CN110656069A - 一株石油烃降解菌及其培养筛选与应用 - Google Patents

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Abstract

一株石油烃降解菌及其培养筛选与应用，涉及海洋石油烃降解菌。石油烃降解菌为地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM‑45，所述地中海马特尔氏菌为革兰氏染色阴性的马特尔属的菌株，生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm。可在降解有机化合物中应用；经鉴定一株地中海马特尔氏菌的16S rDNA基因序列于模式菌株Martelella mediterranea DSM 17316，相似度为99.61％。

Description

一株石油烃降解菌及其培养筛选与应用
技术领域
本发明涉及海洋石油烃降解菌，尤其是涉及一株石油烃降解菌及其培养筛选与应用。
背景技术
由于原油中含有不稳定的碳氢化合物，包括多环芳烃、甲苯、乙苯和二甲苯，这些有害物质可以通过呼吸、皮肤吸收和眼球进入人体内的血管中，可引起恶心、头痛、头晕等不适的感觉，甚至致癌，所以这次溢油事件对于附近居民的健康存在很大的威胁。溢油污染事故还会引起大面积海域严重缺氧，破坏海洋生产力，致使大量鱼、虾、贝类和海鸟死亡，造成局部“海洋荒漠化”；浮油被海浪冲到海岸，粘污海滩，造成海滩荒芜，破坏海产养殖和盐田生产，污染或毁坏滨海旅游区，降低海洋生态系统的服务功能和价值。石油污染物的生物富集作用不仅对海洋生物有毒害作用，可以通过食物链最终富集在人体内，从而对人类健康造成严重的危害。随着社会的不断发展，人类对石化产品的不断开发利用，致使环境中多环芳烃污染物浓度在逐年增加，已经威胁到人类的身体健康。存在于环境中的多环芳烃有天然和人为的两种来源。天然来源包括：某些细菌、藻类和植物的生物合成产物；森林、草原燃起的野火及火山喷发物；从化石燃料、木质素、底泥等散发出多环芳烃是长期地质年代间由生物降解物再合成的产物。多环芳烃是最早发现且为数最多的一类化学致癌物，可以引起正常细胞发生转化并发展成肿瘤。目前已对2000多种化合物做了实验，发现有致癌作用的达500多种，其中200多种为多环芳烃及其衍生物(张志家,金祖亮,竺酒恺,徐晓强.1990)。
目前，常用的海洋石油污染的治理方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。与化学、物理方法相比,生物修复对人和环境造成的影响小,且修复费用仅为传统物理、化学修复的30％～50％。生物修复以其投入小，无二次污染的优势被视为最有前途的环境治理手段。生物修复(bioremediation)指生物催化降解环境污染物，减少或最终消除环境污染的受控或自发过程。生物修复的基础是自然界中微生物对污染物的生物代谢作用，由于自然界的生物修复过程一般较慢，难以实际推广应用，因此一般指人为促进条件下的生物修复。20世纪80年代末美国在Exxon Vadez油轮石油泄露的生物修复项目中，短时间内清除了污染，治理了环境，是生物修复成功应用的开端，同时也开创了生物修复在治理海洋污染中的应用。
海洋石油烃降解菌早在一个世纪前就已经被分离到。目前，大概有有79个细菌属、9个蓝细菌属、103个真菌属以及12个蓝藻属能利用烃类物质做为唯一的碳源和能源。在这些种类繁多的烃类降解细菌中，大概只有1/4(19个属)的细菌类降解者是海洋专属的烃类降解者。
在海洋环境中生活着各种各样的石油烃降解菌。在过去的十年里，分离到了许多的烷烃和芳香烃类降解菌，其主要属于变形菌纲的菌株。包括：Alcanivorax spp.、Cycloclasticus spp.、Oleiphilus spp.、Oleispira spp.、Thalassolituus spp.，Marinobacter spp.、Neptunomonas spp.和Planomicrobium spp.(以前被认为动球菌属Planococcus)等属的一些菌株。其中Alcanivorax spp.、Oleiphilus spp.、Oleispiraspp.、Thalassolituus spp.和Planomicrobium alkanoclasticum MAE2是专业的烃类降解菌，能利用不同链长的支链和直链饱和烷烃。对石油污染后的生态环境中菌株动态变化的大量研究表明，土著的Alcanivorax和Marinobacter往往在短时间内成为此生璄中的优势菌株，它们主要负责饱和烷烃的降解。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株石油烃降解菌(Martelella mediterranea)MM-45。
本发明的第二目的在于提供一株石油烃降解菌(Martelella mediterranea)MM-45的筛选方法。
本发明的第三目的在于提供一株石油烃降解菌(Martelella mediterranea)MM-45 16S rRNA核苷酸序列。
本发明的第四目的在于提供一株石油烃降解菌(Martelella mediterranea)MM-45可降解石油烃和高环多环芳烃(芘和苯并芘等)，可在降解有机化合物中应用。
所述石油烃降解菌为地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45，所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45为革兰氏染色阴性的马特尔属的菌株，生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm；所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45的最适生长条件为：pH＝7.0～8.5，温度25～28℃；所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45已于2019年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18724。
所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45筛选自太平洋深海沉积物，样品编号45II-CC-S06-MC01，距沉积物表层4～6cm，大洋45航次第二航段CC海区，153°23.1205′W，12°58.1135′N，沉积物为黄褐色，无味，弱黏性，表层呈半流动状，手搓略有粉砂感，沉积物样品在无菌收集后低温保存。
所述一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45的筛选方法包括以下步骤：
1)取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液和KH2PO4溶液及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4，最后所得培养基pH值约为7.5；
在步骤1)中，所述无菌NH4NO3溶液的加入量可为100g/L，所述KH2PO4溶液的加入量可为10g/L，pH为6.7；所述FeSO4的加入量可为0.4g/L。
2)接种前加入1％(V/V)多环芳烃和烷烃，培养物在28℃条件下进行初步富集培养；
在步骤2)中，所述多环芳烃和烷烃的碳源浓度可为40mg/L。
3)待富集物中培养基均变浑浊，说明烷烃和多环芳烃部分被降解，此时转接第二次，第三次转接到30天时准备分离单菌；
4)取第三次转接即第四轮富集30天时的培养物涂布到HLB固体培养基平板上，28℃温箱培养一周后从平板上挑出不同形态的菌落，分离纯化，提取DNA，进行16s测序，即得地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45。
在步骤4)中，所述HLB固体培养基的组分可为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠30g，琼脂粉15g/L，去离子水1L，pH6.9～7.1。
所述一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45 16S rRNA核苷酸序列可为：
Cgcctgcctccttgcggttagcgcagcgccttcgggtagaaccaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccaacttcatgcacccgagttgcagagtgcaatccgaactgagatggcttttggagattagctcacactcgcgtgctcgctgcccactgtcaccaccattgtagcacgtgtgtagcccagcccgtaagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccagcttatcactggcagtccccctagagtgcccaactaaatgctggcaactaggggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtcctggcgtcccgaaggaaccctcgatctctcgaggtagcaccaaatgtcaagggctggtaaggttctgcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggatagcttaatgcgttaactgcgccaccgatatgcatgcacaccgacggctagctatcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagcgtcagtaatggaccagtaagccgccttcgccactggtgttcctgcgaatatctacgaatttcacctctacactcgcaattccacttacctcttccatactcgagacacccagtatcaaaggcagttccggagttgagctccgggatttcacccctgacttaaatgtccgcctacgtgcgctttacgcccagtaattccgaacaacgctagcccccttcgtattaccgcggctgctggcacgaagttagccggggcttctttaccggctacagtcattatcttcaccggcgaaagagctttacaaccctagggccttcatcactcacgcggcatggctggatcaggcttgcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggctgatcatcctctcagaccagctattgatcgtcggcttggtaggccattaccccaccaactacctaatcaaacgcgggctcatctcttggcgataaatctttcccccgaagggcacatacggtattaattccagtttcccggagctattccgtaccaaaaggtagattcccacgcgttactcacccgtctgccactatcccgaaggatcgttcga。
所述一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45可在降解有机化合物中应用；所述有机化合可为石油烃类化合物；所述石油烃类化合物可为柴油、液态烷烃、多环芳烃等烃类化合物。
经鉴定一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45，其16S rDNA基因序列于模式菌株Martelella mediterranea DSM 17316，相似度为99.61％。地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45可在好氧条件下降解石油烃，并可利用多环芳烃生长的菌株。
附图说明
图1为本发明所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45的菌落宏观形态图。
图2为本发明所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45的多环芳烃降解率。
图3为本发明所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45的烷烃降解率。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：菌株形态特征
将单菌落划线接种至HLB固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱内，28℃培养48h，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm，参见图1。
实施例2：菌株的筛选和鉴定
(1)太平洋深海沉积物(样品编号45II-CC-S06-MC01，距沉积物表层4～6cm，大洋45航次第二航段CC海区，153°23.1205′W，12°58.1135′N)，沉积物为黄褐色，无味，弱黏性，表层呈半流动状，手搓略有粉砂感。沉积物样品在无菌收集后，经低温保存后运送至实验室进行下一阶段研究工作。
取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液(100g/L)和KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4(0.4g/L)，最后所得培养基pH值约为7.5。接种前加入1％(V/V)多环芳烃(碳源浓度为40mg/L)和烷烃，培养物在28℃条件下进行初步富集培养。待富集物中培养基均变浑浊，说明多环芳烃和烷烃部分被降解。此时转接第二次，第三次转接到30天时准备分离单菌。取第三次转接即第四轮富集30天时的培养物涂布到HLB平板上，28℃温箱培养一周后从平板上挑出不同形态的菌落，分离纯化，获得马特尔氏菌的纯菌。
提取该菌的基因组DNA并以此为模板采用通用27F，1492R引物扩增16S rDNA片段，并在EZ Biocloud上选取高相似度序列进行比对。
实施例3：菌株多环芳烃和烷烃降解能力测定
取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液(100g/L)和KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4(0.4g/L)，最后所得培养基pH值约为7.5。接种前加入1％(V/V)烷烃和多环芳烃(碳源浓度为50mg/L)
培养五天后打开瓶口，通过GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)得到样品的质量谱图，测得菲残余量，得到降解率为50％～60％。测得芘残余量，得到降解率为60％～70％。16烷降解率10％～20％，12烷降解率15％～25％，柴油降解率10～20％。多环芳烃降解率参见图2，烷烃降解率参见图3。
序列表
<110> 自然资源部第三海洋研究所；中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）
<120> 一株石油烃降解菌及其培养筛选与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1339
<212> DNA
<213> 地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)
<400> 1
cgcctgcctc cttgcggtta gcgcagcgcc ttcgggtaga accaactccc atggtgtgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 120
gcgattccaa cttcatgcac ccgagttgca gagtgcaatc cgaactgaga tggcttttgg 180
agattagctc acactcgcgt gctcgctgcc cactgtcacc accattgtag cacgtgtgta 240
gcccagcccg taagggccat gaggacttga cgtcatcccc accttcctcc agcttatcac 300
tggcagtccc cctagagtgc ccaactaaat gctggcaact aggggcgagg gttgcgctcg 360
ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtc 420
ctggcgtccc gaaggaaccc tcgatctctc gaggtagcac caaatgtcaa gggctggtaa 480
ggttctgcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540
attcctttga gttttaatct tgcgaccgta ctccccaggc ggatagctta atgcgttaac 600
tgcgccaccg atatgcatgc acaccgacgg ctagctatca tcgtttacgg cgtggactac 660
cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc tcagcgtcag taatggacca 720
gtaagccgcc ttcgccactg gtgttcctgc gaatatctac gaatttcacc tctacactcg 780
caattccact tacctcttcc atactcgaga cacccagtat caaaggcagt tccggagttg 840
agctccggga tttcacccct gacttaaatg tccgcctacg tgcgctttac gcccagtaat 900
tccgaacaac gctagccccc ttcgtattac cgcggctgct ggcacgaagt tagccggggc 960
ttctttaccg gctacagtca ttatcttcac cggcgaaaga gctttacaac cctagggcct 1020
tcatcactca cgcggcatgg ctggatcagg cttgcgccca ttgtccaata ttccccactg 1080
ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct cagtcccaat gtggctgatc atcctctcag 1140
accagctatt gatcgtcggc ttggtaggcc attaccccac caactaccta atcaaacgcg 1200
ggctcatctc ttggcgataa atctttcccc cgaagggcac atacggtatt aattccagtt 1260
tcccggagct attccgtacc aaaaggtaga ttcccacgcg ttactcaccc gtctgccact 1320
atcccgaagg atcgttcga 1339

Claims (10)

1.一株石油烃降解菌为地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45，所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45为革兰氏染色阴性的马特尔属的菌株，生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm；所述地中海马特尔氏菌(Martelellamediterranea)MM-45的最适生长条件为：pH＝7.0～8.5，温度25～28℃；所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45已于2019年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18724。
2.如权利要求1所述地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45，其特征在于其筛选自太平洋深海沉积物，样品编号45II-CC-S06-MC01，距沉积物表层4～6cm，大洋45航次第二航段CC海区，153°23.1205′W，12°58.1135′N，沉积物为黄褐色，无味，弱黏性，表层呈半流动状，手搓略有粉砂感，沉积物样品在无菌收集后低温保存。
3.如权利要求1所述一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液和KH2PO4溶液及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4，最后所得培养基pH值约为7.5；
2)接种前加入1％(V/V)多环芳烃和烷烃，培养物在28℃条件下进行初步富集培养；
3)待富集物中培养基均变浑浊，说明烷烃和多环芳烃部分被降解，此时转接第二次，第三次转接到30天时准备分离单菌；
4)取第三次转接即第四轮富集30天时的培养物涂布到HLB固体培养基平板上，28℃温箱培养一周后从平板上挑出不同形态的菌落，分离纯化，提取DNA，进行16s测序，即得地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45。
4.如权利要求3所述一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45的筛选方法，其特征在于在步骤1)中，所述无菌NH4NO3溶液的加入量为100g/L，所述KH2PO4溶液的加入量为10g/L，pH为6.7；所述FeSO4的加入量为0.4g/L。
5.如权利要求3所述一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45的筛选方法，其特征在于在步骤2)中，所述多环芳烃和烷烃中的碳源浓度为40mg/L。
6.如权利要求3所述一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45的筛选方法，其特征在于在步骤4)中，所述HLB固体培养基的组分为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠30g，琼脂粉15g/L，去离子水1L，pH6.9～7.1。
7.如权利要求1所述一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45 16SrRNA核苷酸序列为：
cgcctgcctccttgcggttagcgcagcgccttcgggtagaaccaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccaacttcatgcacccgagttgcagagtgcaatccgaactgagatggcttttggagattagctcacactcgcgtgctcgctgcccactgtcaccaccattgtagcacgtgtgtagcccagcccgtaagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccagcttatcactggcagtccccctagagtgcccaactaaatgctggcaactaggggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtcctggcgtcccgaaggaaccctcgatctctcgaggtagcaccaaatgtcaagggctggtaaggttctgcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggatagcttaatgcgttaactgcgccaccgatatgcatgcacaccgacggctagctatcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagcgtcagtaatggaccagtaagccgccttcgccactggtgttcctgcgaatatctacgaatttcacctctacactcgcaattccacttacctcttccatactcgagacacccagtatcaaaggcagttccggagttgagctccgggatttcacccctgacttaaatgtccgcctacgtgcgctttacgcccagtaattccgaacaacgctagcccccttcgtattaccgcggctgctggcacgaagttagccggggcttctttaccggctacagtcattatcttcaccggcgaaagagctttacaaccctagggccttcatcactcacgcggcatggctggatcaggcttgcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggctgatcatcctctcagaccagctattgatcgtcggcttggtaggccattaccccaccaactacctaatcaaacgcgggctcatctcttggcgataaatctttcccccgaagggcacatacggtattaattccagtttcccggagctattccgtaccaaaaggtagattcccacgcgttactcacccgtctgccactatcccgaaggatcgttcga。
8.如权利要求1所述一株地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)MM-45在降解有机化合物中应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于所述有机化合为石油烃类化合物。
10.如权利要求8所述应用，其特征在于所述石油烃类化合物为柴油、液态烷烃、多环芳烃烃类化合物。
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