JP5148949B2 - 環境汚染物質分解能を有する海水由来菌及びその単離方法、及び環境汚染物質分解方法 - Google Patents
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Description
図1は本実施形態の海水から環境汚染分解菌を単離する方法を構成する各工程の流れを示した図である。この図で示すように、本実施形態の単離方法は、海水をフィルターろ過するろ過ステップ(S0101)と、ろ過に使用したフィルターの残渣をろ過した海水の一部に懸濁する懸濁ステップ(S0102)と、海水培地又は人工海水培地に環境汚染物質を基質として添加し、該培地に前記懸濁液を滴下し培養する一次培養ステップ(S0103)と、一次培養液を新たな海水培地又は人工海水培地にて希釈し、前記環境汚染物質を新たに基質として添加して培養するステップを複数回繰り返す二次培養ステップ(S0104)と、培養工程を複数回繰り返した後の二次培養液を海水培地又は二次海水培地にて希釈しこれを重層培地に塗布する塗布ステップ(S0105)と、重層培地にできたコロニーを採取し、人工海水培地にて希釈し重層培地に塗布して静置培養を繰り返し行う純化ステップ(S0106)とから構成される。
複数回とは、2回以上をいい、採取した海水に含まれる菌種により決めるのが好ましい。また、一次培養ステップ及び二次培養ステップで用いる培地は、海水培地又は人工海水培地のどちらか一方に統一するのが好ましい。どちらか一方でしか培養できない菌がいるためである。また、基質として用いる環境汚染物質も一次培養ステップ及び二次培養ステップで統一するのが好ましい。該環境汚染物質に対する資化性は菌の種類により異なるため、特定の環境汚染物質に対してのみ資化性を有する菌の培養もできるからである。
重層培地とは、2種の培地を層のように重ねた培地をいい、希釈した前記二次培養液を重層培地に塗布する。2種の培地とは、下の層(下層培地)は無機栄養培地であり、上の層(上層培地)は前記無機栄養培地に基質を添加した培地をいう。重層培地の一例としては、下層培地の無機栄養培地はMarine Broth培地であり、上層培地は該Marine Broth培地に基質としてカルバゾールを添加した培地である。
また、カルバゾール中間代謝産物の確認をGC-MSで行った。その結果を図4に示す。(a)から(d)はそれぞれ、OC4株、OC5株、OC6株、OC7株のGC-MSの結果を示す。全ての菌株でカルバゾールの消失が確認でき、その中間代謝産物としてアントラニル酸が確認できた。ゆえに、陸上のカルバゾー分解細菌Psewdomonas resinovorans CA10株と同様のカルバゾール分解経路が予想され、環境汚染物質分解菌として有効である。特に、OC5株においては、完全にカルバゾールが消失されており、より有効な環境汚染物質分解菌である。
<<実施例>>
表1に記載の滅菌済人工海水液体培地(若しくは天然海水液体培地)100mlに菌源1mlと、基質としてカルバゾール0.1〜0.5g/l(終濃度)添加し、500ml用バッフル付き三角フラスコを用いて30℃、150rpmで回転振盪培養した。
(1)PCR反応溶液の組成
(4)得られた16SrDNAの塩基配列により、類似菌株の検索を検索プログラムBlastを用いて行った。また、NJ(近接接合)法で系統樹を作成した。
<サザンハイブリダイゼーション>
Claims (1)
- 環境汚染物質を分解する海水中生息の菌を単離する菌単離方法であって、
海水をフィルターろ過するフィルターろ過ステップと、
ろ過に使用したフィルターの残渣をろ過した海水の一部に懸濁して懸濁液とする懸濁ステップと、
海水培地又は人口海水培地に前記環境汚染物質を基質として添加し、これに前記懸濁液を滴下して、海水培地又は人工海水培地に混入して菌を培養して一次培養液を得る一次培養ステップと、
一次培養ステップにて得られた一次培養液を新たな海水培地又は人口海水培地に希釈し、新たに前記環境汚染物質を基質として添加し培養する培養工程を複数回繰り返す二次培養ステップと、
二次培養ステップにて培養工程を複数回繰り返した後の培養液である二次培養液を海水培地又は人口海水培地にて希釈し、これを重層培地に塗布する塗布ステップと、
塗布ステップにて重層培地に塗布された菌をコロニーが確認できるまで静置培養し、静置培養した菌を採取して新たに重層培地に塗布して静置培養することを繰り返すことで菌を純化する純化ステップと
からなる菌の単離方法。
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