CN114657099B

CN114657099B - 一种石油烃降解菌株及其筛选和应用

Info

Publication number: CN114657099B
Application number: CN202210338131.5A
Authority: CN
Inventors: 英晓光; 吕佳琦
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2042-04-01
Also published as: CN114657099A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种石油烃降解菌株及其筛选与应用。所述菌株分类命名为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）LY‑1，已于2022年2月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022157，其16S rRNA序列如SEQ ID No.3所示。该油砂油降解菌株是从印尼油砂中筛选分离得到的，其对石油烃类化合物具有高效的降解性能，具有很好的应用前景。

Description

一种石油烃降解菌株及其筛选和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种石油烃降解菌株及其筛选与应用。

技术背景

随着能源的枯竭和石油污染的加深，非常规能源油砂油逐渐引起关注，但常规提取油砂油方法能耗高，对环境污染严重，使用无污染的微生物预处理油砂油，转化油砂油中粘稠组分，促进油砂油的分离具有十分广阔的前景。另一方面，在处理石油污染物方面，与传统的物理、化学法相比，微生物处理石油污染物有着低成本，对环境几乎没有破坏等优势。

国内外研究已证明强壮类芽孢杆菌（Paenibacillusehimensis）、地衣芽胞杆菌（B. licheniformis）、三色拟迷孔菌（Daedaleopsis sp）、黄曲霉（Aspergillus spp）、螯台球菌（Chelatococcus daeguensis）等微生物具有将重质油转化为轻质油、降低重质油粘度达到稠油增产的能力。因此通过特异性筛选出特定降解能力的微生物，利用其特有优势解决非常规能源利用与石油污染问题提供生物支持。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一株石油烃降解菌株LY-1。

本发明的第二目的在于提供上述一株石油烃降解菌株LY-1的筛选方法。

本发明的第三目的在于提供上述一株石油烃降解菌株的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一种石油烃降解菌株LY-1，所述菌株分类命名为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）LY-1，已于2022年2月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO：M 2022157，其16S rRNA序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，上述石油烃降解菌株LY-1为革兰氏染色阴性专性需氧细菌，菌体棒状，在LB固体培养基平板上菌落呈圆形、淡黄色不透明、表面光滑湿润、边缘规则、无晕环、中央凸起。

进一步的，上述石油烃降解菌株LY-1是从印尼油砂中筛选分离得到的；其中，印尼油砂为褐色，有黏性，含油量为20.2 %，砂粒粒径为40目。

本发明还提供了上述一种石油烃降解菌株LY-1的筛选分离方法，包括以下步骤：

1）取5g风干后的印尼油砂颗粒加入100mL富集培养基中，在35℃、100rpm条件下富集培养21天，吸取1mL富集培养菌液加入至100mL含有油砂油的分离培养基中继续培养21天；

2）待步骤1）培养结束后，吸取1mL菌液加入至无菌生理盐水中，稀释成10^-5的稀释液，取梯度稀释液涂布于LB固体培养基平板上，在35℃下培养48小时，选择不同形态的单菌落，分别在LB固体培养基平板上进行划线分离，重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落；

3）将步骤2）分离纯化出来的菌株单菌落接种于含有油砂油的分离培养基中，35℃、100rpm恒温振荡培养21天，取1ml培养后的菌液用无菌生理盐水稀释成10^-5的稀释液，涂布于LB固体培养基平板上，在30℃下培养至有菌落出现，挑取单一菌落在固体培养基平板上进行划线分离培养，重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落，进行16S rDNA检测，得到石油烃降解菌株。

进一步的，上述的富集培养基的配方为：KH₂PO₄ 0.085g，K₂HPO₄ 0.210g，Na₂HPO₄•2H₂O 0.330g，NH₄Cl 0.005g，MgSO₄•7H₂O 0.0225g，CaCl₂ 0.0275g，FeCl₃•6H₂O 0.025g，去离子水1000mL，pH为7.0 ± 0.2；在121℃高压蒸汽灭菌20min。

进一步的，上述的分离培养基的配方为：KH₂PO₄ 2.700 g，K₂HPO₄ 13.900 g，NaCl1.000g，酵母抽提物0.500g，NaNO₃ 1.000g，去离子水1000mL，自然pH， 121℃高压灭菌30min后补加5mL硫酸盐混合溶液和5mL微量元素溶液；其中，所述的硫酸盐混合溶液的配方为：MgSO₄ 2.500g、(NH₄)₂SO₄ 10.000g，100mL去离子水，所述的微量元素溶液的配方为：乙二胺四乙酸酯（EDTA）1.000g，MnSO₄•H₂O 3.000g，FeSO₄•7H₂O 0.100g，CaCl₂•2H₂O 0.100g，CoCl₂ •2H₂O 0.100g，ZnSO₄•7H₂O 0.100g，CuSO₄•7H₂O 0.010g，H₃BO₃0.010g，Na₂Mo₄•2H₂O0.010g，AlK(SO₄)₂ 0.010g，去离子水1000mL。

进一步的，上述的油砂油在分离培养基中的含量为0.4g/L。

本发明还提供了上述菌株LY-1在降解石油烃类化合物中的应用。

进一步的，上述的石油烃类化合物包含但不限于油砂油、柴油。

本发明的显著优点在于：

本发明筛选分离得到一株石油烃降解菌株LY-1，其16SrDNA基因序列与模式菌株Bacillus cereus ATCC 14579的相似度为99%，表明该菌株为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。该菌株可在好氧条件下降解油砂油，将重质组分转换为轻质组分，并可高效降解柴油中C17~C24饱和烷烃化合物。

附图说明

图1为石油烃降解菌株LY-1在LB固体培养基平板上的菌落形态图。

图2为石油烃降解菌株LY-1的菌体形态图。

图3为石油烃降解菌株LY-1对油砂油的转换效果。

图4为石油烃降解菌株LY-1对柴油中饱和烷烃的降解效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，如下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中所用到的培养基的配方如下：

富集培养基：KH₂PO₄ 0.085g，K₂HPO₄ 0.210g，Na₂HPO₄•2H₂O 0.330g，NH₄Cl 0.005g，MgSO₄•7H₂O 0.0225g，CaCl₂ 0.0275g，FeCl₃•6H₂O 0.025g，去离子水1000 mL；pH 7.0±0.2；121℃高压蒸汽灭菌20min。

分离培养基：KH₂PO₄ 2.700g，K₂HPO₄ 13.900g，NaCl 1.000g，酵母抽提物0.500g，NaNO₃1.000g，去离子水1000mL；自然pH；121℃高压蒸汽灭菌30min后补加5mL硫酸盐混合溶液和5mL微量元素溶液。其中，硫酸盐混合溶液：MgSO₄ 2.500g、(NH₄)₂SO₄ 10.000g，溶于100mL去离子水；微量元素溶液：乙二胺四乙酸酯（EDTA）1.000g，MnSO₄•H₂O 3.000g，FeSO₄•7H₂O 0.100g，CaCl₂•2H₂O 0.100g，CoCl₂•2H₂O 0.100g，ZnSO₄•7H₂O 0.100g，CuSO₄•7H₂O0.010g，H₃BO₃0.010g，Na₂Mo₄•2H₂O 0.010g，AlK(SO₄)₂ 0.010g，溶于1000mL去离子水。

LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.000g，氯化钠 10.000g，琼脂粉15.000~18.000g，pH值7.0±0.2，25℃，蒸馏水1000 mL；自然pH；121℃高压蒸汽灭菌30min。

以下实施例中所用到的柴油购自中国石化，型号为0号，密度为0.835 kg/L。

以下实施例中所用到的印度尼西亚布敦岛矿区油砂颗粒为褐色，有黏性，经测定含油量为20.2 %，砂粒粒径为40目。

以下实施例中所用到的油砂油为使用120#溶剂油从印度尼西亚布敦岛矿区油砂颗粒中提取得到，提取方法为：以120#溶剂油作为抽提溶剂处理油砂颗粒，以抽提温度75℃、剂砂质量比3∶1、抽提时间40 min进行提取，提取完毕后使用离心机在5000r/min离心10min，分取上层油砂油和溶剂的混合液，在60℃下烘干24h分走溶剂，同时得到产物油砂油。

以下实施例中所用到的试剂与药品均为市售分析纯。

实施例1：菌株的筛选和鉴定

1）采集印度尼西亚布敦岛矿区油砂颗粒，风干后备用。

2）取5g风干后的印尼油砂颗粒加入至100mL富集培养基中，在35℃、100rpm条件下富集培养21天，随后吸取1mL富集培养菌液加入至100mL含有0.4g/L油砂油的分离培养基中继续培养21天；

3）待2）中培养结束后，吸取少量菌液加入至无菌生理盐水中，稀释成10^-5 的稀释液，取稀释液涂布于LB固体培养基平板上，在35℃下培养48小时，挑取不同形态的单一菌落分别在LB固体培养基平板上进行划线分离，重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落；

4）将3）中分离纯化出来的菌株单菌落接种于含有0.4g/L油砂油的分离培养基中，35℃、100rpm恒温培养21天，取1mL培养后的菌液用无菌生理盐水稀释成10^-5的稀释液，涂布于LB固体培养基平板上，在30℃下培养至有菌落出现，挑取单一菌落在LB固体培养基平板上进行划线分离，重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落，得到油砂油降解菌株，将该菌株命名为LY-1；

5）采用细菌DNA提取试剂盒提取菌株LY-1基因组DNA样品，利用引物27F/1492R对样品DNA 进行PCR扩增。

引物27F/1492R核苷酸序列如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反应体系如下：

。

PCR反应条件如下：

。

采用Sanger法对PCR产物进行16S rDNA测序，设备为ABI 3730XL基因测序仪，测序结果采用DNAMAN软件进行拼接处理。

将测序结果得到的序列信息（SEQ ID No.3），输入NCBI数据中的Blast比对系统中，搜索数据库中相似的序列，得到序列比对结果。结果表明，所测得的16S rDNA序列经BLAST比对与模式菌株Bacillus cereus ATCC 14579的相似度为99%，表明该菌株为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus），现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年2月28日，保藏编号为CCTCC NO：M 2022157，建议的分类命名为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）LY-1。

实施例2：菌株形态特征

经形态观察，将油砂油降解菌株LY-1单菌落划线接种至LB固体培养基平板中，将平板倒置于恒温培养箱内，30℃培养48h后，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2~3mm，菌落形态图如图1。电镜观察显示，菌株LY-1菌体呈棒状，扫描电镜图如图2；革兰氏染色结果表明其为阴性菌。

实施例3：菌株油砂油转换能力与饱和烷烃降解能力的测定

将油砂油降解菌株LY-1菌悬液（OD₆₀₀=2.7）以1%（V/V）的接种量接种于含有0.4g/L油砂油的分离培养基中， 40℃、100rpm培养60天后使用120号溶剂油萃取油砂油，然后利用柱层析方法分离石油组分。

将油砂油降解菌株LY-1菌悬液（OD₆₀₀=2.7）以1%（V/V）的接种量接种于含有2g/L柴油的富集液体培养基中，40℃、100r/min培养4天后采用GC-MS法测定柴油中饱和烷烃的降解率，质谱分析后研究细菌降解特性。

菌株LY-1对油砂油的转换效果如图3所示。降解前后，油砂油中树脂含量由60.41±1.03%降至55.03±0.39%，芳烃含量由21.04±1.09%提高至23.42±0.7%，饱和烃含量由17.59±2.08%提高至21.55±0.44%。

菌株LY-1对柴油中饱和烷烃的降解效果如图4所示。菌株LY-1对柴油中C17-C22饱和烷烃的平均降解率达到58.9%，对碳数为24（C24）的饱和烷烃的降解率达76.43%（实验体系中未检测出C23饱和烷烃的存在）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种石油烃降解菌株及其筛选和应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtcgagcga atggattaag agcttgctct tatgaagtta gcggcggacg ggtgagtaac 60

acgtgggtaa cctgcccata agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120

aacattttga accgcatggt tcgaaattga aaggcggctt cggctgtcac ttatggatgg 180

acccgcgtcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc 240

gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300

cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 360

tgaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaagtgcta gttgaataag 420

ctggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480

taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggtggtt 540

tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga aactgggaga 600

cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatatg 660

gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggtctgtaac tgacactgag gcgcgaaagc 720

gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780

tgttagaggg tttccgccct ttagtgctga gttaacgcat taagcactcc gcctggggag 840

tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 900

gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgaaaaccc 960

tagagatagg gcttctcctt cgggagcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1020

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca 1080

tcattaagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1140

cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa 1200

agagctgcaa gaccgcgagg tggagctaat ctcataaaac cgttctcagt tcggattgta 1260

ggctgcaact cgcctacatg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1320

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc 1380

gaagtcggtg gggtaacctt tttggagcca gccgcctaag gtgacagagg g 1431

Claims

1.一种石油烃降解菌株LY-1，其特征在于：所述菌株分类命名为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）LY-1，已于2022年2月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO：M 2022157。

2.如权利要求1所述的菌株LY-1在将油砂油重质组分转换为轻质组分中的应用。

3.如权利要求1所述的菌株LY-1在降解柴油中C17~C24饱和烷烃化合物中的应用。