CN104711205A - 一种降解石油类污染物的生物方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降解石油类污染物的生物方法；降解原油含量在500mg/L～1500mg/L的石油类污染物时，添加蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)3%～5%(v/v)，使处理环境的温度维持在5℃～40℃，含盐质量在0.9%～6%，pH范围在4.5～9.5之间；蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)为于2013年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.7345；石油类污染物为含有石油类污染物的水体或沙土；本方法对原油、汽油、柴油、煤油、润滑油等各种石油类污染物分别进行了大量实验，芳烃及饱和烃降解效果明显，均取得了期望的效果。

Description

一种降解石油类污染物的生物方法
技术领域
本发明涉及石油类污染物处理领域，具体涉及一种能够快速降解石油类污染物的高效菌。
背景技术
石油类污染物是油田开发和石油加工过程中产生的最重要的污染物。石油类污染物的危害主要表现在对人类、动物、土壤和天然水体的危害和影响。石油类污染物已列入我国危险废物名录，在列入的48种危险废物中，石油类排第8位。
井喷、油罐泄漏、油轮泄漏、油田设备检修、石化生产、运输事故等，都会溢出和排放石油烃类。全世界每年的石油总产量约22亿吨。地表残留的石油会通过挥发污染大气，通过径流污染地表水、海水和滩涂；部分石油类物质可下渗到地下水层从而对地下水造成持久性的污染。而地下水一旦被污染，将持续很长时间。据美国环保局(US EPA)报道，20世纪90年代初美国140多万个地下油罐中，有约10万个有不同程度的泄露，且这一数字在之后迅速增加，其污染面也迅速扩大。有调查研究表明，在我国大庆、胜利油田的油井周围100m范围内采集到的土壤，其含油量多数都高于国家标准临界值(500mg/kg)，而且这些油区受污染的土地面积正在不断扩大，污染程度也日益严重。在辽河油田重污染区域，土壤含油量已达10000mg/kg以上，导致土地不能耕种，而且至少需50年才能恢复。
石油类污染物进入环境后，将对人体和动植物产生严重危害。当水中烃浓度为0.01mg/L时，鱼类在24小时内会出现臭味而不能食用。当水体烃浓度在20mg/L时，鱼类便不能生存。石油类污染物的致癌作用，亦引起了人们的重视。石油中一些组分如多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)具有强致癌、致畸和致突变效应，已被列为优先控制的污染物。
石油对土壤的污染主要集中在油田区。因石油密度较小，乳化能力低且黏着力强，导致大部分污染物粘附在深度20cm左右的土壤表层。在土壤中石油与土粒粘连，进而影响土壤的通透性，引起农作物根系腐烂，造成植物的死亡。此外，土壤中存在的一些石油污染物如多环芳烃会在粮食作物中积累，进而通过食物链危及人类健康。
针对水体及土壤石油类污染生物处理的研究较多，如申请号为201210078420.2中公布的嗜盐芽孢杆菌Y-B可在25℃～35℃条件下处理含油浓度为600mg/L左右的钻井废弃泥浆，7天后菌株对泥浆中原油的降解率达到了70%～80%。但本专利中筛选的蜡状芽孢杆菌在30℃条件下处理含油为1000mg/L的海水污染体系，该菌对原油的降解效率在4天后可达到89%，8天后92.78%的原油被菌株降解。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速降解石油类污染物的方法。
本发明从大港油田板877-4周围的石油污染土壤样中筛选出了1株菌株，命名为B-4-9。所述B-4-9菌株已于2013年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号：CGMCC No.7345。
本发明所筛选出的菌株B-4-9，经鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，可以在5℃～40℃的环境中稳定生长，耐盐度可达6%，适应的pH范围在4.5～9.5之间，具有广泛的酸碱耐受性。
选自本发明的蜡状芽孢杆菌CGMCC No.7345菌株的生物学纯培养物，可应用于降解石油类污染物。比如，可用于处理石油类污染物污染的水体或沙土，针对今年来多见的海洋石油污染情况，具体也可处理石油类污染物污染的海水及沙滩。
通过大量的实验和分析发现，对芳烃及饱和烃的降解效果尤为明显；因此，针对的石油类污染物可以是原油、汽油、柴油、煤油、润滑油中的一种或任意混合。
为了方便保存以及具体操作应用，可以将该蜡状芽孢杆菌的生物学纯培养物制成固态或液态菌制剂。
考虑到该蜡状芽孢杆菌的生物学纯培养物的生长特性（对环境酸碱度适应性强），应用该生物学纯培养物或者其固态或液态菌制剂降解石油类污染物时，通常在自然条件下即可实施；若面临特殊环境，可人为进行调节，使处理体系的温度维持在5℃～40℃，含盐量0.9%～6%（以1.5%～6%为佳），pH范围在4.5～9.5之间，菌剂添加的量在3%～5%(v/v)之间。
在处理体系中加入能够促进蜡状芽孢杆菌生长的营养物质和/或脂肽类生物表面活性剂，能够进一步提高降解石油类污染物的效果。基于对蜡状芽孢杆菌生长特性的现有认识，本领域技术人员可以配置合适的营养物质以促进蜡状芽孢杆菌的生长；一般来说，营养物质可由无机盐及少量的营养激活剂（如酵母膏、微量元素）组成，本发明通过一些实验，确定以下无机盐组分的较佳选择范围：KCl，K2HPO4，MgSO4，FeSO4，(NH4)2SO4，CaCO3，NaCl，KH2PO4、NaNO3。
本发明具有以下优点：
本发明的高效菌制剂B-4-9，具有对石油类污染物适应性强、生物稳定性好等特点，能够对含有石油类污染物的水体、沙土进行处理，可适用于在较低温度及海水条件，可以有效地降低水体、沙土的石油类污染物含量。
在利用本发明的降解石油类污染物的高效菌制剂B-4-9（或含有本发明的降解石油类污染物的高效菌的制剂）处理含有石油类污染物的水体及沙土时，若仅向处理体系中添加无机盐（例如KCl0.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.01g/L，(NH4)2SO42g/L，CaCO33g/L，NaCl10g/L），在原油含量在1000mg/L～1500mg/L、温度为25℃时，6天后B-4-9的原油去除率达到了66%以上；在原油含量在500mg/L～1000mg/L、温度为25℃时，第8天原油降解率可达到79.98%。
在利用本发明的降解石油类污染物的高效菌制剂B-4-9（或含有本发明的降解石油类污染物的高效菌的制剂）处理含有石油类污染物的水体及沙土时，若同时向处理体系中添加无机盐及少量的营养激活剂如酵母膏、微量元素，可提高B-4-9对石油类污染物的去除效率；处理体系中生物表面活性剂的添加亦有利于加速B-4-9对石油类污染物的降解。
利用本发明的降解石油类污染物的高效菌制剂B-4-9（或含有本发明的降解石油类污染物的高效菌的制剂）降解海水中的低浓度石油类污染物，向处理体系中添加促进高效菌生长的营养物质（K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaNO3、酵母膏、微量元素）及脂肽类生物表面活性剂，处理4天后石油类污染物的降解效率可达到89%，8天后92.78%石油类污染物的被菌株降解。
附图说明
图1为含盐量对高效菌B-4-9生长的影响。
图2为酸碱度对高效菌B-4-9生长的影响。
图3为温度对高效菌B-4-9生长的影响。
图4为原油浓度对B-4-9原油去除率的影响。
图5为添加营养激活剂时B-4-9原油去除率与降解时间的关系。
图6为添加脂肽类生物表面活性剂时B-4-9原油去除率与降解时间的关系。
图7为温度对B-4-9降解原油的影响。
图8为海水条件下B-4-9对原油的降解作用。
图9为B-4-9对海沙中原油的降解作用。
图10为原油降解前后饱和烃含量变化比较。
具体实施方式
用于专利程序的微生物保存：
本发明的降解石油类污染物的高效菌B-4-9
保藏日期：2013年3月21日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；
保藏编号：CGMCC No.7345；
分类命名：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
实施例1、高效菌的筛选
该实施例中所用无机盐培养基的具体成分及含量为：KCl0.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.01g/L，(NH4)2SO42g/L，CaCO33g/L，NaCl10g/L，培养基中的原油浓度具体见实施例；所用原油为绥中油田稠油，其特点为蜡含量低，而胶质和沥青质含量高，40℃下脱气原油粘度高达56200mPa·s，后续实施例中所涉及的原油均为同一样品。
实验1、高效菌的初筛
从大港油田板877-4取石油污染土壤，采用液体富集培养法、稀释平板涂布法相结合的方法对降解石油类污染物的高效菌进行分离与纯化。具体步骤如下：
(1)在250mL锥形瓶中加入100mL无机盐培养基，加入原油使其浓度为500mg/L，称取5g土样进行接种，在摇床中进行振荡培养，条件为30℃、190rpm；
(2)1周后，取5mL培养液转接到100mL新鲜的含原油700mg/L的无机盐培养基中培养，培养条件不变；
(3)再次培养1周后，取5mL培养液转接到100mL新鲜的含原油900mg/L的无机盐培养基中培养，培养条件不变，如此再重复驯化3周，各次原油浓度梯度增加200mg/L，至1500mg/L后驯化结束；
(4)将驯化后的样品稀释至一定浓度，涂布于含有1500mg/L原油的无机盐固体培养基中，30℃恒温培养，得到不同菌落，挑单菌反复划线获得可利用原油的纯种菌株，将所获得的单菌分别接种于以原油为唯一碳源的无机盐培养基中，通过比较各菌株作用后原油的降解效率筛选菌株。
通过上述方法获得降解石油类污染物的高效菌，命名为B-4-9，经鉴定其为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
实验2、高效菌的驯化
筛选获得的高效菌株继续通过提高无机盐培养基中原油的浓度进行驯化，所用原油浓度分别为1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L，具体步骤为：
(1)在250mL锥形瓶中加入100mL无机盐培养基，加入原油使其浓度为1000mg/L，接种5mL新鲜的B-4-9培养液，在摇床中进行振荡培养，条件为30℃、190rpm；1周后，取5mL培养液转接到100mL新鲜的含原油仍为1000mg/L的无机盐培养基中培养，培养条件不变；再经过1周培养后重复上述操作一次；
(2)1周后，取5mL培养液转接到100mL新鲜的含原油1500mg/L的无机盐培养基中培养，培养条件不变；再次培养1周后，取5mL培养液转接到100mL新鲜的含原油仍为1500mg/L的无机盐培养基中培养，培养条件不变；再经过1周培养后重复上述操作一次；
(3)如此再继续驯化3周，原油浓度增加至2000mg/L，其它操作不变。
经过上述驯化后，B-4-9对浓度为1000mg/L原油除油率由58.5%提高到67.5%，对浓度为1500mg/L原油除油率由29.8%提高到55.2%，对浓度为2000mg/L原油除油率由22.4%提高到44.9%。将剩余原油萃取后进行四组分分析，结果表明原油中的芳烃及饱和烃含量明显下降，为B-4-9主要降解组分，而沥青质及蜡质组分几乎没有变化。
实施例2、高效菌B-4-9的特性
该实施例中所用液体培养基的具体成分及含量为：K2HPO4·3H2O7.86g/L，KH2PO44g/L，NaNO35g/L，酵母膏10g/L，微量元素（Mg2+，Mn2+，Fe2+）20mL/L，脂肽类生物表面活性剂4g/L，煤油1000mg/L。
取培养24h后的发酵液，利用紫外分光光度计测发酵液在550nm处的吸光度（OD550），根据OD550值判断菌株的生长情况。
实验1、含盐量对高效菌生长的影响
将高效菌接入含盐量（NaCl）不同的液体培养基中，盐浓度分别为0.5%、1%、2%、3%、6%和10%。培养温度为28℃，转速为190rpm。
实验结果如图1所示，高效菌B-4-9在含盐量为6%时仍可较好的生长，表明高效菌B-4-9可以在高矿化度条件下降解石油类污染物。
实验2、酸碱度对高效菌生长的影响
将高效菌接入不同酸碱度的液体培养基中，pH值分别为3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.6、7.2、7.6、8.0、9.0和9.5。培养温度为30℃，转速为190rpm。
实验结果如图2所示，高效菌B-4-9所适应的pH范围在4.5～9.5之间，具有广泛的酸碱耐受性。
实验3、温度对高效菌生长的影响
将高效菌接入液体培养基中，培养温度分别为4℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃，转速为190rpm。
实验结果如图3所示，低温条件下高效菌B-4-9生长较慢，当温度高于50℃时其生长受到抑制。
实施例3、原油浓度对菌株除油效率的影响
取4个100mL的三角烧瓶，每个三角瓶装入40mL含油无机盐培养基，该培养基的具体成分及含量为：KCl0.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.01g/L，(NH4)2SO42g/L，CaCO33g/L，NaCl10g/L，原油浓度分别为800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L，B-4-9发酵液的添加量为5%(v/v)，摇床中震荡培养，温度为25℃，转速为190rpm。7天后通过红外分光测油仪测定经微生物作用后的油含量。
如图4所示，B-4-9的原油去除率随原油浓度的增加而降低，当原油浓度为800mg/L时去除率为79.9%，当原油浓度增加至2000mg/L时去除率为44.9%。原因为石油浓度的增加导致对微生物的毒性增强，抑制了微生物的降解作用，同时微生物代谢产物抑制和营养物质的消耗也不利于微生物降解石油污染物质。将剩余原油萃取后进行四组分分析，结果表明原油中的芳烃及饱和烃含量明显下降，为B-4-9主要降解组分，而沥青质及蜡质组分几乎没有变化。
实施例4、营养激活剂对菌株降解原油的影响
取5个100mL的三角烧瓶，每个三角瓶装入40mL含油培养基，该培养基中添加了有利于微生物代谢增殖的有机营养物及微量元素，具体成分及含量为：K2HPO4·3H2O7.86g/L，KH2PO44g/L，NaNO35g/L，酵母膏10g/L，微量元素（Mg2+，Mn2+，Fe2+）20mL/L，原油800mg/L，B-4-9发酵液的添加量为5%(v/v)，摇床中震荡培养，温度为25℃，转速为190rpm。从第4天开始，每天取出一个样品，通过红外分光测油仪测定经微生物作用后的油含量，连续测定5天。
如图5所示，若在降解体系中添加营养激活剂，可促进菌株对原油的降解速率，6天后B-4-9的原油去除率便可达到70%以上。将剩余原油萃取后进行四组分分析，结果表明原油中的芳烃及饱和烃含量明显下降，为B-4-9主要降解组分，而沥青质及蜡质组分几乎没有变化。
实施例5、脂肽类生物表面活性剂对菌株降解原油的影响
取5个100mL的三角烧瓶，每个三角瓶装入40mL含油培养基，该培养基中添加了脂肽类生物表面活性剂，具体成分及含量为：K2HPO4·3H2O7.86g/L，KH2PO44g/L，NaNO35g/L，酵母膏10g/L，微量元素（Mg2+，Mn2+，Fe2+）20mL/L，脂肽类生物表面活性剂4g/L，原油800mg/L，B-4-9发酵液的添加量为5%(v/v)。摇床中震荡培养，温度为25℃，转速为190rpm。从第4天开始，每天取出一个样品，通过红外分光测油仪测定经微生物作用后的油含量，连续测定5天。
在本实施例中降解体系中添加了脂肽类生物表面活性剂，该试剂的加入有利于分散原油体系，增加菌株与原油的接触面积，促进菌体对原油的利用，如图6所示，4天后B-4-9的原油去除率便可达到75%以上，而实施例4中4天的原油去除率仅为43.89%（图5）。将剩余原油萃取后进行四组分分析，结果表明原油中的芳烃及饱和烃含量明显下降，为B-4-9主要降解组分，而沥青质及蜡质组分几乎没有变化。
实施例6、温度对菌株降解原油的影响
各温度梯度各取5个100mL的三角烧瓶，每个三角瓶装入40mL含油培养基，该培养基的具体成分及含量为：K2HPO4·3H2O7.86g/L，KH2PO44g/L，NaNO35g/L，酵母膏10g/L，微量元素（Mg2+，Mn2+，Fe2+）20mL/L，脂肽类生物表面活性剂4g/L，原油800mg/L，B-4-9发酵液的添加量为5%(v/v)。摇床中震荡培养，温度分别为5℃、10℃、15℃、20℃和25℃，转速为190rpm。从第4天开始，每天取出一个样品，通过红外分光测油仪测定经微生物作用后的油含量，连续测定5天。
如图7所示，低温有利于B-4-9对原油的降解，10℃时菌株对原油的去除效率最高。将剩余原油萃取后进行四组分分析，结果表明原油中的芳烃及饱和烃含量明显下降，为B-4-9主要降解组分，而沥青质及蜡质组分几乎没有变化。
在本实施例中10℃时B-4-9对原油的降解效率最高，而该菌株在20℃时生长最好（图3），二者虽略有差异，但均表明B-4-9属于适冷菌，较高的温度不利于其生长及对原油的降解。
实施例7、海水条件下菌株对高浓度原油的降解作用
取5个100mL的三角烧瓶，每个三角瓶装入40mL含油培养基，该培养基中添加了脂肽类生物表面活性剂，具体成分及含量为：K2HPO4·3H2O7.86g/L，KH2PO44g/L，NaNO35g/L，酵母膏10g/L，微量元素（Mg2+，Mn2+，Fe2+）20mL/L，脂肽类生物表面活性剂4g/L，原油1000mg/L，以海水配制模拟体系，B-4-9发酵液的添加量为5%(v/v)。摇床中震荡培养，温度为30℃，转速为190rpm。从第4天开始，每天取出一个样品，通过红外分光测油仪测定经微生物作用后的油含量，连续测定5天。
如图8所示，在海水条件下B-4-9对原油的降解效率在4天后可达到89%，8天后92.78%的原油被菌株降解。将剩余原油萃取后进行四组分分析，结果表明原油中的芳烃及饱和烃含量明显下降，为B-4-9主要降解组分，而沥青质及蜡质组分几乎没有变化。
实施例8、菌株对模拟沙滩溢油的处理效果
取10L(约16kg)海沙做B-4-9模拟沙滩溢油降解实验，模拟体系中还包含：300mL原油，300mL B-4-9发酵液，1500mL海水，130mL脂肽类生物表面活性剂，0.65g KCl，1.2714g MgSO4·7H2O，1.703g K2HPO4·3H2O，0.0238g FeSO4·7H2O，2.6g(NH4)2SO4。每隔20天取样一次，测定干沙中残油浓度，模拟现场溢油降解试验期间，要保持沙子的湿润性，由于天气干燥，水分蒸发很快，因此需要不定期补加自来水。初始沙堆中含水量为21%，当含水量≤9%时开始补水（一般20天），补水到21%。
如图9所示，对模拟沙滩溢油的去除率，经过120天的生物处理，干沙的残油量已低于3000mg/kg干沙，已达到国家标准值GB4284-84。120天至170天间原油降解率提高幅度较小，原因为实施例中所用的原油较重，胶质、沥青质含量高，难于生物降解。
对降解前后的油样进行色质分析，比较B-4-9降解前后饱和烃相对含量，由图10可知，降解后碳链长度为C17～C32烃的相对含量显著降低，主要由于细菌的代谢过程需要碳合成自身的骨架，且需要碳作为能源物质，因此长碳链的烃被分解为短链烃，短链烃则被降解为CO2和水。其次，由于细菌的降解，降解后烃的总量渐少，也是C17～C32的烃相对含量增加的一个原因。
本发明针对原油、汽油、柴油、煤油、润滑油等各种石油类产品分别进行了大量实验和分析，芳烃及饱和烃降解效果明显，均取得了期望的优异效果。

Claims (4)

1.一种降解石油类污染物的生物方法，其特征在于：降解原油含量在500mg/L～1500mg/L的石油类污染物时，添加蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)3%～5%(v/v)，使处理环境的温度维持在5℃～40℃，含盐质量在0.9%～6%，pH范围在4.5～9.5之间；
所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)为于2013年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.7345；
所述的石油类污染物为含有石油类污染物的水体或沙土。
2.根据权利要求1所述的降解石油类污染物的方法，其特征在于：
处理含有石油类污染物的水体及沙土时，向处理体系中添加KCl0.5g/L、K2HPO41g/L、MgSO40.5g/L、FeSO40.01g/L、(NH4)2SO42g/L、CaCO33g/L或/和NaCl10g/L。
3.根据权利要求1所述的降解石油类污染物的方法，其特征在于：
处理含有石油类污染物的水体或沙土时，同时向处理体系中添加5g/L～10g/L酵母膏、10mL/L～20mL/L微量元素、2g/L～4g/L脂肽类生物表面活性剂。
4.根据权利要求1所述的降解石油类污染物的方法，其特征在于：
降解海水水体中的石油类污染物，向处理体系中添加6g/L～16g/L无机盐、5g/L～10g/L酵母膏、10mL/L～20mL/L微量元素、2g/L～4g/L脂肽类生物表面活性剂。
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