KR101554155B1 - 유류를 분해하는 알카니보락스 신균주 및 이를 이용한 생물정화방법 - Google Patents

유류를 분해하는 알카니보락스 신균주 및 이를 이용한 생물정화방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유류를 분해하는 알카니보락스 신균주 및 이를 이용한 생물정화방법으로서, 본 발명에 따른 알카니보락스 신균주는 최초로 한국에서 분리되었고, 유류분해능력이 뛰어났다. 다른 유류분해균주와 혼합배양을 하였을 경우에는 더욱 향상된 유류분해능을 보였다. 본 발명은 상기 알카니보락스 신균주를 이용한 유류분해방법과, 상기 알카니보락스 신균주를 배양하기 위한 배지조성물을 제공한다.

Description

유류를 분해하는 알카니보락스 신균주 및 이를 이용한 생물정화방법{New Alcanivorax spp. degrading petroleum hydrocarbon and Methods of bioremediation by using thereof}
본 발명은 석유탄화수소로 오염된 해양환경 정화를 위한 신규한 미생물 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621 (KACC91802P)) 균주, 상기 균주의 대량 배양을 위한 배지조성 및 상기 균주를 단독 또는 혼합배양을 통하여 유류를 분해하는 방법에 관한 것이다.
원유는 중요한 에너지원으로서 전 세계적으로 널리 사용되고 있지만 선박사고, 운항상 과실, 자연적 누출, 해상에서의 기름생산, 산업폐기물 및 도시하수 등 다양한 경로를 통하여 연간 130만 톤 (47~840만 톤) 정도가 해양에 유입되는 것으로 추정된다 (U.S. NRC, 2002). 특히 선박사고로 인한 원유 유출이 빈번히 발생하고 있는데, 2007년 허베이 스피리트호 사고로 인하여 약 1만 톤의 유류가 주변 해역으로 유출되었으며 (ITOPF, 2007), 2010년 반잠수식 부유 시추선인 Deepwater Horizon호가 폭발, 침몰하는 사고가 발생하여 56~58.5만 톤의 원유가 멕시코만으로 유출되었다 (Robertson & Krauss, 2010).
사고 초기 물리 화학적 방법으로 대량의 기름을 비교적 단시간에 효과적으로 제거 할 수 있지만 이 과정에는 많은 비용과 인력, 장비가 소요된다. 또한 이들 방법은 잔류하는 소량의 기름을 제거하는 데에는 비효율적이다. 이에 따라 물리화학적인 1차 처리 후 잔류하는 기름을 제거하는 효과적인 수단으로서, 때로는 접근이 어렵거나 민감한 환경에 사용할 수 있는 유일한 수단으로서 생물정화기술이 꾸준히 연구되어왔다 (Benson et al., 1993; Chung et al., 2003).
적극적인 의미에서 생물정화기술은 오염된 환경에 산소, 질소나 인과 같은 무기영양염 등을 공급함으로써 토착미생물의 활성을 높여주거나 (생물활성 촉진기술, biostimulation), 또는 오염된 유류의 분해능력이 있는 미생물을 접종하여줌으로써 오염물질의 생분해를 가속화시키는 방법이다 (유효생물접종기술, bioaugmentation) (Sim et al., 1999). 유류의 주성분인 탄화수소는 자연계에 널리 분포하는 물질이므로 탄화수소를 분해하는 다양한 미생물이 자연 환경에 존재하지만 유류유입이 없는 경우 이들 분해미생물의 수가 적기 때문에 (Atlas et al., 1981) 오염이 심한 경우 유류분해능력이 뛰어난 미생물을 접종하는 유효생물접종기술이 유용하게 사용 될 수 있다 (Ekpeghere et al., 2009). 오랜 준비를 거쳐 생물정화제제에 대한 형식승인제도가 마련되었고 (Chung et al., 2003) 2008년 2월부로 해양 환경에 생물정화제제를 사용하기 위한 법적 근거가 마련되었다 (국토해양부, 2008).
동 법안의 발효 이후 2013년 현재 한국기기유화시험원의 시험을 거쳐 형식승인을 획득한 제품은 총 10개인데 (표 1) 이들 중 일부는 현장 미생물의 활성을 촉진시키는 성분으로 되어있다. 미생물이 포함된 제품들도 불특정의 미생물을 복합발효시켜 생산하는 제품과 단일미생물로 이루어진 제품, 규정된 수 종의 미생물을 혼합해서 사용하는 제품으로 나눌 수 있다.
Figure 112015038273845-pat00001
자연환경에 오염된 석유탄화수소를 효율적으로 제거하기 위한 생물정화기술의 핵심 과제는 분해능이 높은 신종의 미생물을 확보하는 것과 분해율을 향상시키기 위한 방법을 개발하는 것, 분해능이 높은 미생물을 저렴하게 대량배양할 수 있는 기술을 확보하는 것, 개발된 제제를 현장에 적용할 수 있는 절차 개발 등을 들 수 있다.
이 중 앞서 살펴본 것과 같이 유류분해능이 우수한 새로운 미생물의 발굴은 제제의 다변화 및 고도화를 위해 매우 중요한 과제이며 동시에 확보된 우수미생물의 저비용 대량배양법의 개발 역시 제제개발 측면에서 매우 중요한 과제이다.
본 발명자들은 유류분해능이 있는 알카니보락스 속 미생물을 분리하는데 성공하였고, 계통분석을 통하여 알카니보락스 속에 속하는 신균주인 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
한편 알카니보락스속 미생물의 경우 배양배지로 마린배지가 제시되어있지만 마린배지에서의 성장은 매우 느리므로 분리된 균주의 활용을 위해서는 새로운 배양기질의 개발이 요구된다.
본 발명은 알카니보락스 속 신균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알카니보락스 속 신균주용 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알카니보락스 속 신균주를 단독 또는 혼합배양을 통하여 유류를 분해하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 위하여 본 발명의 제1의 구현형태는 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주 (KACC91802P)이다. 상기 균주는 유류분해 능력이 있으며, 이를 이용하여 유류 분해용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 균주는 단독 또는 다른 유류분해 균주와 혼합하여 제공될 수 있다. 석유에는 매우 다양한 형태의 탄화수소 화합물이 포함되어져 있으므로, 여러 형태의 탄화수소를 분해하는데에는 혼합배양이 효과적일 수 있다. 상기 혼합배양에 사용되는 균주는 유류분해능이 있는 균주이면 제한이 없으나, 본 발명의 균주의 활성을 억제하지 않으며, 유류분해에 상승적인 작용을 일으키는 균주가 바람직하다.상기 혼합배양 균주로는 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스 MEBiC 07579, 할로모나스 오르가니보란스 MEBiC 08600, 고르도니아 브론치알리스 MEBiC 08612 또는 로도코커스 라티스라비엔시스 MEBiC 08618 균주일 수 있다.
본 발명의 제2의 구현형태는 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주 (KACC91802P)을 이용한 유류분해 방법이다. 본 발명에 따른 유류분해 방법은 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주 (KACC91802P)을 단독 또는 혼합하여 이용할 수 있다. 상기 혼합되는 균주는 유류분해능이 있는 균주이면 제한이 없으나, 본 발명의 균주의 활성을 억제하지 않으며, 유류분해에 상승적인 작용을 일으키는 균주가 바람직하다.상기 혼합 균주로는 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스 MEBiC 07579, 할로모나스 오르가니보란스 MEBiC 08600, 고르도니아 브론치알리스 MEBiC 08612 또는 로도코커스 라티스라비엔시스 MEBiC 08618 균주일 수 있다.
본 발명의 제3의 구현형태는 MM2 기초액체 배지성분에 추가적으로 피부브산, 초산, 프로피온산 및 부틸산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기산을 0.05~0.5% 농도로 포함하고, 1.5-3% (w/v) 농도의 NaCl를 포함하는 것을 특징으로 하는 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주배양용 배지를 제공한다. MM2 기초액체배지 (NH4)2SO4 2.33 g, FeSO4 0.02 g, CaCl2·2H2O 0.02 g, MgSO4 ·7H2O 0.25 g, 1 M 인산염완충용액 10 ㎖, 숙성해수 990 ml를 포함한다.
본 발명의 제4의 구현형태는 MM2 기초액체 배지성분에 추가적으로 피부브산, 초산, 프로피온산 및 부틸산 또는 이들의 염형태로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기산을 0.05~0.5% 농도로 포함하고, 1.5-3% (w/v) 농도의 NaCl를 포함하는 배지에 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주를 접종하는 단계; 및 30~43℃, pH 7-8에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주배양 방법를 제공한다. 본 발명의 따른 균주는 30~43℃, pH 7-8에서 최적 생장을 보이며, 피부브산, 초산, 프로피온산 및 부틸산 또는 이들의 염형태로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기산을 0.05~0.5% 농도로 포함하였을 때 성장속도가 빨라진다.
본 발명에서는 아직까지 한국에서 발굴된 예가 없는 대표적인 석유탄화수소 분해미생물의 일종인 알카니보락스속 신종세균과 이의 대량배양조건을 확립하는 한편 여러 종의 균주와 조합하여 사용하는 방법을 제시함으로써 생물정화제제 다변화와 오염 유류의 생물정화기술 고도화를 이루었다.
도 1은 MEBiC 08621균주의 16S 리보좀 유전자 서열.
도 2는 16S 리보좀 유전자 서열에 기초한 MEBiC 08621균주의 계통도.
도 3은 MEBiC 08621균주에 의한 지방족 탄화수소 분해도. C10-C18과 C20 + C28의 결과를 따로 표시함.
도 4는 단일탄소원으로서 유기산을 공급하였을 때의 MEBiC 08621균주 성장도.
도 5는 MEBiC 08621균주와 노보스핑고비움 펜타로마티보란스 US6-1 균주를 동시 접종하였을 때 모래에 오염시킨 원유의 분해과정 실험 사진이다. (A)는 준비된 SOM을 50g씩 무게를 달고 각 실험구를 준비하는 과정이고, (B)는 SOM 50g이 페트리디쉬에 담겨져 있는 모습이고, (C)는 각 실험구에 사용된 SOM, 모래 500g 과 풍화된 이란산 원유 1g을 혼합(24h) 것이고, (D) 각 실험구에 사용된 0.2μm 여과된 멸균 해수 10ml와 0.45μm에 여과된 현장 해수 20ml, 각 실험구에 제조된 영양염 10ml을 주입한 것이고, (E) 접종구에 접종하고자 하는 배양된 aliphatic HC, aromatic HC 분해 미생물 2종, 각 1ml씩 총 2ml을 접종구에 투입할 해수(+영양염)에 첨가한 것이고, (F) 접종구에 배양된 미생물을 준비된 여과 해수에 주입하는 과정이고, (G) SOM에 30ml의 해수를 넣은 후 유류에 코팅된 모래와 해수가 섞이지 않는 모습으로, 파스퇴르 피펫을 이용하여 균일하게 섞어 준 것을 보이고, (H) 각 실험구(대조구, 접종구, 현장해수구)를 37℃로 고정된 인큐베이터에 넣어준 것을 보인다.
도 6은 오염시킨 원유의 분해과정 실험결과 지방족 탄화수소 분해도 비교 결과를 보인다.
도 7은 MEBiC 08621 단독 접종과 균주조합 결과에 의한 원유 중 지방족 탄화수소 분해도를 형식승인제품인 (주)비제이씨의 바이오리메디와 비교한 것을 보인다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로서, 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 알카니보락스 속 MEBiC 08621 균주의 분리
1. 시료의 채집 및 농후 배양
본 발명의 알카니보락스속 MEBiC 08621 균주는 경상남도 창녕군 부곡온천수로부터 분리하였다. 채취된 온천수를 실험실로 운반한 후 원유를 분해하는 미생물만을 증균하기 위해 0.3%의 쿠웨이트 중질유가 들어있는 MM2 기초액체배지 ((NH4)2SO4 2.33 g, FeSO4 0.02 g, CaCl2 ·2H2O 0.02 g, MgSO4 ·7H2O 0.25 g, 1 M 인산염완충용액 10 ㎖, 숙성해수 990 ㎖) 10㎖에 온천수 1ml를 첨가하여 4주간 25℃에서 진탕배양하였다. 신선한 동일배지 10㎖에 전 배양액 1㎖을 접종한 후 동일과정을 2회 더 반복하여 증균하였다.
2. 저분자 유기산이용 미생물의 분리
저분자 유기산을 단일탄소원으로 이용하는 미생물을 분리하기 위하여 농후배양액을 0.3%의 초산나트륨이 포함된 MM2 기초고형배지 (MM2 기초액체배지 + 15g의 고순도 한천)에 도말한 후 25℃에서 2주 동안 배양하였다. 배지 표면에서 성장한 미생물 중 형태적 특징이 다른 미생물들을 선발하였다. 선발된 균주는 초산고형배지 (초산나트륨 3 g, 효모추출물 1 g, FePO4 0.01 g, 한천 15 g, 숙성해수 1000 , pH 7.2)에 도말하는 과정을 거쳐 순수배양체를 얻었으며 20%(v/v) 글리세롤에 넣어 -70℃서 보존하였다.
3. 알카니보락스속 미생물의 선별
분리된 미생물 중 원유성분 분해능을 지니는 미생물을 선별하기 위한 방법으로 개별 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 배양된 세균으로부터 상용 키트 (GeneAll)를 사용하여 핵산을 추출하고 추출된 핵산으로부터 16S rRNA 유전자 프라이머, 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'; Escherichia coli nucleotide 8~27)와 1518R (5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3'; Escherichia coli nucleotide 1541~1522) (Giovannoni, 1991)을 사용하여 16S rRNA 유전자를 PCR과정을 거쳐 증폭시켰다. PCR 조건은 주형 DNA 10-100ng를 Premix Taq 중합효소 (T&I, Korea) PCR 용액에 첨가하여 전체 증폭 반응물 용량이 20㎕ 가 되도록 하였으며 핵산 증폭기 모델 T1 Thermocycler (Biometra, Germany)를 이용해 94℃에서 5분간 반응 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 60초씩 30회 반복하였고, 마지막에 72℃에서 10분간 더 반응시켰다. PCR 산물을 분석하기 위해 0.9% agarose gel에 PCR 반응액 2 를 LoadingSTAR (DYNEBIO, Korea)에 반응시켜 전기영동 (0.5% TAE 완충용액, 100 V/cm)한 뒤, UV Illuminator (SeouLin, Korea)로 바로 관찰하였다. 증폭된 약 1500 bp 크기의 DNA 절편은 AccuPrep PCR Purification system (Bioneer, Korea)을 이용하여 정제하였고, 최종 용량은 30 ㎕가 되게 하였다. 증폭된 DNA는 염기서열 분석업체에 의뢰하여 1387개의 염기서열을 얻었다 (도 1). 인터넷을 이용하여 NCBI에 등록된 균주들과 16S rRNA 유전자 유사성을 조사하여 알카니보락스속 균주 MEBiC 08621을 선별하고 16S rRNA 유전자 염기서열로부터 MEBiC 08621 균주의 계통수를 작성하였다 (도 2). 16S rRNA 유전자의 유사도 비교 및 계통수 작성 결과 본 발명자들은 석유탄화수소를 분해하는 MEBiC 08621 균주는 알카니보락스속 (Alcanivorax sp.)의 신종임을 확인하였으며 2013년 5월 7일자로 국립농업과학원 농업유전자원세터에 기탁하여, 수탁번호 KACC91802P를 부여받았다.
[ 실시예 2] 알카니보락스 속 MEBiC 08621 균주의 탄화수소 분해능력
원유를 분해하는 우수분해미생물로 선발된 MEBiC 08621 균주를 대상으로 10종의 지방족 탄화수소에 대한 분해능력을 평가하였다. MEBiC 08621 균주는 0.3%의 초산나트륨이 함유된 MM2 기초액체배지에서 1일간 25에서 진탕배양한 후 MM2 기초액체배지에 각각 30 ppm(0.3%)의 지방족 탄화수소 혼합물 (동량의 데칸, 도데칸, 트라이데칸, 테트라데칸, 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸, 옥타데칸, 에이코세인, 옥타코세인)(C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C28)이 첨가된 20의 배지에 전 배양된 균액 200㎕을 첨가하여 25에서 7일간 배양하였다.
잔류 지방족 탄화수소는 3일, 7일 배양 후 측정하였으며 농도측정을 위한 표준물질로 3 ppm의 스쿠알렌을 추출 전에 배양액에 첨가한 후 20 ml의 디클로로메탄을 첨가하였다. 2분 동안 강하게 혼합한 후 정치하여 층을 분리시켰다. 하층의 디클로로메탄층을 분리 정제하여 1 ml 만 취해 자동시료주입용 병에 옮긴 후 분석을 실시하였다. 분석에는 fused silica capillary column (30 m x 0.25 mm i.d., varian)이 장착된 기체크로마토그래피/불꽃이온화검출기(GC/FID, Varian saturn 3800)을 이용하였다. 이송용 가스로는 고순도의 헬륨이 이용되었으며 분석 시 오븐의 온도조건은 다음과 같다; 80에서 1.5분, 분당 5씩 300℃까지 온도 상승, 3.5분간 300℃유지. 검출된 피크는 표준물질인 스쿠알렌과의 비로 환산한 후 대조구와 비교하여 분해율 (%)로 표현하였다.
MEBiC 08621 균주는 첨가한 지방족 탄화수소 중 C10의 경우 3일간 73%, C12는 3일간 40%를 분해하였으나 C16의 경우 7일간 37%, C20은 7일간 28%, C28은 30%의 분해도를 보여 분자량이 작을수록 빠른 속도로 분해함을 확인할 수 있었다 (도 3).
[ 실시예 3] 알카니보락스속 MEBiC 08621 균주의 성장 특성
석유탄화수소성분 분해균주로 선별된 MEBiC 08621 균주의 최적 배양조건을 확립하기 위하여 단일 탄소원, 최적 생장 조건을 조사하였다.
1. 저분자 유기산을 이용한 성장 증진
초산 농도를 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5% (w/v)농도로 공급하였을 때 0.3% 농도에서 가장 높은 성장을 보였다. 이에 각각 0.3% (w/v)의 탄소기질(개미산, 피루브산, 초산, 프로피온산, 젖산)이 함유된 12 ml의 MM2 기초액체배지에 전 배양된 균액 1%를 접종한 다음 Advantec사의 온도구배배양기(TVS126MA)를 이용하여 25℃에서 72시간 동안 배양하였다. 그 결과 피루브산, 프로피온산, 초산의 순서로 균주의 성장이 활발하고, 개미산과 젖산에서는 성장이 약하지만 개미산 이외에는 마린배지보다 성장이 활발함을 확인하였다 (도4). 별도 실험에서 부티르산에 대한 성장도는 초산보다 조금 낮게 나타났다.
2. 최적생장조건
초산-무기영양염배지 5 ml에 25℃에서 2일간 배양된 MEBiC 08621 균주를 전배양액으로 사용하였다. 온도, 염도, pH 각각에 대해 최적조건을 확립하고자 12개의 L자 시험관에 조건별로 각각 12ml의 배양액을 준비하고 전배양액 100 ㎕를 접종하였다. 접종된 시험관은 Advantec사의 TVS126MA 온도구배 배양기에서 교반속도 60 rpm으로 3일간 배양하였다.
1) 온도
배양기의 온도를 저온부 15℃, 고온부 55℃가 되도록 조절하고 두 온도 사이의 10개 시험관들에 온도구배가 생기도록 하고 배양하였다. 분리균주는 30~43℃사이에서 최적의 성장을 보였다.
2) pH
배지에 1N HCl (pH 4와 5), 30mM MES완충용액 (pH 6), 30 mM HEPES 완충용액 (pH 7과 7.5, Sigma), 30 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8), 30 mM AMPSO 완충용액 (pH 9), 30 mM CAPS 완충용액 (pH 10)으로 pH를 조절하였다. 분리균주는 pH는 6.0-8.5 사이에서 성장을 보였으며 최적 pH는 pH 7-8 사이였다.
3) NaCl농도
분리균주의 NaCl 요구성 조사를 위해 숙성해수 대신 증류수로 대체된 초산-무기영양염배지를 이용하였다. 배지의 NaCl의 농도를 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 8% (w/v)로 조절하였다. MEBiC 08621 균주는 NaCl이 공급되지 않았을 경우 성장하지 못하였고 NaCl의 농도가 1.5-3% (w/v)일 때 최적성장을 보였으며 8% 농도에서도 활발한 성장을 보였다.
이상의 결과를 정리해 보면 알카니보락스속 MEBiC 08621 균주는 0.3% 농도의 피루브산, 프로피온산, 초산, 부티르산을 탄소원으로 사용하여 30~43℃, pH 7-8, 1.5-3% (w/v) 농도의 NaCl 하에서 최적의 성장을 보이며 이때 성장도는 마린배지보다 24시간째에 8~20배, 48시간째에 12~20배 높은 흡광도를 보인다.
[실시예 4] 기존 특허균주 (10-0495833) 노보스핑고비움 펜타로마티보란스 US6-1 ( Novosphingobium pentaromativorans US6-1) 균주와의 혼합 배양을 통한 사질 오염토의 정화능력 검증
1. 미생물 분해 실험 방법
가) 실험구 준비 : 300~500 μm 입도의 모래를 증류수로 세척 후 450 ℃에서 4~5시간 태워서 유기물과 미생물을 제거하였다. 모래 500 g에 풍화된 이란산 원유(29%) 1 g을 넣고 24 시간 혼합하여 모래 오일 혼합물(sand oil mixture; SOM)를 제조하였다. 제조된 SOM을 직경 9 cm의 페트리디쉬에 50 g씩 넣은 후 각 실험구에 0.2 μm 필터로 여과된 멸균 해수 10 ml과 영양염 10 ml을 주입하였다.
나) 균주 준비 : 알카니보락스속 MEBiC 08621 균주는 초산-무기영양염 액체배지에, 방향족 탄화수소 분해균주인 노보스핑고비움 펜타로마티보란스 US6-1 균주는 마린 액체배지에 접종하여 30℃에서 진탕하면서 24시간 배양하였다. 배양 후 균체의 양을 흡광도를 측정하여 결정하였다.
다) 접종 및 배양 : 접종구에는 MEBiC 08621과 US6-1 균주를 각 1종을 1 ml당 약 1억 마리가 되도록 접종하고, 현장해수구에는 0.45 μm 필터로 여과된 해수를 첨가하였다. 이후 37℃ 배양기에서 10일 동안 배양하였다 (도 5).
라) 유류성분 분해도 측정 : 실험구의 유류성분은 표준절차에 따라 추출한 다음 지방족 탄화수소 (Alkanes)와 총탄화수소 (TPH)는 GC/FID로, 방향족 탄화수소는 GC/MS로 분석하였다. TPH 및 지방족 탄화수소는 기름 속에 포함된 성분 중 생물분해가 어려운 nor-hopane에 대한 비율 변화를 기준으로 하여 분해율을 계산하였다.
2. 알카니보락스속 MEBiC 08621 균주와 노보스핑고비움 펜타로마티보란스 US6-1 균주의 혼합 접종을 통한 모래실험구의 유류 분해도
1) 접종구의 탄화수소 농도변화 : 초기 TPH 농도는 518 mg/g 이었으며 미생물 접종 후 지속적으로 감소하여 노출 10일차에는 228 mg/g 으로 초기농도의 56%가 제거되었다. 지방족 탄화수소도 지속적으로 감소하여 초기에 비해 68.8% 감소하였으며, 16PAHs와 알킬PAHs도 각각 73.7%, 72.7% 감소하였다.
2) 현장해수구의 탄화수소 농도변화 : TPH 농도는 초기 418 mg/g 에서 10일 후에는 294 mg/g 으로 29.7% 감소하였고, 알칸화합물의 경우 초기에 비해 61.8%, 그리고 16PAHs와 알킬PAHs의 경우 각각 17.4%, 47.0% 감소하였다.
3) 분해속도 비교를 위해 호판으로 표준화하여 반감기를 계산하였다 (표 2). TPH는 균주 접종 결과 반감기가 대조구의 65%, 지방족 탄화수소는 90%, 16 PAHs는 45%, Alkyl PAHs는 57% 수준을 보여 균주 접종에 의해 석유 탄화수소가 빠르게 분해제거되었음을 알 수 있다.
탄화수소 그룹 접종구 해수구
TPH 3.4 5.2
Alkanes 2.8 3.1
16 PAHs 3.0 6.6
Alkyl PAHs 2.7 4.7
지방족 탄화수소의 경우에도 분해실험 10일이 경과 한 후 상대적으로 환경영향이 강한 저분자량 알칸(nC17이하)은 초기에 비해 60% 이상 분해되었다 (도 6 ).
[ 실시예 5] 균주 혼합에 의한 유류분해능 향상
MEBiC 08621 균주와 그 외에 지방족, 방향족 탄화수소를 분해할 것으로 예상되는 균주들을 혼합하여 원유 분해 능력을 향상시키고자하였다. 대상 균주는 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스 (Marinobacter hydrocarbonoclasticus MEBiC 07579), 할로모나스 오르가니보란스(Halomonas organivorans, MEBiC 08600), 고르도니아 브론치알리스(Gordonia bronchialis MEBiC 08612), 로도코커스 라티스라비엔시스 (Rhodococcus wratislaviensis MEBiC 08618)이며 방향족 탄화수소 분해능이 우수한 기존 특허균주 (10-0495833) 노보스핑고비움 펜타로마티보란스 US6-1 (Novosphingobium pentaromativorans US6-1)을 추가하였다. 대조군으로는 형식승인을 획득한 제품 중 바이오리메디 ((주)비제이씨)를 사용하였다.
마린(Marine)고형배지에 25℃에서 2일간 배양된 각각의 균주들을 마린액체배지 5 에 접종하여 25℃에서 1일간 진탕배양 하여 배양된 균주들은 적정량씩 혼합하여 혼합균주로 사용하였다.
혼합균주의 균주 조성은 다음과 같다.;
① 알카니보락스속 MEBiC 08621 균주
② 알카니보락스속 MEBiC 08621 + 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스 MEBiC 07579 + 할로모나스 오르가니보란스 MEBiC 08600 + 고르도니아 브론치알리스 MEBiC 08612 + 로도코커스 라티스라비엔시스 MEBiC 08618
③ 바이오리메디
0.3%의 원유(쿠웨이트 원유)가 함유된 20 ml의 MM2 기초액체배지에 각 균주 전배양액의 흡광도 값에 따라 미리 혼합해 놓은 배양액 0.6~1.2%를 접종하여 5일간 배양하였다.
잔류 지방족 탄화수소는 표준 방법에 따라 추출하여 정제한 후 1 ml 만 취해 자동시료주입용 병에 옮긴 후 분석을 실시하였다. 분석에는 fused silica capillary column (30 m x 0.25 mm i.d., varian)이 장착된 기체크로마토그래피/불꽃이온화검출기(GC/FID, Varian saturn 3800)을 이용하였다. 이송용 가스로는 고순도의 헬륨이 이용되었으며 분석 시 오븐의 온도조건은 다음과 같다; 80℃에서 1.5분, 분당 5℃씩 300℃까지 온도 상승, 3.5분간 300 ℃유지.
5일 배양 후 대조구를 제외한 모든 조건에서 포화탄화수소가 거의 전량 분해됨으로 인해 생물분해의 바이오마커로 이용되는 C17/프리스탄, C18/파이탄 비율을 계산할 수 없었다. 이에 검출되는 면적 중 용매를 제외한 면적을 바이오마커의 면적으로 나누어 유류분해도를 계산하였다. 알카니보락스속 MEBiC08621만이 접종된 경우 대조구 대비 3.7%의 유류성분만이 검출되어 3.8%의 잔류율을 보인 바이오리메디 제품과 유사한 수준이었으며 4개 균주를 추가하였을 때 1.1%만이 잔류하는 것으로 나타나 위 균주 단독 또는 조합에 활용한 균주들과의 혼합을 통해 96~99%의 지방족 탄화수소가 분해됨을 확인하였다 (도 7).
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91802P 20130507

Claims (8)

  1. 알카니보락스 속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주 (KACC 91802P).
  2. 유류분해를 위한 알카니보락스 속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주 (KACC 91802P).
  3. 제 1 항의 균주를 포함하는 유류분해용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 알카니보락스 속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주 (KACC 910802P), 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스 MEBiC 07579, 할로모나스 오르가니보란스 MEBiC 08600, 고르도니아 브론치알리스 MEBiC 08612 및 로도코커스 라티스라비엔시스 MEBiC 08618를 포함하는 것을 특징으로 하는 유류분해용 조성물.
  5. 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주 (KACC 91802P)을 배양하는 단계; 및
    상기 균주를 탄소수 10 내지 28의 유류에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유류분해 방법.
  6. 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주 (KACC 91802P), 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스 MEBiC 07579, 할로모나스 오르가니보란스 MEBiC 08600, 고르도니아 브론치알리스 MEBiC 08612 및 로도코커스 라티스라비엔시스 MEBiC 08618 혼합 조성물을 제조하는 단계; 및
    상기 조성물을 탄소수 10 내지 28의 유류에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유류분해 방법.
  7. MM2 기초액체 배지성분에 추가적으로 피부브산, 초산, 프로피온산 및 부틸산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기산을 0.05~0.5% (w/v) 농도로 포함하고, 1.5-3% (w/v) 농도의 NaCl를 포함하는 것을 특징으로 하는 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621, 기탁번호 : KACC 91802P) 균주배양용 배지.
  8. MM2 기초액체 배지성분에 추가적으로 피부브산, 초산, 프로피온산 및 부틸산 또는 이들의 염형태로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기산을 0.05~0.5% (w/v) 농도로 포함하고, 1.5-3% (w/v) 농도의 NaCl를 포함하는 배지에 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621, 기탁번호 : KACC 91802P) 균주를 접종하는 단계; 및
    30~43℃, pH 7-8에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 알카니보락스속 MEBiC 08621 (Alcanivorax sp. MEBiC 08621) 균주배양 방법.
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