CN106929454A

CN106929454A - 一株具有石油降解和凝聚性能的菌株cs07及其应用

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Publication number: CN106929454A
Application number: CN201710236892.9A
Authority: CN
Inventors: 刘秋; 于基成; 陈超; 齐小辉
Original assignee: Dalian Minzu University
Current assignee: Dalian Minzu University
Priority date: 2017-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2037-04-12
Also published as: CN106929454B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有石油降解和凝聚性能的菌株CS07及其应用。一株具有石油降解功能的菌株CS07，其16SrRNA序列如SEQ ID No.1所示。本发明首次从海底沉积物中筛选出一株同时具有石油降解和凝聚性能的菌株CS07，该菌株在28℃摇床振荡培养7d后，石油降解率可达到28.55％，15℃摇床振荡培养7d降解率为23.54％。菌株CS07在降解石油的同时，会使石油出现凝聚成颗粒状的现象，同时发酵液澄清。该菌株其石油降解和凝聚性能解决了石油污染后引起的海洋污染问题，使海洋环境完全恢复，并且为开发微生物修复石油污染产品奠定基础。

Description

一株具有石油降解和凝聚性能的菌株CS07及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有石油降解功能的菌株CS07以及利用该菌株进行海洋环境治理。

背景技术

随着全球经济与文化的高速发展，人类对石油资源的需求不断扩大，与此同时，因石油不当开采和利用引发的海洋石油污染问题已经成为了人类当前所面临的严重挑战之一。1967年3月18日，利比亚超级油轮“卡尼丸”号在英国康沃尔海岸附近触礁沉没，所载11.9万t石油全部流入大海，油液很快浸染了康沃尔海岸，这是最早的事故造成石油污染事件。最严重的污染事件发生在1978年3月16日，超级油轮“卡基斯”号在比斯开湾英吉利海峡入口处遭遇风暴触礁断裂，船上22.3万t石油流入大海，半封闭的比斯开湾遭受空前污染。大量石油瞬间溢出进入海洋环境，通过扩散、漂移等作用可对海洋生态环境造成严重破坏。在我国海洋石油污染也日益严重，全国每年直接排入近海的石油约10余万吨，仅渔业损失每年就达数亿元。据全国海洋环境监测网监测，我国近海油类含量超过一二类海水水质标准的海域面积已达到5.6万平方公里。

海洋石油污染将造成生物多样性急剧下降，尤其是石油中所含的多种芳烃类有毒化合物，因其在环境中稳定、持久而且具有生物累积效应和放大效应，使被污染环境的生物多样性急剧降低，因此，石油污染对生态环境特别是生物多样性的破坏将是致命的。目前，人们对石油污染环境处理的方式除了应急处理的物理或化学方法外，人们更加重视能够促使环境完全恢复的生物方法，利用土著微生物进行海洋石油污染治理则备受人们青睐，而获得土著的海洋石油降解微生物也一直是人们关注的热点。在国外早在20世纪40年代就出现了细菌降解石油污染的研究。而中国关于这方面的研究开始于20世纪70年代，在20世纪80年代后，大量的研究成果开始在污水及油污土壤中使用，并且取得了巨大的成功。

目前研究表明，能够降解石油的微生物有70个属，共200多种微生物，他们分别属于细菌、放线菌、霉菌、酵母菌以及藻类。其中，土壤中最常见的石油降解菌主要有：假单胞菌属(Pseudomoonus)、节核细菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、黄质菌属(Flavobacterium)、无色菌属(Acthromobacter)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、森田属(Mortierella)等，在土壤中，细菌和真菌是石油生物降解的最基本作用者。在海洋中最主要的降解菌有：无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、金色担子菌属(Aureobasidium)、假丝酵母菌属(Candida)等。

目前文献报道较多的微生物治理环境石油污染主要集中在陆地石油污染。例如，徐德增等在胜利油田进行油田含油污泥中烃类物质的生物降解技术研究时，在厌氧和好氧条件下，从油污染土壤中分离纯化出4株能降解石油烃的微生物CH1、CH2、CH3和CH4，经过鉴定CH3为假单胞菌属，能以脂肪烃和芳香烃为唯一碳源，进行生物降解，在油泥的初始含油量为9.84g/kg时，经过14d的生物降解，石油污染物的生物降解速率达到了80％以上。徐金兰等从陕北石油污染土壤中富集分离、优选出7株菌株，鉴定结果表明SY21为不动细菌属、SY22为奈瑟氏球菌属、SY23为邻单胞菌属、SY24为黄单胞菌属、SY42为动胶菌属、SY43为黄杆菌属、SY44为假单胞菌属，7株菌的降油试验结果表明，降解8d后，加菌试样的石油烃降解率达到80％左右；采用SY43和SY23菌株对土壤进行生物修复，试验结果表明，投加高效菌株SY43和SY23均可在较短的时间内将土壤中的石油污染物去除，去除率可达88.4％和73.4％。

虽然，生物法治理石油污染环境已经有了大量的研究，但是，目前，应用于石油污染处理的降解菌大多数来源于土壤，而来源于海洋习居降解菌报道相对较少。相对于土壤环境而言，海洋环境具有低温、低氧、寡营养的特点，投放高效降解菌常需伴随投放营养源等，而外源微生物对土著微生物能否长期保持竞争优势，是否会对土著生物造成威胁，投放营养物质是否会对生态环境造成影响，不少学者对此意见不一。而筛选海洋习居降解菌将在很大程度上解决这些问题，这些海洋习居菌所需要的降解条件相对简单，能够适应海洋环境的生长，也不会对海洋生态环境造成威胁，因此，通过筛选海洋微生物来治理海洋石油污染已成为当今研究的研究方向。

发明内容

为解决现有技术中海洋石油污染处理的问题，发明人经过对石油污染海域筛选获得具有石油降解性能的微生物菌株，确定其分类地位并对其石油降解性能进行评价。同时研究发现，菌株CS07在降解石油的同时，还具有使石油凝聚作用，为开发微生物修复石油污染产品奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株具有石油降解功能的菌株CS07，拉丁文学名为Marinobacter maritimus.分类命名：近海海杆菌，其16SrRNA序列如SEQ ID No.1所示。

所述的菌株CS07采集于大连新港石油污染海域海底沉积物，富集分离所得。

所述的菌株CS07已提交保藏，具体保藏信息如下：

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年7月6日；

保藏编号：CGMCC No.12739；

所述的菌株CS07的形态及理化特征为：

菌株CS07在固体LB培养基上在15℃条件下划线培养至单菌落，观察菌株CS07的菌落形态，菌落表面湿润光滑凸起，边缘整齐，多呈圆形，不透明，浅黄色。

菌株CS07菌株呈杆状，无鞭毛，长约0.25-0.56μm，宽约0.13-0.2μm，(图3)菌株CS07深紫色菌体周围有淡紫色荚膜结构(图4)。

所述菌株CS07的用途为以石油降解和凝聚的方式进行石油污染的治理。

所述菌株CS07的分离方法包括以下步骤：将菌株CS07按照1％的接种量接种至富集培养基中，在15-28℃条件下培养，菌株CS07的菌悬液浓度为10⁸cfu/ml，所述的富集培养基组成是：以石油作为唯一碳源添加至无机盐培养基中，石油添加量为无机盐培养基总量的0.5％(v/v)。

所述的无机盐培养基组成为：MgS0₄·7H₂O 0.7g，NH₄NO₃ 1g，KCl 0.7g，KH₂PO₄ 2g，Na₂HPO₄ 3g，天然海水1000mL，pH7.5，灭菌后补加10mL的微量元素混合液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次从海底沉积物中筛选出一株同时具有石油降解和凝聚性能的菌株CS07(拉丁文学名M.Maritimus)。该菌株在28℃摇床振荡培养7d后，石油降解率可达到28.55％，15℃摇床振荡培养7d降解率为23.54％。经GC-MS检测分析，菌株CS07对高碳链的降解能力明显好于中低碳链，且pH值和NaCl浓度对菌株CS07的石油降解能力影响较大，偏碱性环境不利于石油的降解，NaCl浓度过高或过低也均不利于石油的降解，其中NaCl浓度在3％时其降解率最高。在降解菌株筛选的过程中，观察到菌株CS07在降解石油的同时，会使石油出现凝聚成颗粒状的现象，同时发酵液澄清。该菌株其石油降解和凝聚性能解决了石油污染后引起的海洋污染问题，使海洋环境完全恢复，并且为开发微生物修复石油污染产品奠定基础。

附图说明

图1为菌株CS07的菌落形态照片；

图2为菌株CS07的菌体形态照片；

图3为菌株CS0716S rRNA系统发育树；

图4为菌株CS07对石油的凝聚照片；

图5为菌株CS07发酵液对石油的凝聚作用照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。

实施例1

菌株CS07的采集及分离

样品采集于大连新港石油污染海域海底沉积物，采集后冰盒保存，并迅速运回实验室进行石油降解微生物的富集分离。

称取约10g新采集的沉积物样品加入到含100mL富集培养基中的250mL三角瓶中，在15℃静置培养条件下富集1周，然后以梯度稀释分离法分离获得石油降解菌株。

培养基：

无机盐培养基：MgS0₄·7H₂O 0.7g，NH₄NO₃1g，KCl 0.7g，KH₂PO₄ 2g，Na₂HPO₄ 3g，天然海水1000mL，pH7.5，灭菌后补加10mL的微量元素混合液。

微量元素混合液：CaCl₂ 2mg，FeCl₃·6H₂O 50mg，CuSO₄ 0.5mg，MnCl₂·4H₂O0.5mg，ZnSO₄·7H₂O 10mg，蒸馏水1000mL。

富集培养基：在上述无机盐培养基中，添加石油作为唯一碳源，碳源的添加量为：石油按培养基总量的0.5％(v/v)添加。

分离培养基：在富集培养基中添加1.5％的琼脂凝固剂。

实施例2

菌株的形态观察及鉴定：

将菌株CS07分别在以石油为唯一碳源的富集培养基和LB培养基上在15℃条件下划线培养至单菌落，观察菌株CS07的菌落形态。同时挑取菌落至2.5％戊二醛溶液固定1-2h，然后将菌悬液滴于硅片上，自然晾至微湿半干状态，再用pH为7.2的磷酸缓冲液冲洗硅片10min，冲洗3次后，分别用30％，50％，70％，85％，95％，100％乙醇梯度脱水，再向硅片滴加醋酸异戊酯进行固定，放置过夜。第二天将制备好的样品进行镀膜后，进行扫描电子显微镜观察。如图1所示，菌株CS07在固体LB培养基上，菌落表面湿润光滑凸起，边缘整齐，多呈圆形，不透明，浅黄色。如图2所示，菌株CS07菌株呈杆状，无鞭毛，长约0.25-0.56μm，宽约0.13-0.2μm。

根据菌株形态和培养特征排除重复菌株，然后将获得的菌株进行16SrRNA基因序列分析。采用微波法提取分离获得的微生物基因组DNA，以细菌通用引物F27:5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3'，R1492:5'-TACCTTGTTACGAC TT-3'(上海生工合成)，进行PCR扩增，PCR扩增产物的测序结果提交到NCBI的GeneBank数据库进行比对分析，并利用Blast软件和MEGA软件构建获得的微生物菌株系统发育树，进行可培养微生物种群多样性分析。如图3所示为菌株CS0716SrRNA序列分析，结合其形态结构观察，鉴定菌株CS07为Marinobacter maritimus。

实施例3

菌株CS07石油降解性能的测定

菌株CS07石油降解性能评价采用气相色谱法(日本岛津)测定各菌株的石油降解率。以萃取出的石油醚混合物为样品，使用GC-MS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪对菌株降解前后的石油含量变化进行分析。色谱柱型号为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，进样量为1μL。菌株的对石油的降解率计算公式为：其中，η为石油降解率，n₀为空白对照，n₁为接种了菌株的培养液的萃取液中残余的石油含量。

在富集培养基加入150μL石油做为唯一碳源进行各菌株石油降解性能分析。将菌株(菌悬液浓度为10⁸cfu/ml)按照1％的接种量接种至含100ml富集培养基中，分别在15℃静置和150r/min摇床振荡和28℃摇床振荡培养7d后，以30ml石油醚进行萃取，采用GC-MS法测定萃取液中石油烃各组分的降解情况。同时分别观察培养温度(15℃和28℃)，pH值(pH5-9)，NaCl浓度(0-9％)对菌株CS07降解功能的影响。GC-MS分析时，采用石油醚萃取发酵液，以萃取的石油醚混合物为样品。以未加微生物菌株的富集培养基作为对照，实验重复3次。

GC-MS分析石油的色谱条件为：进样口温度为200℃；载气为氦气，柱箱初始温度为40℃，升温程序设定为40℃保持5min，之后以10.00℃/min的速度升温至230℃，保持17min；离子源温度为230℃，扫描范围为50-600amu。

在28℃摇床培养条件下，菌株CS07降解率最高，7d石油降解率可达到28.55％；15℃摇床培养条件下，菌株CS07降解率稍低，7d降解率为23.54％；在15℃静置培养条件下，菌株CS07的降解率最低，7d降解率仅为5.73％(表1)，说明菌株CS07在中温振荡培养时其降解能力明显好于低温静置培养，氧气在石油的降解中十分必要。但菌株CS07的石油降解率明显不高，

在15℃摇床培养7d，pH＝7时，菌株CS07的降解率达到最大值(24.92％)。在NaCl浓度为3％时，菌株CS07的降解率达到最大值，此时菌株CS07的在15℃摇床培养条件下7d的石油降解率为25.69％，之后，随着NaCl浓度的升高，菌株CS07的降解率降低，在NaCl浓度为9％时，菌株CS07已不能降解石油。

实施例4

菌株CS07石油凝聚性能的测定

在降解菌株筛选的过程中，观察到菌株CS07在降解石油的同时，会使石油出现凝聚成球状物质的现象，同时发酵液呈现澄清状态，如图4所示为菌株CS07对石油的凝聚现象照片。其中图4-1是加入石油未接种菌株CS07的发酵液对照；图4-2是接入菌株CS07的发酵液中石油凝聚呈颗粒状，发酵液变清澈。由图4可知，菌株CS07对石油具有一定的凝聚性能，因此，对其性能进行更深入研究。

在100ml富集培养基加入150μL石油做为唯一碳源，然后将菌株CS07(菌悬液浓度为10⁸cfu/ml)以1％的接种量接种至含100ml富集培养基中，在15℃振荡(150rpm/min)培养7d，观察菌株CS07凝聚性能。

采用LB液体培养基振荡培养菌株CS07，使菌株生长至对数期，然后向发酵液中加入石油观察石油的凝聚情况。同时，将培养好的发酵液离心，分别收集上清液和沉淀。对上清液和沉淀的观察如下：(1)向上清液中加入石油观察石油的凝聚情况。(2)向沉淀中加入灭菌的ASM培养基，摇匀后加入石油，观察石油的凝聚情况，同时以ASM培养基作为对照。

如图5所示，其中，a为LB发酵原液对石油的凝聚作用；b为LB发酵液离心后的上清液对石油的凝聚作用；c为LB发酵液离心后的沉淀(即菌体)+ASM培养基混匀后对石油的凝聚作用。石油在发酵液原液、上清液及沉淀的ASM培养基溶液中都发生了凝聚，而对照培养基ASM则没有发生凝聚(图4-1)，石油呈膜状漂浮于ASM培养基表面。

经不同处理后石油凝聚现象也各不相同。振荡培养时，石油均发生了较明显凝聚现象，但低温振荡凝聚现象更为明显，发酵液在3d后就开始变为澄清溶液，石油明显的聚集呈颗粒状。

表1 菌株CS07的降解性能及凝聚情况分析

注：+为凝聚现象不明显，石油呈片块状；++为凝聚现象较明显，石油部分呈颗粒状；+++为凝聚现象很明显，石油全部呈颗粒状，溶液变为澄清。

实验结果：

通过对菌株CS07在不同培养条件下的降解性能评价以及凝聚情况评价，发现菌株CS07在28℃摇床培养条件下降解率最高，但在15℃摇床培养条件下凝聚情况最好，在15℃静置培养条件下，菌株CS07对石油的降解率极低，并且凝聚情况最差。通过GC-MS分析，可知菌株CS07对石油烃中的全组分都可以降解，但在不同条件下降解的组分不同，在28℃摇床培养时，菌株CS07主要降解长链烷烃，因此降解后的石油组分中短链烷烃甚至出现了增加的情况，在15℃培养条件下，石油中各组分都呈现下降的状态，但相比而言菌株CS07在15℃摇床培养的条件下，对石油中各组分的降解较为均衡，在15℃静置培养条件下，石油中短链烷烃的部分降解率较高，而长链烷烃的部分降解率较低。

Claims

1.一株具有石油降解和凝聚性能的菌株CS07，其特征在于，其保藏编号为：CGMCCNo.12739，其16SrRNA序列如SEQ ID No:1所示。

2.如权利要求1所述的一株具有石油降解和凝聚性能的菌株CS07，形态及生理化特征：菌株CS07在固体LB培养基上在15℃条件下划线培养至单菌落，菌落表面湿润光滑凸起，边缘整齐，多呈圆形，不透明，浅黄色；

菌株CS07菌株呈杆状，无鞭毛，长约0.25-0.56μm，宽约0.13-0.2μm。

3.如权利要求1所述的菌株CS07的用途为以石油降解和凝聚的方式进行石油污染的治理。

4.如权利要求1所述的菌株CS07的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：将菌株CS07按照1％的接种量接种至富集培养基中，在15-28℃条件下培养，菌株CS07的菌悬液浓度为10⁸cfu/ml，所述的富集培养基组成是：以石油作为唯一碳源添加至无机盐培养基中，石油添加量为无机盐培养基总量的0.5％(v/v)。

5.根据权利要求4所述的菌株CS07的分离方法，其特征在于，所述的无机盐培养基组成为：MgSO₄·7H₂O 0.7g，NH₄NO₃ 1g，KCl 0.7g，KH₂PO₄ 2g，Na₂HPO₄ 3g，天然海水1000mL，pH7.5，灭菌后补加10mL的微量元素混合液。