JP5160443B2 - 塩素化、メチルチオ化及びメトキシ化トリアジン系農薬を資化分解可能な新規微生物 - Google Patents
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Description
[1] メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有することを特徴とするノカルディオイデス属の細菌。
[2] メチルチオ化トリアジン系化合物が、シメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、及びテルブトリンから選ばれる群のうち1種類以上である[1]に記載の細菌。
[3] 塩素化トリアジン系化合物が、シマジン、アトラジン、プロパジン、及びテルブチラジンから選ばれる群のうち1種類以上である[1]又は[2]に記載の細菌。
[4] メトキシ化トリアジン系化合物が、シメトン、アトラトン、及びプロメトンから選ばれる群のうち1種類以上である[1]〜[3]の何れかに記載の細菌。
[5] 次の(A)又は(B):
(A) 配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA、
(B) 配列番号1に記載の塩基配列と95%以上の同一性を有するDNA、
を含む16S rRNA遺伝子を有し、且つ、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する、ノカルディオイデス属の細菌。
[6] メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する、ノカルディオイデス sp. MTD22株(受託番号FERM P−20989;受託番号FERM BP−10849)。
[7] [1]〜[6]の何れかに記載の細菌を使用した、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び/又はメトキシ化トリアジン系化合物の分解方法。
[8] メチルチオ化トリアジンがシメトリン、アメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリン及びプロメトリンから選ばれる群のうち1種類以上である[7]に記載の分解方法。
[9] 塩素化トリアジンがアトラジン、シマジン、プロパジン、及びテルブチラジンから選ばれる群のうち1種類以上である[7]又は[8]に記載の分解方法。
[10] メトキシ化トリアジンがアトラトン、シメトン、及びプロメトンから選ばれる群のうち1種類以上である[7]〜[9]の何れかに記載の分解方法。
[11] [1]〜[6]の何れか1項に記載の細菌を使用した、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び/又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染された土壌、地下水、及び/又は用水の浄化方法
[12] [1]〜[6]の何れかに記載の細菌の少なくとも1種、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなる、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び/又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解するためのトリアジン系化合物用分解剤。
[13] [1]〜[6] の何れか1項に記載の細菌の少なくとも1種、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなる、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び/又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染された土壌、地下水、及び/又は用水の浄化剤。
(A) 配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA、
(B) 配列番号1に記載の塩基配列と95%以上の同一性を有するDNA、
を含む16SリボゾーマルRNA遺伝子を有し、且つ、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する、ノカルディオイデス属の細菌が好ましい。上記の同一性は95%以上が好ましく、より好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上であり、特に99.5%以上、特に99.8%以上、特に99.9%以上の同一性であることが好ましい。このような細菌として、ノカルディオイデス sp. MTD22株(FERM P−20989;FERM BP−10849)が挙げられる。
培養温度:30℃、培養時間:48時間)
(1) 細胞形態:球菌
(2) 大きさ :直径1.0〜1.2μm
(3) 胞子 :なし
(4) 運動性 :なし
培養温度:30℃、培養時間:48時間)
(1) コロニー直径:1.0mm
(2) 色調 :淡黄色
(3) 形 :円形
(4) 隆起状態 :レンズ状
(5) 周縁 :全縁
(6) 表面の形状 :スムーズ
(7) 透明度 :不透明
(8) 粘稠度 :バター様
(1) グラム染色 : +
(2) 37℃における生育 : −
(3) 25℃における生育 : +
(4) カタラーゼ : +
(5) オキシダーゼ : −
(6) グルコースからの酸/ガス産生 : −/−
(7) O/Fテスト : −/−
(1) 硝酸塩還元 : −
(2) ピラジンアミダーゼ : +
(3) ピロリドニルアリルアミダーゼ : −
(4) アルカリフォスファターゼ : −
(5) β−グルクロニダーゼ : −
(6) β−ガラクトシダーゼ : −
(7) α−グルコシダーゼ : +
(8) N−アセチル−β−グルコサミニダーゼ : −
(9) エスクリン : +
(10) ウレアーゼ : −
(11) ゼラチン加水分解 : +
(12) グルコース資化性 : −
(13) リボース資化性 : −
(14) キシロース資化性 : −
(15) マンニトール資化性 : −
(16) マルトース資化性 : −
(17) 乳糖資化性 : −
(18) 白糖資化性 : −
(19) グリコーゲン資化性 : −
また、後記する実施例3に記載の方法により、培養液中のシメトリン濃度を顕著に低下させる株を得た。
さらに、WO2000/078923号に記載されているような装置を用いて、本発明の微生物をその分解菌保持担体に担持させて使用することもできる。
以下、本発明分解菌の単離培養、分類同定、更に本発明分解菌を用いたメチルチオ化トリアジン系、塩素化トリアジン系、及びメトキシ化トリアジン系化合物分解の実験例を示して、本発明を更に詳細かつ具体的に説明するが、本出願発明は以下の実施例に限定されるものではない。
発明者らは、以下の様にして、本発明に係わる新規メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解菌ノカルディオイデス sp. MTD22株を単離した。図1に示すように、土壌層タンク1に土壌を30〜50g入れて集積用土壌層2を形成した。そして、適量のシメトリンを炭素源及び窒素源として加えた滅菌済の無機塩培地200mlを還流液3として貯液タンク4からポンプを用いて集積用土壌層2に還流させた。用いた無機塩培地の組成は次の表4の通りである。
そこで、別途図1に示した装置で土壌層タンクに木質炭化素材を2.2g添加したものを更に2台用意し、装置Cより土壌約1gを移植した。1ヶ月程度運転を行い木質炭化素材にシメトリン分解菌が集積してきたと考えられた時点で装置より炭を一粒取り出し、表4の組成の培地が200mL入った500mL容の三角フラスコに入れ、30℃で振とう培養を行ったところ、徐々にではあるがシメトリンの分解が認められた。そこで、培養液中に存在する細菌種を少なくすることを目的として、培養液を限界希釈法により約1年程度継代培養を行った。すなわち、培養液の1部を9倍量の無機培地で希釈し、さらにその希釈された培養液の1部を9倍量の無機培地で希釈するといった操作で概ね10の8乗倍まで希釈した各希釈系列から0.5mLを新しい培地に植種し、30℃で振とう培養を行い、適宜HPLCを用いて培養液中のシメトリンの濃度を測定し、シメトリンの分解が認められた最も高い希釈系列を植種した培養液から培養液の1部を採取し同様の操作で希釈後植え継ぎを行う操作を1週間から1ヶ月おきに繰り返した。
この継代培養操作を約1年程度繰り返すことにより、高次希釈の継代培養液においても20mg/L程度のシメトリンであれば1週間程度で完全に分解することができるようになったことから、培養液中に存在する細菌の構成種が単純化し、シメトリン分解菌が優占するようになったと考えられたため、分解菌の単離作業を実施した。
上記培養液のうち、最も高い希釈系列を植種した培養液を10μLのループを用いてR2A寒天培地上に画線し、この寒天培地を30℃で静置培養した。ここで生じた単コロニーをニードルで釣菌、及び再度新しいR2A培地に画線して30℃で静置培養した。100mL容三角フラスコにシメトリン25mg/Lを含む無機培地20mLを入れ、R2A寒天培地上に生じた菌体をループでかきとって植種し、30℃で振とう培養を行った。HPLCを用いて経時的に培地中のシメトリン濃度変化を追ったところ、2日間でシメトリンの完全分解が認められた。しかし、まだシメトリン分解菌の単離が不十分であると考えられたため、この培養液の1部を採取し無機培地を用いて前述の方法で10の8乗倍まで希釈し、各希釈系列から100μLをR2A寒天培地に塗布して30℃で静置培養した。この培地上に生じた単コロニーをループで釣菌し、さらに別のR2A培地に画線して30℃で静置培養した。100mL容三角フラスコにシメトリン25mg/Lを含む無機培地20mLを入れ、R2A寒天培地上に生じた菌体をループでかきとって植種し、30℃で振とう培養を行った。HPLCを用いて経時的に培地中のシメトリン濃度の変化を追うことにより、シメトリンを分解できる単離株1種を特定し、この株をMTD22株と命名した。
実施例1にて単離したMTD22株の菌学的位置付けを行うために、MTD22株の形態的性質、培地における生育の様相、生理学的性質、生化学的性状についてエヌシーアイエムビー・ジャパンにて分析を行った。その結果、次の菌学的性質が認められた。
A.形態的性質(使用培地:Difco製R2A agar、
培養温度:30℃、培養時間:48時間)
(1) 細胞形態 :球菌
(2) 大きさ :1.0〜1.2μm
(3) 胞子 :なし
(4) 運動性 :なし
培養温度:30℃、培養時間:48時間)
(5) コロニー直径 :1.0mm
(6) 色調 :淡黄色
(7) 形 :円形
(8) 隆起状態 :レンズ状
(9) 周縁 :全縁
(10) 表面の形状 :スムーズ
(11) 透明度 :不透明
(12) 粘稠度 :バター様
(13) グラム染色 : +
(14) 37℃における生育 : −
(15) 25℃における生育 : +
(16) カタラーゼ : +
(17) オキシダーゼ : −
(18) グルコースからの酸/ガス産生 : −/−
(19) O/Fテスト : −/−
(20) 硝酸塩還元 : −
(21) ピラジンアミダーゼ : +
(22) ピロリドニルアリルアミダーゼ : −
(23) アルカリフォスファターゼ : −
(24) β−グルクロニダーゼ : −
(25) β−ガラクトシダーゼ : −
(26) α−グルコシダーゼ : +
(27) N−アセチル−β−グルコサミニダーゼ : −
(28) エスクリン : +
(29) ウレアーゼ : −
(30) ゼラチン加水分解 : +
(31) グルコース資化性 : −
(32) リボース資化性 : −
(33) キシロース資化性 : −
(34) マンニトール資化性 : −
(35) マルトース資化性 : −
(36) 乳糖資化性 : −
(37) 白糖資化性 : −
(38) グリコーゲン資化性 : −
(2)上記DNAを鋳型DNAとして、公知のユーバクテリア16S rRNA遺伝子増幅用プライマーを用いてPCR法によりMTD22株の16S rRNA遺伝子断片を増幅し、QIAquick PCR Purification Kit(キアゲン製)を用いてDNAを精製した。
(3)上記精製DNAを鋳型DNAとして蛍光ラベルした公知のユーバクテリア16S rRNA遺伝子の塩基配列解析用プライマーを用いてサイクルシーケンス反応を行い、DNAシーケンサSQ5500E(日立製)により塩基配列を決定した。
MTD22株のトリアジン系化合物の分解能を検討した。メチルチオ化トリアジン系化合物としてアメトリン、デスメトリン、ジメタメトリン、プロメトリン又はシメトリン、塩素化トリアジン系化合物としてアトラジン、シマジン、プロパジン又はテルブチラジン、メトキシ化トリアジン系化合物としてアトラトンを1〜8mg/L程度含む無機液体培地をそれぞれ調製し、これらの液体培地を100mL容三角フラスコに20mLずつ分注した。別途R2A寒天培地を用いてMTD22株を30℃で静置培養し、コロニーが成長したところをループでかきとり無機培地1.5mLに懸濁した後、100μLずつ各培地に植種して30℃、120rpmでロータリー振とう培養を行った。実験開始時(0日目)と6日目の各トリアジン系化合物の濃度をHPLCにて測定した。
その結果を図3に示す。図3の縦軸は各トリアジン系化合物の濃度を、横軸は供試したトリアジン系化合物と時間経過を示している。図中の黒丸(●)は実験開始時及び6日後の各農薬濃度を示している。
図3で示されるように各培養液中のトリアジン系化合物は、MTD22株によって6日後には完全に分解されていることがわかった。このことから、MTD22株はメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物を速やかに分解する能力を持つ微生物であることが判明した。
Claims (8)
- メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物からなる群から選ばれる少なくとも1種の物質の分解能を有する、ノカルディオイデス sp. MTD22株(受託番号FERM BP−10849)、又は当該菌株の菌学的特徴を有しメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物からなる群から選ばれる少なくとも1種の物質の分解能を有するノカルディオイデス属の細菌。
- 請求項1に記載の細菌の少なくとも1種を使用した、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び/又はメトキシ化トリアジン系化合物の分解方法。
- メチルチオ化トリアジンがシメトリン、アメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリン及びプロメトリンから選ばれる群のうち1種類以上である請求項2に記載の分解方法。
- 塩素化トリアジンがアトラジン、シマジン、プロパジン、及びテルブチラジンから選ばれる群のうち1種類以上である請求項2又は3に記載の分解方法。
- メトキシ化トリアジンがアトラトン、シメトン、及びプロメトンから選ばれる群のうち1種類以上である請求項2〜4の何れか1項に記載の分解方法。
- 請求項1に記載の細菌の少なくとも1種を使用した、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び/又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染された土壌、地下水、及び/又は用水の浄化方法。
- 請求項1に記載の細菌の少なくとも1種、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなる、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び/又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解するためのトリアジン系化合物用分解剤。
- 請求項1に記載の細菌の少なくとも1種、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなる、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び/又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染された土壌、地下水、及び/又は用水の浄化剤。
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