将类诺卡氏菌属C190株的菌体或菌体提取物分散到含有西草净、莠灭净、扑草净或特丁净的溶液中,在厌氧条件下保温静置时,确认它们被降解,生成脱甲硫基化的代谢物(非专利文献4)。另外,据报道,Seffernick等用密执安棍状杆菌(Clavibactermichiganensis)ATZ1株的菌体提取物使莠灭净脱甲硫基化(非专利文献5)。
如上所述,虽然有一些关于使用微生物降解三嗪类化合物的报道,但现状是分离株在菌学方面的研究不充分,没有表明活菌体中的降解或降解速度、降解需要其他碳源等,目前还不能说存在可以用于生物修复的菌株。
专利文献1:特开2005-27536号
非专利文献1:Cook,A.M.;Hutter,R.,1982,Appl.Environ.Microbiol.43,781-786。
非专利文献2:Strong,L.C.;Rosendahl,C.;Johnson,G.;Sadowsky,M.J.;Wackett,L.P.,2002,Appl Environ Microbiol.,68,5973-5980。
非专利文献3:Shapir,N.;Rosendahl,C.;Johnson,G.;Andreina,M.;Sadowsky,M.J.;Wackett,L.P.,2005,Appl.Environ.Microbiol.,71,2214-2220。
非专利文献4:Topp,E.;Mulbry,W.M.;Zhu,H.;Nour,S.M.;Cuppels,D.,2000,Appl.Environ.Microbiol.,66,3134-3141。
非专利文献5:Seffernick,J.L.;Johnson,G.;Sadowsky,M.J.;Wackett,L.P.,2000,Appl.Environ.Microbiol.,66,4247-4252。
发明内容
本发明的目的在于提供能够降解甲硫基化三嗪类化合物(西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净或特丁净等)、氯化三嗪类化合物(西玛津、莠去津、扑灭津或特丁津等)以及甲氧基化三嗪类化合物(西玛通、莠去通、扑灭通等)的新型微生物,以及使用该微生物降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的方法。
本发明人等发现从土壤中分离的类诺卡氏菌属的细菌中,存在具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力的细菌。另外,发现该细菌具有特征性的16S rRNA基因,从菌学性质方面看也是新型的细菌。进一步地,发现通过使用该细菌,通过单一菌株除了可以有效降解原来降解困难的西草净等甲硫基化三嗪类化合物、甲氧基化三嗪类化合物之外,还可以有效降解氯化三嗪类化合物。
因此,本发明涉及以下[1]~[13]。
[1]一种类诺卡氏菌属的细菌,其特征在于,所述细菌具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。
[2]如[1]所述的细菌,其中,所述甲硫基化三嗪类化合物为选自西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净以及特丁净的组中的1种以上。
[3]如[1]或[2]所述的细菌,其中,所述氯化三嗪类化合物为选自西玛津、莠去津、扑灭津以及特丁津的组中的1种以上。
[4]如[1]~[3]任一项所述的细菌,其中,所述甲氧基化三嗪类化合物为选自西玛通、莠去通以及扑灭通的组中的1种以上。
[5]一种类诺卡氏菌属的细菌,其中,所述细菌具有包含下述(A)或(B)的16S rRNA基因:
(A)由序列编号1所示的碱基序列构成的DNA;
(B)与序列编号1所示的碱基序列具有95%以上同一性的DNA,且具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。
[6]类诺卡氏菌属MTD22株(保藏编号FERM P-20989;保藏编号FERM BP-10849),其中,所述MTD22株具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。
[7]甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的降解方法,其中,所述方法使用了[1]~[6]任一项所述的细菌。
[8]如[7]所述的降解方法,其中,所述甲硫基化三嗪为选自西草净、莠灭净、排草净、敌草净、特丁净以及扑草净的组中的1种以上。
[9]如[7]或[8]所述的降解方法,其中,所述氯化三嗪为选自莠去津、西玛津、扑灭津以及特丁津的组中的1种以上。
[10]如[7]~[9]任一项所述的降解方法,其中,所述甲氧基化三嗪为选自莠去通、西玛通以及扑灭通的组中的1种以上。
[11]一种受到甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物污染的土壤、地下水和/或用水的净化方法,其中,所述净化方法使用了[1]~[6]任一项所述的细菌。
[12]一种用于降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物的三嗪类化合物用降解剂,其中,所述降解剂含有至少1种[1]~[6]任一项所述的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
[13]一种受到甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物污染的土壤、地下水和/或用水的净化剂,其中,所述净化剂含有至少1种[1]~[6]任一项所述的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
即,本发明涉及一种类诺卡氏菌属的细菌,其具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力,优选具有降解西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净、特丁净、西玛津、莠去津、扑灭津、特丁津、西玛通、莠去通以及扑灭通的能力。更详细地说,涉及一种类诺卡氏菌属的细菌,其具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力,优选具有降解西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净、特丁净、西玛津、莠去津、扑灭津、特丁津、西玛通、莠去通以及扑灭通的能力,其特征在于,16S rRNA基因具有序列表的序列编号1所示的碱基序列,或者以不损害降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力为限度,通过缺失、取代或添加1个或多个碱基,与序列表中序列编号1所示的碱基序列具有95%以上同源性的碱基序列。作为属于该类诺卡氏菌属的三嗪降解菌的具体例子,例如有类诺卡氏菌属MTD22株(FERM P-20989;FERM BP-10849)。
如上所述,本发明首先涉及一种类诺卡氏菌属的细菌,其具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。作为这种细菌,优选具有包含下述(A)或(B)的16S核糖体RNA基因:
(A)由序列编号1所示的碱基序列构成的DNA;
(B)与序列编号1所示的碱基序列具有95%以上同一性的DNA。
而且,优选具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力的类诺卡氏菌属的细菌。上述同一性优选95%以上,更加优选96%以上,进一步优选97%以上,进一步优选98%以上,进一步优选99%以上,特别优选99.5%以上,特别优选99.8%以上,特别优选99.9%以上。作为这种细菌,例如有类诺卡氏菌属MTD22株(FERM P-20989;FERM BP-10849)。
另外,本发明涉及一种甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的降解方法,所述降解方法使用具有降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的能力的属于类诺卡氏菌属的细菌。
进一步,本发明涉及一种含有具有降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的能力的属于类诺卡氏菌属的细菌以及该细菌生长可接受的载体的组合物,用于降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物(三嗪类化合物用降解剂)。
进一步,本发明涉及一种净化含有甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的环境的方法,所述方法使用具有降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的能力的属于类诺卡氏菌属的细菌。
本发明中,“净化环境”的意思是指所谓的生物修复,是指从因含有难以降解的化学物质而受到污染的土壤、地下水和/或用水等中降解除去该化学物质。
另外,本发明涉及一种用于净化含有甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的环境的组合物,所述组合物含有具有降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的能力的属于类诺卡氏菌属的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
通过使用本发明的甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪降解菌,能够降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物。进一步,使用本发明的细菌,可迅速降解该化合物,能够迅速有效地降解废弃农药和环境中的残留农药。本发明为由三嗪类化合物引起的环境污染提供新的环境净化方法,即提供新的生物修复方法。
附图说明
图1表示为富集本发明的降解菌而使用的装置的模式图。
图2表示如图1所示装置的A~D各装置的回流液中,西草净的浓度变化图。
图3表示通过实施例3中本发明的降解菌MTD22株降解三嗪类化合物的图。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式进行说明。本发明是关于从土壤中分离的甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪降解菌。本发明中的甲硫基化三嗪是指三嗪骨架上具有甲硫基的甲硫基化三嗪类化合物。作为本发明的甲硫基化三嗪的优选例子,例如有:西草净(2,4-双(乙氨基)-6-甲硫基-s-三嗪)、排草净(2-(1,2-二甲基丙氨基)-4-乙氨基-6-甲硫基-s-三嗪)、扑草净(2,4-双(异丙氨基)-6-甲硫基-s-三嗪)、莠灭净(2-乙氨基-4-异丙氨基-6-甲硫基-s-三嗪)、敌草净(2-异丙氨基-4-甲氨基-6-甲硫基-s-三嗪)、特丁净(2-叔丁氨基-4-乙氨基-6-甲硫基-s-三嗪)、格草净(methoprotryne,又称甲氧丙净)(2-异丙氨基-4-(3-甲氧丙基)-6-甲硫基-s-三嗪)等。另外,氯化三嗪是指三嗪骨架上具有氯基的氯化三嗪类化合物。作为本发明的氯化三嗪的优选例子,例如有:西玛津(2-氯-4,6-双(乙氨基)-s-三嗪)、莠去津(2-氯-4-乙氨基-6-异丙氨基-s-三嗪)、扑灭津(2-氯-4,6-双(异丙氨基)-s-三嗪)、特丁津(2-叔丁氨基-4-氯-6-乙氨基-s-三嗪)、氰草津(cyanazine)(2-(1-氰基-1-甲基乙氨基)-4-乙氨基-6-氯-s-三嗪)、环丙津(cyprazine)(2-氯-4-环丙氨基-6-异丙氨基-s-三嗪)、草达津(trietazine)(2-氯-4-二乙氨基-6-乙氨基-s-三嗪)、欧阿津(norazine)(2-氯-4-异丙氨基-6-甲氨基-s-三嗪)、抑草津(ipazine)(2-氯-4-二乙氨基-6-异丙氨基-s-三嗪)、丙胺津(proglinazine-ethyl)(2-氯-6-乙氧羰基甲氨基-4-异丙氨基-s-三嗪)、可乐津(chlorazine)(2-氯-4,6-双(二乙氨基)-s-三嗪)、另丁津(sebuthylazine)(2-仲丁氨基-4-氯-6-乙氨基-s-三嗪)、MPMT(4,6-双(3-甲氧丙氨基)-2-甲硫基-s-三嗪)、SD-15417(2-氯-4-(1-氰基-异丙氨基)-6-甲氨基-s-三嗪)等。另外,甲氧基化三嗪是指三嗪骨架上具有甲氧基的甲氧基化三嗪类化合物。作为本发明的甲氧基化三嗪的优选例子,例如有:莠去通(2-乙氨基4-异丙氨基-6-甲氧基-s-三嗪)、西玛通(2,4-双(乙氨基)-6-甲氧基-s-三嗪)、草怕通(ipatone)(2-二乙氨基4-异丙氨基-6-甲氧基-s-三嗪)、Noratone(2-异丙氨基-4-甲氨基-6-甲氧基-s-三嗪)、扑灭通(2,4-双(异丙氨基)-6-甲氧基-s-三嗪)、仲丁通(secbumetone)(2-仲丁氨基-4-乙氨基-6-甲氧基-s-三嗪)、醚草通(methometon)(2-甲氧基-4,6-双(3-甲氧丙氨基)-s-三嗪)、特丁通(terbumeton)(2-叔丁氨基-4-乙氨基-6-甲氧基-s-三嗪)等。
本发明的对于甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪具有降解能力的属于类诺卡氏菌属的细菌中,包含具有下述菌学特征。
A.形态性质(使用培养基:Difco制造的R2A琼脂;培养温度:30℃;培养时间:48小时)
(1)细胞形态:球菌
(2)大小 :直径1.0μm~1.2μm
(3)孢子 :无
(4)运动性:无
B.菌落形态(使用培养基:Difco制造的R2A琼脂;培养温度:30℃;培养时间:48小时)
(1)菌落直径 :1.0mm
(2)色调 :淡黄色
(3)形状 :圆形
(4)隆起状态 :透镜状
(5)边缘 :全缘
(6)表面的形状 :平滑
(7)透明度 :不透明
(8)粘稠度 :黄油状
C.生理学性质
(1)革兰氏染色 :+
(2)37℃时的生长 :—
(3)25℃时的生长 :+
(4)过氧化氢酶 :+
(5)氧化酶 :—
(6)葡萄糖产酸/气体:—/—
(7)O/F试验 :—/—
D.生化性状试验(采用BioMerieux制造的API Coryne)
(1)硝酸盐还原 :—
(2)吡嗪酰胺酶 :+
(3)吡咯烷酮芳基酰胺酶 :—
(4)碱性磷酸酶 :—
(5)β-葡糖苷酸酶 :—
(6)β-半乳糖苷酶 :—
(7)α-葡糖苷酶 :+
(8)N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶 :—
(9)七叶苷 :+
(10)尿素酶 :—
(11)明胶水解 :+
(12)葡萄糖同化性 :—
(13)核糖同化性 :—
(14)木糖同化性 :—
(15)甘露糖醇同化性 :—
(16)麦芽糖同化性 :—
(17)乳糖同化性 :—
(18)蔗糖同化性 :—
(19)糖原同化性 :—
作为对象的甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪降解菌的具体例子,有新型分离菌株类诺卡氏菌属MTD22株。类诺卡氏菌属MTD22株被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6),微生物的标记(保藏者提交的用于识别的标记)为“Nocardioides sp.strain MTD22(类诺卡氏菌属MTD22株)”,保藏编号为“FERM P-20989”,保藏日期为2006年(平成18年)8月11日,进一步于2007年(平成19年)7月4日移交国际保藏,保藏编号为FERM BP-10849。
根据后述实施例1记载的方法,本发明人等发现了能够降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的新型的MTD22株。适于该微生物降解各三嗪化合物的培养基如表1所示。
[表1]
上述表1中的微量元素溶液的组成如下表2所示。
[表2]
上述表1中的混合维生素溶液的组成,如下表3所示。
[表3]
然后,在含有作为甲硫基化三嗪类化合物的莠灭净、敌草净、排草净、扑草净或西草净、以及作为氯化三嗪类化合物的莠去津、扑灭津、特丁津或西玛津、以及作为甲氧基化三嗪类化合物的莠去通等各1mg/l~8mg/l的无机培养基20ml中,接种该微生物,于30℃、120rpm进行旋转振荡培养。于实验开始时和第6天分别取1ml培养液,离心处理后,使用HPLC测定培养上清液中的各三嗪类化合物浓度,结果如图3所示。如图3所示,6天后,培养液中的各农药浓度达到检测限以下。由此表明,本发明的微生物具有显著降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的作用。
另外,根据后述实施例3记载的方法,得到了使培养液中的西草净浓度显著降低的菌株。
本发明的降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的方法,特别是至少降解1种选自西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净、特丁净、西玛津、莠去津、扑灭津、特丁津、西玛通、莠去通以及扑灭通等的组中的物质的方法,是通过使得本发明中具有甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物降解能力的属于类诺卡氏菌属的细菌,在能够生长的条件下与含有甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的材料接触来进行。作为这些微生物能够生长的条件,优选上述无机培养基,但并不限于上述无机培养基,只要是能够让这些微生物进行降解的条件即可。作为含有甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的材料,例如含有这些三嗪类化合物的废弃农药、土壤、地下水或者用水等。
作为本发明中用于降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物或甲氧基化三嗪类化合物、特别是用于降解至少1种选自西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净、特丁净、西玛津、莠去津、扑灭津、特丁津、西玛通、莠去通以及扑灭通的组中的物质的组合物,是含有如上所述的本发明的三嗪类化合物降解菌的组合物。作为该组合物中的细菌生长可接受的载体,只要是适于本发明的微生物能够生长的条件的材料均可,例如有上述培养基及其改性培养基、支持它的支持体等。作为这种支持体,只要是能够稳定保持本发明的微生物的物质均可,没有特别限制,例如有多孔材料,更具体地例如有使该细菌或复合微生物类富集的多孔木质碳化材料、竹碳材料或棉布材料等。更具体地说,例如有特开平10-225288号(专利第3030370号公报)、或特开平11-318435号(专利第2904432号公报)中记载的多孔材料,这些公报中记载的内容全部引入本说明书中。
进一步,也可以使用WO2000/078923号中记载的装置,使本发明中的微生物附载于其降解菌的保持载体上使用。
进一步,使用本发明的甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪降解菌,和/或含有该类降解菌的用于降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物或甲氧基化三嗪类化合物的组合物,将混合西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净、特丁净等甲硫基化三嗪类化合物、西玛津、莠去津、扑灭津、特丁津等氯化三嗪类化合物、和/或西玛通、莠去通、扑灭通等甲氧基化三嗪类化合物的废弃农药进行无害化处理,或者可以净化受到甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物污染的土壤、地下水、用水等水环境等。该方法可以通过将本发明的具有降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪能力的属于类诺卡氏菌属的细菌或含有该微生物的组合物,在这些微生物能够生长的条件下,与含有甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的材料接触来进行。根据该方法,可以通过本发明的微生物,将废弃农药中或者受到污染的土壤或地下水、用水等水材料等中含有的甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物降解,进行无害化处理、净化。其中,所述的废弃农药混合有甲硫基化三嗪类化合物(西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净、特丁净等)、氯化三嗪类化合物(西玛津、莠去津、扑灭津、特丁津等)和/或甲氧基化三嗪类化合物(西玛通、莠去通、扑灭通等),所述的受到污染的土壤或地下水、用水等水材料等受到甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的污染。
另外,本发明提供适于将这种环境污染物质进行无害化及净化处理的组合物。该组合物含有具有甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪降解能力的属于类诺卡氏菌属的细菌以及该细菌生长可接受的载体。作为该载体,可以使用与上述用于降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的组合物中的载体相同的物质。
实施例
下面表示本发明降解菌的分离培养、分类鉴定以及使用本发明降解菌降解甲硫基化三嗪类、氯化三嗪类和甲氧基化三嗪类化合物的实验例,对本发明进行更详细具体地说明,但是本发明申请并不限定于以下实施例。
实施例1 MTD22株的分离
本发明人等通过如下所述分离出了本发明涉及到的新型甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪降解菌类诺卡氏菌属MTD22株。如图1所示,土壤层槽1中加入30g~50g土壤,形成富集用土壤层2。然后,将适量的西草净作为碳源及氮源,加入200ml灭菌的无机盐培养基中,用泵将回流液3从储液槽4回流到富集用土壤层2。使用的无机盐培养基的组成如下表4所示。
[表4]
准备图1所示的装置4台,回流开始后,用HPLC测定各回流液中的西草净浓度。结果如图2所示。图2中纵轴表示回流液中的西草净浓度(将新鲜回流液中的西草净浓度作为1时的相对值),横轴表示回流时间(天)。图2的箭头表示将全部回流液与新鲜回流液交换的时间。如图2所表明的,装置C(图2中用白圆圈(○)表示)中,回流液中的西草净浓度急剧下降。
因此,另外再准备2台图1所示的装置,在这些装置的土壤层槽中添加2.2g木质碳化材料,从装置C移植大约1g土壤。运行1个月左右,在认为木质碳化材料中富集西草净降解菌的时候,从装置中取出一粒碳,放入添加有200ml表4所示组成的培养基的500ml容量的三角烧瓶中,于30℃进行振荡培养,发现西草净被慢慢地降解。因此,以使培养液中存在的细菌种类减少为目的,将培养液用极限稀释法进行传代培养约1年。即,将1份培养液用9倍量的无机培养基稀释,再将1份该稀释的培养液用9倍量的无机培养基稀释,这种稀释操作进行至大约108倍,将得到的各稀释系列接种0.5ml于新的培养基中,于30℃进行振荡培养,用适宜的HPLC测定培养液中的西草净浓度,从接种了认为西草净降解最高的稀释系列的培养液中取出1份培养液,以同样的操作稀释后,每隔1周至1个月重复进行传代的操作。
通过将该传代培养操作重复进行约1年,多次稀释的传代培养液中,如果是约20mg/l的西草净,1周左右也可完全降解,因此认为,为使培养液中存在的细菌的构成种类单一化、西草净降解菌占优势,进行降解菌的分离操作。
上述培养液中,将接种了最高稀释系列的培养液使用10μl接种环在R2A琼脂培养基上划线,将该琼脂培养基于30℃静置培养。用接种针钓取产生的单菌落,再次在新的R2A培养基上划线,于30℃静置培养。在100ml容量三角烧瓶中加入含有25mg/l西草净的无机培养基20ml,用接种环刮取R2A琼脂培养基上产生的菌体,进行接种,于30℃进行振荡培养。用HPLC跟踪培养基中西草净浓度的经时变化,发现在2天内西草净被完全降解。但是,由于认为西草净降解菌的分离尚不充分,因此采取1份该培养液,使用无机培养基按上述方法稀释到108倍,将各稀释系列100μl涂布到R2A琼脂培养基上,于30℃静置培养。用接种环钓取该培养基上产生的单菌落,再在另一R2A培养基上划线,于30℃静置培养。在100ml容量三角烧瓶中加入含有25mg/l西草净的无机培养基20ml,用接种环刮取R2A琼脂培养基上产生的菌体,进行接种,于30℃进行振荡培养。通过用HPLC跟踪培养基中西草净浓度的经时变化,查明能降解西草净的1种分离株,将该株命名为MTD22株。
实施例2 MTD22株的菌学研究
为了对实施例1中分离的MTD22株进行菌学定位,对MTD22株的形态性质、培养基中的生长状态、生理学性质、生化性状,在NCIMB JapanCo.,Ltd进行了分析。结果,确认具有下述菌学性质。
A.形态性质(使用培养基:Difco制造的R2A琼脂;培养温度:30℃;培养时间:48小时)
(1)细胞形态:球菌
(2)大小 :1.0μm~1.2μm
(3)孢子 :无
(4)运动性 :无
B.菌落形态(使用培养基:Difco制造的R2A琼脂;培养温度:30℃;培养时间:48小时)
(5)菌落直径:1.0mm
(6)色调 :淡黄色
(7)形状 :圆形
(8)隆起状态 :透镜状
(9)边缘 :全缘
(10)表面的形状 :平滑
(11)透明度 :不透明
(12)粘稠度 :黄油状
C.生理学性质
(13)革兰氏染色 :+
(14)37℃时的生长 :—
(15)25℃时的生长 :+
(16)过氧化氢酶 :+
(17)氧化酶 :—
(18)葡萄糖产酸/气体 :—/—
(19)O/F试验 :—/—
D.生化性状试验(采用BioMerieux制造的API Coryne)
(20)硝酸盐还原 :—
(21)吡嗪酰胺酶 :+
(22)吡咯烷酮芳基酰胺酶 :—
(23)碱性磷酸酶 :—
(24)β-葡糖苷酸酶 :—
(25)β-半乳糖苷酶 :—
(26)α-葡糖苷酶 :+
(27)N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶 :—
(28)七叶苷 :+
(29)尿素酶 :—
(30)明胶水解 :+
(31)葡萄糖同化性 :—
(32)核糖同化性 :—
(33)木糖同化性 :—
(34)甘露糖醇同化性 :—
(35)麦芽糖同化性 :—
(36)乳糖同化性 :—
(37)蔗糖同化性 :—
(38)糖原同化性 :—
按照伯杰氏手册(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol.2(1984))对结果进行鉴定,推断本发明的MTD22株为棒状细菌的一种。棒状细菌为多种多样的细菌群,仅仅根据上述菌学性质的试验结果难以对该菌株进行分类鉴定。因此,按照下述步骤进行了基于MTD22株的16S rRNA基因的碱基序列的基因分类学研究。
(1)使用DNeasy Tissue Kit(Qiagen制造),由MTD22株的菌体配制DNA。
(2)将上述DNA作为模板DNA,使用已知的真细菌16S rRNA基因扩增用引物,采用PCR法将MTD22株的16S rRNA基因片段进行扩增,使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen制造)纯化DNA。
(3)将上述纯化的DNA作为模板DNA,使用用以解析真细菌16SrRNA基因的碱基序列的荧光标记的已知引物进行循环测序反应,用DNA测序仪SQ5500E(日立制造)确定碱基序列。
根据上述操作确定的MTD22株的16S rRNA基因的部分碱基序列,在序列编号1中示出1477个碱基。使用GENETYX PDB(GENETYX制造),按照FASTA法将序列编号1中示出的MTD22株的16S rRNA基因的部分碱基序列与DNA碱基序列数据库(GenBank)中登录的其他微生物的16S rRNA基因的序列进行同源性比较。结果,MTD22株与Marmoricola aurantiacus显示有97.4%的同源性,与Marmoricola属CNJ872 PL04株显示有97.1%的同源性。但是,MTD22株与Marmoricolaaurantiacus菌落颜色和酪蛋白降解性等表现特征不一致,倒是与类诺卡氏菌属细菌类似。根据上述结果,本发明人等将本菌株鉴定为新型的类诺卡氏菌属MTD22株,在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)保藏,保藏编号为FERM P-20989,保藏日期为2006年(平成18年)8月11日。独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)于2007年(平成19年)7月4日将该株移交国际保藏,保藏编号为FERM BP-10849。
实施例3 通过MTD22株对甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物
以及甲氧基化三嗪类化合物的降解
研究了MTD22株对三嗪类化合物的降解能力。分别配制含有约1mg/l~8mg/l的作为甲硫基化三嗪类化合物的莠灭净、敌草净、排草净、扑草净或西草净、作为氯化三嗪类化合物的莠去津、西玛津、扑灭津或特丁津、作为甲氧基化三嗪类化合物的莠去通的无机液体培养基,将这些液体培养基各20ml分配到100ml容量三角烧瓶中。另一方面,使用R2A琼脂培养基,于30℃静置培养MTD22株,菌落生长时用接种环刮取并悬浮于1.5ml无机培养基中后,于各培养基上分别接种100μl,于30℃、120rpm进行旋转振荡培养。用HPLC测定实验开始时(第0天)和第6天各三嗪类化合物的浓度。
其结果如图3所示。图3的纵轴表示各三嗪类化合物的浓度,横轴表示供试的三嗪类化合物和时间的推移。图中的黑圆圈(●)表示实验开始时及6天后的各种农药的浓度。
如图3所示,可知各培养液中的三嗪类化合物6天后被MTD22株完全降解。由此确定MTD22株是具有迅速降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力的微生物。
工业实用性
本发明提供降解作为农药等常用的甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的新型细菌、含有该细菌的组合物、细菌以及使用它降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的方法,将废弃农药和环境中残留的过剩的甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物降解,进行无害化处理,有助于环境的净化,能够除去残留物,提供干净的土壤和水。
序列表的自由文字
序列编号1:本发明的降解菌MTD22株的16S rRNA基因的1477个碱基。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110>KOWA CO.,LTD.兴和株式会社
<120>Novel Bacterium Capable of Degrading Chloro-s-triazines,Methylthio-s-triazines andMethoxy-s-triazines
可同化降解氯化、甲硫基化以及甲氧基化三嗪类农药的新型微生物
<130>TJJ3543857WO
<150>JP 2006-314187
<151>2006-11-21
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1477
<212>DNA
<213>Nocardioides sp.MTD22
类诺卡氏菌属MTD22株
<400>1
Claims (13)
1.一种类诺卡氏菌属的细菌,其特征在于,所述细菌具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。
2.如权利要求1所述的细菌,其中,所述甲硫基化三嗪类化合物为选自西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净以及特丁净的组中的1种以上。
3.如权利要求1或2所述的细菌,其中,所述氯化三嗪类化合物为选自西玛津、莠去津、扑灭津以及特丁津的组中的1种以上。
4.如权利要求1~3任一项所述的细菌,其中,所述甲氧基化三嗪类化合物为选自西玛通、莠去通以及扑灭通的组中的1种以上。
5.一种类诺卡氏菌属的细菌,其中,所述细菌具有包含下述(A)或(B)的16S rRNA基因:
(A)由序列编号1所示的碱基序列构成的DNA;
(B)与序列编号1所示的碱基序列具有95%以上同一性的DNA,且具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。
6.类诺卡氏菌属MTD22株(保藏编号FERM P-20989;保藏编号FERM BP-10849),其中,所述MTD22株具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。
7.甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的降解方法,其中,所述方法使用权利要求1~6任一项所述的细菌。
8.如权利要求7所述的降解方法,其中,所述甲硫基化三嗪为选自西草净、莠灭净、排草净、敌草净、特丁净以及扑草净的组中的1种以上。
9.如权利要求7或8所述的降解方法,其中,所述氯化三嗪为选自莠去津、西玛津、扑灭津以及特丁津的组中的1种以上。
10.如权利要求7~9任一项所述的降解方法,其中,所述甲氧基化三嗪为选自莠去通、西玛通以及扑灭通的组中的1种以上。
11.一种受到甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物污染的土壤、地下水和/或用水的净化方法,其中,所述净化方法使用权利要求1~6任一项所述的细菌。
12.一种用于降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物的三嗪类化合物用降解剂,其中,所述降解剂含有至少1种权利要求1~6任一项所述的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
13.一种受到甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物污染的土壤、地下水和/或用水的净化剂,其中,所述净化剂含有至少1种权利要求1~6任一项所述的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
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