KR101471508B1 - 다환방향족 탄화수소 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속 ｓｎ２ - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다환방향족 탄화수소 분해 활성을 갖는 신규한 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)와 이를 다환방향족 탄화수소 오염물에 접촉시키는 단계를 포함하는 다환방향족 탄화수소 오염물의 정화방법 및 상기 균주를 포함하는 다환방향족 탄화수소 오염물 정화용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 유류 오염물, 특히 나프탈렌 토양 오염물을 처리 또는 복원하는데 있어서 2차적인 오염원이 없이 유용하게 이용될 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명에서의 균주와 정화방법을 산업적으로 이용하는 경우 저비용과 친환경적인 공정을 통하여 종래 열적처리기술, 고형화 기술 및 증기추출법과 같은 처리 기술보다 경제성 및 효율성 면에서 매우 우수하다는 특징이 있다.
다환방향족 탄화수소, 나프탈렌 분해, 알테로모나스, 생물학적 정화

Description

다환방향족 탄화수소 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속 ＳＮ２{New Microbial Strain Alteromonas sp. SN2 for Degrading Polycyclic Aromatic Hydrocarbon}
본 발명은 다환방향족 탄화수소 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속 SN2 균주, 이를 포함하는 다환방향족 탄화수소 오염물의 정화방법 및 다환방향족 탄화수소 오염물 정화용 조성물에 관한 것이다.
나프탈렌은 원유 혹은 석탄의 타르에 다량 함유되어 있어서 석유 정제 혹은 코크스 작업공정도중 폐수에 유입된다. 이와 같이 나프탈렌이 함유된 폐수는 활성오니 공정도중 미생물의 성장을 저해하고 반응시간을 지연시키는 등, 폐수 처리 시스템의 운영을 어렵게 하는 요인이 된다. 종래 폐수중의 나프탈렌 제거방법으로는 용매 추출법이 이용되어 왔다. 그러나 용매 추출법은 폐수에 함유된 유기 성분중 화학물질을 용매로 분리한 다음 용매를 추출하여 연소 내지 소각시켜야 하므로 경제성이 없고 작업이 번거로운 단점이 있는 것이다.
오염된 토양을 정화시키는 방법은 처리 기술의 원리에 따라 a) 토양을 고온에 노출시켜 소각이나 열분해를 통해 유해물질을 분해시키는 열적 처리기술(Thermal Technology), b) 고형물질을 형성함으로써 오염물질의 이동을 방지하는 안전화 및 고형화 처리기술(Stabilization and Solidification Technology), c) 오염된 토양 내 공극을 통해 오염공기를 뽑아내어 처리하는 토양증기 추출법(Soil Vapor Extraction Technology), d) 물, 산, 유기용매 등을 이용하여 중금속등을 처리하는 물리화학적 처리기술(Physical and Chemical Extraction Technology) 및, e) 토양세균을 활성화시킴으로써 유기화합물의 생분해를 촉진시키는 미생물학적 처리기술(Microbial Treatment Technology)로 분류된다.
열적처리기술, 고형화 기술 및 증기추출법과 같은 처리기술은 불완전 연소나 용매의 잔류, 환경의 교란 등과 같은 이차적인 오염을 일으킬 수 있고, 처리비용이 높다는 문제점을 가지고 있다.
한편, 생물학적인 정화기술(bioremediation)은 미생물 혹은 미생물의 대사산물을 이용하여 오염물질을 독성이 적은 형태의 물질로 변환시키는 방법으로, 미생물이 오염물질을 탄소원 및 에너지원으로 사용함으로써 독성이 없는 이산화탄소의 형태로 변환시켜 방출하는 과정을 이용하는 기술이다. 이 과정의 기본은 탄소순환이며, 탄소가 무기물과 유기물 사이를 산화 환원 반응을 반복함으로써 행하여진다(Roling, W.F.M. et al. The microbiology of hydrocarbon degradation in subsurface petroleum reservoirs: Perspectives and prospects. Res. Microbiol. 154:321-328(2003)).
이는 자연의 정화능력을 이용함으로써 2차적인 오염원이 적은 장점이 있을 뿐 아니라 현재까지 가장 저렴한 공정으로 알려져 있는바, 그 경제성 및 효율성은 수많은 사례연구와 현장 적용 연구에서 이미 입증되었다(Margesin R, Schinner F. Bioremediation (Natural Attenuation and Biostimulation) of Diesel Oil Contaminated Soil in an Alpine Glacier Skiing Area. Applied and Environmental Microbiology. 67:3127(2001)).
미생물의 공급원으로 오염지역 내에 서식하는 토착미생물을 이용하는 방법(Bio-stimulation)과 특정 오염물질에 대한 분해 능력을 가지는 외래 미생물을 실험실에서 대량 배양한 뒤 상품화하여 공급하는 상업용 미생물제재(Bio-augmentation)방법이 있다. 후자의 방법은 주입된 외래 미생물이 토착 미생물과의 생존 경쟁에서 뒤쳐져 우점화에 실패할 가능성이 크고, 외래 미생물의 대사산물에 의해 예측하지 못한 생태계의 교란 가능성이 있다는 문제점이 있다.
토착미생물을 이용하는 방법으로 오염지역 내에서 외부미생물의 주입 없이 토착미생물을 성장 및 증식시켜 오염물을 제거하는 방법과, 이들을 분리·동정하여 실험실에서 대량으로 배양하여 현장에 재주입하는 방법이 있다. 전자는 복원진행 초기에 토착미생물이 일정 개체수 이상으로 성장, 증식하기까지의 초기 지체시간(Lag Time)이 과도하게 소요되어 전체 복원 기간이 장기화되는 단점이 있다.
따라서 이러한 단점을 보완하기 위해 실험실에서 대량으로 배양된 미생물을 활용하는 방법이 적용되고 있으며, 유류(특히, 나프탈렌)에 의하여 오염된 토양, 담수 또는 해수를 생물학적으로 정화시킬 수 있는 새로운 균주 및 생물학적 정화 방법의 필요성이 대두되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 자연의 정화능력을 이용함으로써 2차적인 오염원이 적은 다환방향족 탄화수소 분해 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유류로 오염된 해양 갯벌에서 분리된 균주가 나프탈렌을 매우 효과적으로 분해시키고, 이러한 분해를 통하여 오염된 토양 및 해수를 생물학적으로 정화시키는 과정을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 다환방향족 탄화수소 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 다환방향족 탄화수소 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속 균주를 포함하는 다환방향족 탄화수소 오염물의 정화방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 다환방향족 탄화수소 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속 균주를 포함하는 다환방향족 탄화수소 오염물 정화용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다환방향족 탄화수소(Polycyclic aromatic hydrocarbons) 분해 활성을 가지는 신규한 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)를 제공한다.
본 발명자들은 자연의 정화능력을 이용함으로써 2차적인 오염원이 적은 다환방향족 분해 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 유류로 오염된 해양 갯벌에서 분리된 균주가 다환방향족 탄화수소를 매우 효과적으로 분해하여 오염된 토양 및 해수를 생물학적으로 정화시키는 과정을 규명하였다.
본 발명의 명세서에서 용어 “다환방향족 탄화수소(Polycyclic aromatic hydrocarbons: PAHs)”는 헤테로 원자를 포함하지 않으며 치환기를 운반하는 융합 방향족 고리들로 구성된 화합물을 의미한다.13 PAHs는 원유(oil), 석탄 및 타르 축적물에서 발생하며, 연료(화석 연료 또는 바이오매스) 연소시 부산물로 생성되는 화합물(chemical compound)이다. 상기 다환방향족 탄화수소 중 일부 화합물들은 발암, 돌연변이 및 기형아를 유발하는 화합물로 규정하고 있다.
본 발명에 따르면, 분리된 미생물의 16S rRNA의 유전자 염기서열을 확인하여 계통학적 분석을 한 결과 알테로모나스 속 (Alteromonas sp.) 균주에 속하는 신규 미생물로 동정되었다. 이는 “알테로모나스 속 (Alteromonas sp.) SN2 균주”라 명명하고 대한한국 국립농업과학원 농업유전자자원센터(KACC)에 2009년 11월 5일자로 기탁하였고, 기탁번호 KACC 91504P를 부여받았다.
종래 보고서에 따르며, 상기 알테로모나스 속 균주는 다환방향족 탄화수소 특히, 나프탈렌을 분해하는 능력이 없으며, 나프탈렌 디옥시게나아제 유전자를 가지고 있지 않는 균주라고 알려져 있다(STEFANIE Van T et al, Alteromonas stellipolaris sp. nov., a novel, budding, prosthecate bacterium from Antarctic seas, and emended description of the genus Alteromonas, Int J Syst Evol Microbiol; 54:11571163(2004).
그러나 본 발명의 일 실시 예에 따르면, 본 발명의 신규 미생물인 알테로모나스 속 (Alteromonas sp.) SN2 균주는 다환방향족 탄화수소 화합물 중 나프탈렌 분해능이 매우 뛰어난 균주이며, 이러한 다환방향족 탄화수소 분해능을 가지는 특성으로 볼 때, 본 발명의 신규 미생물은 종래 알테로모나스 속 균주와는 전혀 다른 신규 알테로모나스 속 균주임을 증명하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명이 제공하는 알테로모나스 속 (Alteromonas sp.) SN2 균주는 나프탈렌(Naphthalene), 안트라센(Anthracene), 크리센(Chrysene), 벤조[a]피렌(benzo[a]pyrene), 코로넨(Coronene), 코란눌렌(Corannulene) 나프타센(Naphthacene), 펜타센(Pentacene), 페난트렌(Phenanthrene), 피렌(Pyrene), 트리펜일렌(Triphenylene) 또는 오발렌(Ovalene) 분해 활성 가지며, 보다 바람직하게는 나프탈렌, 안트라센, 크리센 또는 벤조[a]피렌 분해 활성을 가지고, 가장 바람직하게는 나프탈렌 분해 활성를 가진다.
본 발명 알테로모나스 속 SN2 균주(KACC91504P)는 나프탈렌 디옥시게나아제(Naphthalene dioxygenase)를 발현하는 균주이다. 상기 나프탈렌 디옥시게나아 제는 나프탈렌 분해를 촉매하는 효소이며, 본 발명의 명세서에서 표현 ‘나프탈렌 1,2-디옥시게나아제’와 혼용되어 표현 될 수 있다.
상기 나프탈렌 분해에 대한 화학반응식 예시는 다음과 같다:
나프탈렌(naphthalene) + NADH + H+ + O2 ↔ (1R,2S)-1,2-디하드로나프탈렌(dihydronaphthalene)-1,2-디올(diol) + NAD+
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명은 나프탈렌 디옥시게나아제를 발현하여 나프탈렌 분해 활성을 가지는 신규 알테로모나스 속 SN2 균주(KACC91504P)를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 신규 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)는 유류에 의하여 오염된 대한민국 충남 태안군 해양 갯벌에서 분리한 균주로서, 다환방향족 고리 화합물 중 특히, 나프탈렌 분해에 매우 높은 활성을 나타내는 균주로 확인되었다. 따라서 상기 신규 균주는 다환방향족 고리 화합물으로 오염된 토양의 생물학적 정화에 제공될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 미생물은 해양 갯벌에서 분리된 균주이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 알테로모나스 속 균주를 다환방향족 탄화수소 오염물에 접촉시키는 단계를 포함하는 나프탈렌 오염물의 정화방법을 제공한다.
본 발명의 정화 방법은 다환방향족 탄화수소 분해능이 우수한 상술한 본 발명의 알테로모나스 속 균주를 이용한다. 본 발명의 방법은 본 명세서에서 다환방향족 탄화수소 오염물(contaminant)의 정화방법(purification process)로 표현되고 있지만, 다환방향족 탄화수소 오염물의 처리방법(treatment process) 또는 나프탈렌 오염물의 복원방법(remediation process)으로 표현될 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 다환방향족 탄화수소 오염물은 나프탈렌, 안트라센, 크리센, 벤조[a]피렌, 코로넨, 코란눌렌, 나프타센, 펜타센, 페난트렌, 피렌, 트리펜일렌 또는 오발렌 오염물을 의미하며, 보다 더 바람직하게는 나프탈렌, 안트라센, 크리센 또는 벤조[a]피렌 오염물을 의미하고, 가장 바람직하게는 나프탈렌 오염물을 의미한다.
상기 알테로모나스 속 균주는 나프탈렌 디옥시게나아제 유전자 또는 나프탈렌 분해 인자를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 정화방법발명에서 알테로모나스 속 균주는 알테로모나스 속 SN2 균주(KACC91504P)이며, 가장 바람직하게는 나프탈렌 디옥시게나아제를 발현하여 나프탈렌 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속 SN2 균주(KACC91504P)이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 정화방법에서 이용하는 균주는 해양 갯벌에서 분리된 균주이다.
본 발명의 정화방법은 오염물의 종류에 따라 다양한 방식으로 실시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 처리될 수 있는 다환방향족 탄화수소 오염물은 다환방향족 탄화수소으로 오염된 토양, 담수, 또는 해수이고, 가장 바람직하게는 토양이다.
본 발명에서 처리하고자 하는 오염물이 토양인 경우, 본 발명의 방법의 구체적인 예는 다음과 같다:
본 발명의 오염토양 정화방법은 토양의 굴착여부에 따라 부지내(in-situ) 생물학적 분해방법, 퇴비단식(Composting) 생물학적 분해방법 및 생물학적 반응기(Bioreactor) 방법의 3가지가 대표적으로 이용될 수 있다.
a) 부지내(In situ) 상태에서 토양 및 지하수의 생물학적 분해는 표준 환경에서 특정 미생물 활성을 촉진하기 위해 산소를 주입하고 필요시 영양물질 및 기타 첨가제를 유입수에 혼합하여 토양 속으로 투입한 후 다시 흡입하여 처리수를 처리한다. 부지내(In-situ) 상태에서 생물학적 처리 시 토양의 투수성은 매우 중요한 지표가 되며 일반적으로 Kf치가 10-5 m/s 이면 성공적인 처리를 위해 요구되는 최소 투수치로 간주된다(Watanabe, K. Microorganisms relevant to bioremediation. Curr. Opin. Biotechnol. 12: 237-241(2001)).
b) 퇴비단식 방법(Composting)은 굴착된 오염토양을 퇴비단 형태로 쌓고 주기적으로 뒤집으면서 산소와 수분을 공급하여 미생물에 의한 오염물질의 생분해 속도를 증진시킨다. 이 공정에서는 미생물에 의해 생물학적으로 분해 가능한 독성물질이 50-55℃의 온도에서 무해하고 안정한 부산물로 변한다(MarJA. Bioremediation by composting of heavy oil refinery sludge in semiarid conditions. Biodegradation. 17(3): 251-261(2006)). 퇴비단을 쌓을 때는 먼저 오염토양 내 공극율을 높이기 위해 팽화제나 나무 조각, 톱밥, 채소 쓰레기 등의 유기물질과 혼합하고, 높이가 0.9-1.8 m 되는 퇴비단을 일렬로 설치한다.
c) 생물학적 반응기(Bioreactor)는 굴착된 오염 토양을 적절한 첨가제와 함께 물과 섞어 반응기에 투입하고, 교반하여 미생물을 활성화시킴으로써 나프탈렌 분해를 촉진 시키는 방법이다. 이는 생물반응기 내로 미생물, 산소원 및 영양액이 순차적으로 투입됨으로써 오염처리 효율이 높다는 특징이 있다.
본 발명의 방법은 상기 나열한 생물학적 분해방법에 한정되지 않고 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 다환방향족 탄화수소 오염물의 정화방법은 상기 알테로모나스 속 SN2 균주(KACC91504P)를 포함하는 정화방법이므로, 본 발명의 명세서의 과도한 중복 기재를 피하기 위하여, 이 둘의 공통된 내용은 생략된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 알테로모나스 속 균주를 포함하는 다환방향족 탄화수소 오염물 정화용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 오염 토양 내에 부족할 수 있는 질소와 인, 과산화수소와 같은 산소유발물질, 오염물질과 미생물간의 표면접촉을 촉진하기 위한 계면활성제 및 오염물질의 생화학적 분해의 여러 단계를 적절하게 활성화하는 효소가 포함될 수 있다. 이와 같이 미생물 이외에 첨가제가 필요한 이유는, 고농도 다환방향족 탄화수소로 오염된 토양의 경우 미생물 생존환경이 매우 열악하므로, 오염물질의 효 과적 분해를 위해서 미생물의 성장에 필요한 영양분, 산소와 같은 전자 수용체, 오염물질 분해과정의 생화학적 활성화 등의 여러 조건이 만족되어야하기 때문이다. 특히 탄소원과 에너지원이 되는 오염물질의 미생물로의 전달을 위한 계면활성제는 다환방향족 탄화수소의 탈착과 용해도를 증가시켜 미생물에 의한 생분해를 용이하게 한다(Deshpande et al. Water Res 33:351-360(1999); Doong and Lei. J. Hazard Mater 96:15-27(2003)).
본 발명의 정화용 조성물 중 신규한 알테로모나스 속 균주 이외의 성분은 상기 나열한 성분에 한정되지 않고 미생물 활성 및 오염물질 분해를 촉진하는 성분으로써 당업계에 공지된 다양한 성분이 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 조성물이 정화시킬 수 있는 다환방향족 탄화수소 오염물은 나프탈렌, 안트라센, 크리센, 벤조[a]피렌, 코로넨, 코란눌렌, 나프타센, 펜타센, 페난트렌, 피렌, 트리펜일렌 또는 오발렌 오염물을 의미하며, 보다 더 바람직하게는 나프탈렌, 안트라센, 크리센 또는 벤조[a]피렌 오염물을 의미하고, 가장 바람직하게는 나프탈렌 오염물을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 조성물에서 알테로모나스 속 균주는 알테로모나스 속 SN2 균주(KACC91504P)이며, 가장 바람직하게는 나프탈렌 디옥시게나아제를 발현하여 나프탈렌 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속 SN2 균주(KACC91504P)이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 조성물에 포함된 균주는 해양 갯벌에서 분리된 균주이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명 조성물에 의해 처리될 수 있는 다환방향족 탄화수소 오염물은 다환방향족 탄화수소으로 오염된 토양, 담수, 또는 해수이고, 가장 바람직하게는 토양이다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 상기 알테로모나스 속 SN2 균주(KACC91504P)를 포함하는 조성물이므로, 본 발명의 명세서의 과도한 중복 기재를 피하기 위하여, 이 둘의 공통된 내용은 생략된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 나프탈렌(naphthalene) 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속 SN2 균주(KACC91504P), 이를 포함하는 나프탈렌 오염물 정화방법 및 정화용 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명은 유류 오염물, 특히 나프탈렌 토양 오염물을 처리 또는 복원하는데 있어서 2차적인 오염원이 없이 유용하게 이용될 수 있는 장점이 있다.
(ⅲ) 또한, 본 발명에서의 균주와 정화방법을 산업적으로 이용하는 경우 저비용과 친환경적인 공정을 통하여 종래 열적처리기술, 고형화 기술 및 증기추출법과 같은 처리 기술보다 경제성 및 효율성 면에서 매우 우수하다는 특징이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.
실험 재료 및 방법
1. 토양 시료채취
2007년 12월 발생한 허베이 스피리트호 유류유출 사건으로 인해 오염된 태안 의항리 앞바다 갯벌에서 각각 시료채취 지점을 지정해 채취하였다. 시료 채취는 사고 시점으로부터 매월 1회 시행하였으며 총 8번의 시료채취를 하였다(기간: 2007.12.28-2008.7.29). 실험에 쓰인 토양은 사고 시점부터 1개월 뒤의 것으로서, 회당 150 ㎖가량의 토양을 채취하여 -80℃에 보관하였다.
2. 미생물 농화 배양과 gDNA(genomic DNA) 추출
미생물 농화 배양
농화배양의 배지는 바다환경과 비슷하도록 인위적으로 제작한 MSB (basal salts medium, stucker et al.,1996)11와 ASW (artificial sea water, Kester et al.,1967)12를 1:1 로 혼합한 조성의 배지와 실제 갯벌토양 채취 지역에서 옮겨온 바닷물을 사용하였다. 각각의 배지 150 ㎖에 나프탈렌(30 ppm, JUNSEI)을 단일 탄소원으로 첨가하였으며, 시료 채취에서 얻은 토양을 배지에 15 g(전체 배지의 10% 무게) 접종하였다. 이후, 2주 간격으로 동일한 조건의 배지를 제작하여 4회 계대 배양 하였다. 계대 배양 시 전단계의 농화배양 시료에서 상층액 일부(10ml)를 새로운 배지에 접종하였다(전체 농화배양기간; 8주, 25℃, 130 rpm). 또한 농화배양 시기별 미생물군집분석을 위한 시료 일부를 고속원심분리(13000 x g, 5분)하여 침전물을 얻어내었다.
gDNA 추출
4℃ 조건하에서 계대 배양시 얻은 침전된 토양과 0.5 g의 갯벌 토양으로부터 gDNA 추출 키트와 비드 비터(bead beater; Biospec Products, Bartlesville, USA)를 이용하여 gDNA를 추출하였다(MPbio medical, lnc., Fast@DNA spin for Soil 키트).
3. 나프탈렌 환경에서의 미생물 다양성
농화 배양 8주후의 최종 시료의 상등액을 채취하여 10-3-10-4 배율로 희석된 시료를 마린 아가(Marine Agar, Difco)평판배지에 100 ㎕씩 도말하였다. 평판배 지에서 2일간 배양시킨 뒤 군집을 형성한 단일 균주(나프탈렌을 분해하여 탄소원으로 이용가능한 균주)들에 대하여 16s RNA gene PCR(중합효소연쇄반응)을 실행하였다. 프라이머는 16S rRNA 유전자의 유니버설 프라이머(universal primer)인 1F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’), 13R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGAC TT-3’) 을 이용하였다. PCR 조건은 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 신장(extention)을 각각 94℃ 45초, 56℃ 45초, 72℃ 45초 32회 반복하여 반응시켰으며, 추가적으로 72℃에서 10분간 반응시켰다(PCR Master Mix: 10 X PCR 버퍼 2.5 ㎕, 100 mM dNTPs 0.5 ㎕, dDW: 18.75 ㎕, 10 pmol PCR 프라이머 1 ㎕, Taq 폴리머라아제 0.125 ㎕ 및 주형 1 ㎕).
4. ARDRA(Amplified rDNA restriction analysis) 분석
이렇게 얻어낸 각 균주의 16S rRNA 유전자 PCR 결과물(amplicon)들을 모아 ARDRA를 수행하였다. 6시간 동안 PCR 결과물을 HhaⅠ(NEB, UK)과 HeaⅢ 제한 효소(NEB, UK)로 절단시켜 메타포어 아가(Metaphore Agar, BioWhittaker, USA) 2% 젤을 1% TBE 버퍼에서 70분간 반응시킨 후 유형을 분석하여 확인하는 제한 효소 절단 다형성 방법(RFLP)를 실행하였다. 유형을 분석한 뒤 정제 과정을 거쳐 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다.
5. 나프탈렌 분해 테스트
선별된 단일 균주들의 일부를 5 ㎖ 마린 브로스(marine broth, Difco)에 접 종하여 48시간 배양시켰다. 1 x MSB:ASW 배지와 약 16 ppm의 나프탈렌을 총 10 ㎖ 첨가된 시럼 병(Serum bottle)에 충분히 배양된 이 단일 균주를 100 ㎕ 접종한 뒤, 시럼 병을 실리콘 마개와 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 3번 반복으로 14일 동안 25℃에서 130 rpm으로 배양시켰다.
6. 나프탈렌 분해 기작 확인
선별된 SN2의 나프탈렌 분해 경로를 알기 위해 인돌에 의한 발색반응을 관찰하였다. MSB:ASW 배지에 1 mM의 인돌 100 ㎕(Sigma-Aldrich)을 도말하였다. SN2 균주를 이 평판배지에 도말한 뒤 나프탈렌과 함께 2일간 25℃에서 배양하여 발색여부를 관찰하였다.
7. 기체크로마토그래피(Gas Chromatography) 분석
2주간의 분해 테스트를 마친 시럼 병을 개봉하여 내부표준물질(internal standard: 1-chloronaphthalene, Sigma-Aldrich)이 50 ppm포함된 5 ㎖ 에틸에테르(ethylether, Fisher scientifics) 용액을 첨가 한 뒤 병을 흔들어주었다. 그 다음 상층액 만을 채취한 뒤 기체 크로마토그래피(Gas Chromatography model 6890N, Agilent Technologies Company)로 나프탈렌 잔여량을 측정하였다.
8. SN2 균주의 계통수(Phylogenetic tree) 제작
SN2 계통의 16S rRNA 유전자를 F1과 R13 프라이머를 이용해 PCR한 결과물을 바탕으로 염기서열(1350 nucleotides)을 분석하고, 그와 유사한 γ-프로테오박테리아(γ-Proteobacteria)의 타입 균주(type strain)를 NCBI GenBank 내에서 검색하여(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 결과물과 함께 계통수를 그렸다. 염기서열의 유사도에 따라 유전자들을 나열시키고(CLUSTAL W software program), 네이버-조이닝(neighbor-joining, NJ), 맥시멈 라이클리후드(maximum-likelihood, ML)과 맥시멈 팔시모니(maximum-parsimony,MP)법을 이용한 계통수그리기 프로그램(PHYLIP software, version 3.6,Felsenstein, 2002)을 사용하였다.
9. 나프탈렌 디옥시게나아제 유전자(Naphthalene dioxygenase gene)의 검출
기존에 알려진 나프탈렌 디옥시게나아제 유전자에 대한 조사를 한 뒤, 프라이머를 제작하였다(표 1). 각 각의 프라이머로 SN2 균주에 대하여 PCR 하였다.
Figure 112009073370812-pat00001
10. DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)분석
8% 아크릴아미드 젤과 요소(Urea) 및 포름아미드(formamide)의 농도 구배로 인한 기울기 범위(gradient range)가 30-60%인 젤에서 DGGE 실험을 실행하였다. DNA 주형은 농화배양 한 시료의 침전물에서 추출한 gDNA와 SN2 계통을 gc338F(5’-CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)와 758R 프라이머(5’-CTACCAGGGTATCTAATCC-3’)로 PCR한 시료, 그리고 유류오염 직후 오염된 토양의 gDNA를 PCR하여 10 ㎕씩 로딩(loading)하였다(Bio-Rad Dcode system, 70V, 60℃, 15시간 영동). 0.5 X SYBR 그린 I(Invitrogen, USA)으로 30분 동안 젤 염색을 실시하였다.
실험 결과
1. 나프탈렌을 탄소원으로 하는 균주 선별
나프탈렌을 단일 탄소원으로 하는 균주를 선별하기 위하여 농화배양을 실시하였다. 농화 배양액으로부터 채취된 시료를 마린 아가 배지에 배양한 후 평판배지상에 군집을 형성하는 콜로니를 선별하였다.
2. ARDRA 분석 결과
선별된 균주들을 PCR을 통하여 ARDRA 분석을 실시하였다. 각 균주의 16S rRNA 결과물들은 HhaⅠ과 HeaⅢ 효소의 6시간의 절단에 의하여 ARDRA 분석결과 총 11가지의 패턴을 읽을 수 있었다(도 1). 각 그룹 별로 특유의 효소 절단 패턴을 보였으며 패턴이 완전히 일치하는 균주들은 같은 종의 미생물이라 할 수 있다. 같은 균주라 판단되는 미생물을 그룹화하여 목록을 작성하였다.
3. 16S rRNA 염기서열 분석 결과
염기서열 분석결과, ARDRA를 통해 선별된 균주들에 대하여 가장 근접한 타입 계통(type strain) 목록을 작성할 수 있었다. 이들은 Thalassospira sp. 또는 Pseudomonas sp.와 같은 나프탈렌 분해와 관련된 미생물이 포함된 패밀리의 타입 계통의 일부가 발견되기도 하였다.
표 2는 대한민국 충청남도 태안 의항리 앞바다 갯벌 시료의 농화배양 결과에서 추출된 미생물 군집의 16S rRNA 염기서열 분석 결과이다. 또한, 표 2 는 NCBI에서 블라스트 서치(Blast search)를 하여 나타낸 결과이며, 가장 근접한 타입 계통과 그 유사도(Identity)를 나타내었다.
Figure 112009073370812-pat00002
4. 나프탈렌 분해 테스트 결과
농화배양과 ARDRA 결과 발견된 총 11 유형의 균주들을 14일간 시럼 병안에서 분해 테스트한 후, 기체 크로마토그래피 분석 결과에서 나프탈렌을 탄소원으로 하는 곳에서는 SN2 균주만이 현저한 분해능을 나타내었다. SN2 균주의 기체 크로마토그래피 분석결과가 균주를 접종하지 않은 대조군과는 달리 14일 후의 나프탈렌의 함유량이 0에 가깝게 줄어들은 것을 확인 할 수 있었다(기타균주는 분해능이 거의 없으므로 데이터 생략). 14일 동안의 분해능 분석결과 SN2는 2일 안에 시럼병안의 나프탈렌을 모두 소비해버리는 뛰어난 분해능이 있었다(표 3 및 도 2).
표 3는 나프탈렌을 탄소원으로 하는 농화배양 환경에서 선택된 단일 균주들을 14일 간의 분해테스트를 마친 뒤 1-클로로나프탈렌을 내부 표준으로 하여 분석한 결과를 나타낸 것이다. 수치는 기체 크로마토그래피에서 나프탈렌과 1-클로로 나프탈렌의 피크 넓이를 의미한다.
Figure 112009073370812-pat00003
5. 나프탈렌 분해 기작 확인
기존에 알려진 나프탈렌 분해 과정은 나프탈렌이 나프탈렌 디옥시게나아제(Naphthalene Dioxygenase) 효소에 의해 1,2-히드록시나프탈렌(hydroxynaphthalene)으로 전환되는데, 이때 디옥시게나아제에 의해 산화되는 동안 인돌은 인디고(Indigo) 색으로 발색된다.
선별된 SN2 균주가 포함된 배지에서 SN2 균주 주변 배지가 인디고색으로 관찰되었다(도 3). 이러한 결과를 통하여, SN2 균주는 나프탈렌 분해기작에서 나프탈렌 디옥시게나아제를 이용하는 것을 알 수 있었다.
6. SN2 계통의 계통수
SN2 균주를 16S rRNA 유전자와 그와 유사한 γ-프로테오박테리아의 여러 계통과 함께 계통수를 그렸다(도 4). 부트스트랩 값은 1000번 반복으로 하고, 50% 이상의 일치를 보이는 막대에는 수치로 표시하였다. 관련된 γ-프로테오박테리아에 관한 계통은 GenBank의 접근번호와 함께 표시하였는데, 그 결과 Arteromonas stellipolaris LMG 21861T(AJ295715)와 Alteromonas addita R10SW13T(AY682202)는 98%의 유사성을 보였다. 이외에도 유사성을 보이는 여러 균주들과 함께 수(tree)를 그렸으며, 이를 통해 SN2 균주가 Alteromonas sp.인 것을 추측할 수 있었다.
이러한 결과를 토대로, 나프탈렌을 탄소원으로 하는 곳에서 현저한 분해능을 가지고 있는 SN2균주를 Alteromonas sp. SN2이라 명명하였고, 기탁기관 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2009년 11월 5일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KACC91504P를 부여받았다.
7. 디옥시게나아제 검출 결과
디옥시게나아제 유전자를 검출하기 위해서 SN2 계통을 PCR을 하였다. 그 결과 PCR 결과물이 검출되지 않았으며, 이를 통해 SN2 계통에는 나프탈렌 옥시제나아제 유전자에 있어서 기존에 알려진 유전자가 아닌 새로운 계통의 유전자를 갖고 있을 것이라 예상되었다(도 5).
8. 16S rRNA 단편(fragment)의 DGGE 경향 분석
GC388F와 758R 프라이머를 이용하여 DGGE를 실험한 결과, SN2 계통과 같은 위치에서 밴드들이 나타났다(도 6). 각 밴드들의 진하기로 군집의 밀도를 나타낼 수 있는데 시간이 지남에 따라 SN2 계통은 그 밀도가 증가하여 8주째까지 점점 밴드가 진해지고, SN2 계통 밴드와 다른 곳에 위치한 그 외에 밴드들은 시간에 지남에 따라서 그들의 밀도가 감소하는 경향을 보였으며 6주에서 8주 사이에 기존에 없던 새로운 밴드도 나타나기 시작하는 등 다양한 양상을 띠고 있다. 여기서 6-8주 사이에 DGGE 젤 상에 나타난 밴드(도 5에서의 b)를 추출한 후, 이 벤드에 대한 염기서열을 분석하였다. 분석결과, 이 균주는 실험 초기에 배양되었던 SN1 계통으로서, Thalassospira lucentensis DSM 14000T 균주와 16s rRNA 유전자의 유사성이 98% 일치하는 균주로 밝혀졌다. Thalassospira sp.는 PAH(polycyclic aromatic hydrocarbon) 분해 미생물들이 존재한다고 알려져 있는데 실제 태안 갯벌에서 분리해 낸 이 SN1 계통은 나프탈렌 분해능이 없었다.
검토
본 연구를 통해서 종래 또는 태안 앞바다에서 채취해온 시료에서 분리된 네프투노모나스 나프토보란스 종(Neptunomonas naphthovorans sp.), 로도코코스 에리트레우스 종(Rhodococcus erythreus sp.) 및 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.)등의 나프탈렌 분해 균주들은 나프탈렌 분해를 하지 않는 것으로 나타났다. 또한 알테로모나스 스텔리폴라리스(Alteromonas stellipolaris) 계열의 SN2 계통은 기존에 분해능이 있다고 알려지지 않았던 계열의 균주임에도 불구하고, 분해 테스트에서 현저한 분해능을 보였다. 또한, DGGE를 통한 군집 분석에서도 시간이 지남에 따라 기존에 알려져 나프탈렌 분해능을 갖고 있을 것이라 예상되는 다른 종들은 분해능을 보이지 않았고, SN2 계통만이 나프탈렌 환경에서 우점종의 위치에 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여, 서해안 갯벌에서 기존에 알려지지 않은 새로운 종인 SN2 계통이 나프탈렌 분해를 이끌 것이라는 추측을 할 수 있다.
게다가 더욱 흥미로운 것은 나프탈렌 분해를 보인 SN2 계통에서 기존의 나프탈렌 디옥시게나아제 유전자를 갖고 있지 않은 것으로 나타났다. 이는 다른 나프탈렌 디옥시게나아제 유전자와는 다른 염기서열을 가지고 있거나, 기존에 알려지지 않은 다른 새로운 기작으로 나프탈렌을 분해 할 수 있을 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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도 1은 본 발명에서 ARDRA에 대한 결과를 나타낸 것이다. 두가지 효소(HhaⅠ과 HeaⅢ)로 절단된 16S rRNA 유전자들의 패턴 분석과 그룹화하기 위하여 비교한 이미지이다. 바닷물 환경에서 나프탈렌 농화 배양시킨 미생물 군집들의 패턴이다.
도 2는 SN2 균주의 나프탈렌 분해능을 나타낸 것이다. 가로축은 분해테스트 기간에 해당하며 세로축은 시럼 병에 있는 잔여 나프탈렌의 양이다. 대조군으로서 배지 조건과 배양 조건은 동일하나 SN2를 접종하지 않은 시럼 병에서의 나프탈렌 잔여량을 측정하였다.
도3은 선별된 SN2 균주의 나프탈렌 분해 경로를 알기 위하여 인돌에 의한 발색반응을 나타낸 결과이다. 패널 (A)는 대조군이며, 패널 (B)는 선별된 SN2 균주이다.
도 4는 SN2 계통의 계통수(Phylogenic tree)를 나타낸 결과이다.
도 5은 SN2의 16S rRNA 부분 유전자(partial gene)와 기존에 알려진 나프탈렌 디옥시게나아제 유전자 검출 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 한 결과이다. 프라이머 이름과 예상 결과물의 크기(bp)는 각각 nahAc 480 bp, NDO201 1.5 kb, NDO200 1.5 kb, Phn 993 bp, Reiske 78 bp이다.
도 6는 16S 유전자의 DGGE분석을 나타낸 결과이다.

Claims (16)

  1. 나프탈렌 디옥시게나아제(Naphthalene dioxygenase)를 발현하여 나프탈렌에 대한 분해 활성을 가지는 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)는 추가적으로 안트라센(Anthracene), 페난트렌(Phenanthrene), 또는 피렌(Pyrene)에 대한 분해 활성을 더 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)는 해양 갯벌(tidal flat)에서 분리된 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제 1 항 기재의 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)를 다환방향족 탄화수소에 접촉시키는 단계를 포함하는 다환방향족 탄화수소 오염물의 정화방법으로서, 상기 다환방향족 탄화수소는 나프탈렌인 것을 특징으로 하는 정화방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 다환방향족 탄화수소는 안트라센(Anthracene), 페난트렌(Phenanthrene), 또는 피렌(Pyrene)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정화방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)는 해양 갯벌에서 분리된 균주인 것을 특징으로 하는 정화방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 다환방향족 탄화수소 오염물은 다환방향족탄화수소로 오염된 토양, 담수 또는 해수인 것을 특징으로 하는 정화방법.
  11. 제 1 항 기재의 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)를 포함하는 다환방향족 탄화수소 오염물 정화용 조성물로서, 상기 다환방향족 탄화수소는 나프탈렌인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 다환방향족 탄화수소는 안트라센(Anthracene), 페난트렌(Phenanthrene), 또는 피렌(Pyrene)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 11 항에 있어서, 상기 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) SN2 균주(KACC91504P)는 해양 갯벌에서 분리된 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 11 항에 있어서, 상기 다환방향족 탄화수소 오염물은 다환방향족 탄화수소으로 오염된 토양, 담수 또는 해수인 것을 특징으로 하는 조성물.
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