CN109486725A - 一株可降解苯系物和石油烃的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株可降解苯系物和石油烃的菌株，可用于石化污水处理厂区无组织废气处理，所述菌株经过16SrDNA鉴定分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌株已于2018年7月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株代码YJY18‑05,菌株保藏号CGMCC NO.16167,应用时将该菌株制备的菌剂投加到处理装置后对废气的降解效果明显提高，排出的废气中非甲烷总烃减少约70％，苯系物减少约90％，本发明的菌株对苯系物和石油烃具有较好的降解特性，并且不会对环境造成二次污染，在气态污染物治理领域展现了良好的应用前景，具有无二次污染、能耗低、适用能力强等特点。

Description

一株可降解苯系物和石油烃的菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株可降解苯系物和石油烃的菌株及其应用。
背景技术
VOCs是挥发性有机气体(Volatile Organic Compounds)的缩写，是指沸点范围在50～260℃之间的一大类化合物，VOCs的成分复杂，具有的特殊气味能导致人体呈现种种不适应，并具有毒性、刺激性、致癌作用，特别是苯、甲苯等对人体健康会造成很大的伤害，在废水(特别是化工废水)处理过程中都会产生一些不同成分的废气。从石化废水处理装置附近采取气体样品进行气相色谱分析，都有不同成分的挥发性有机气体成分，其中气浮处理装置中产生的废气组分含量较多，挥发性苯系物含量为60mg/m3，挥发性非甲烷总烃类达到945mg/m3，该类废气具有复合性、污染面广等特点，有研究表明VOCs的总质量浓度小于0.2mg/m3时不会对人体健康造成危害；在2-3mg/m3范围内会产生刺激等不适应症状；在3-25mg/m3范围内会产生头痛及其它症状；而大于25mg/m3时对人体的毒性效应更加明显。
利用微生物方法治理石化无组织废气污染的关键在于寻找到具有高效降解该废气活性、不会造成二次污染、培养条件简单、抗冲击能力强的菌株。近年来，有关苯系物和烃类物质降解菌株的研究时有报道，专利CN107418907A公开了一种降解汽油类石油烃的微生物菌剂CGMCC No.13558和CGMCC No.13559，该菌株对500ppm汽油类石油烃降解率120h最高达60.3％；专利CN105018378A公开了一种净化含苯系物厌氧发酵废气的复合菌剂及其制备方法和用途，该菌剂在最适培养条件下对600-1000ppm的苯系物废气10天降解率达90％；专利CN103013885A公开一种苯系物复合降解菌剂，该菌株对200ppm苯系物2天的降解率达90％。
上述已公开的菌剂均系自主筛选分离，对苯系物和石油烃都有一定的降解效果，但降解周期均较长，耐受范围较低，产业化应用中会增加运行成本，在一定程度上限制了菌株的应用推广。
生物法处理石化厂区及其它含有苯系物和石油烃废气的原理主要是利用微生物的新陈代谢将废气转化为细胞代谢的能源、细胞组成物质及无害的小分子物质等，具有反应条件温和、设备简单、运行费用低、二次污染小等优点，但也存在一定的局限性，主要表现在生物降解速率有限，承受负荷不能过高，对具有生物毒性的物质处理效果较差等，因此找寻可降解苯系物和石油烃、耐冲击性强、降解速率高的菌株成为本领域技术人员难以解决的问题。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供了一株枯草芽孢杆菌，可用于石化污水处理厂区无组织废气处理，所述菌株经过16SrDNA鉴定分别为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，该菌株已于2018年7月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株代码YJY18-05,菌株保藏号CGMCC NO.16167，应用时将该菌株制备的菌剂投加到处理装置后对废气的降解效果明显提高，排出的废气中非甲烷总烃减少约70％，苯系物减少约90％，本发明的菌株对苯系物和石油烃具有较好的降解特性，并且不会对环境造成二次污染，在气态污染物治理领域展现了良好的应用前景，具有无二次污染、能耗低、适用能力强等特点。
生物法废气净化技术在气态污染物治理领域展现了良好的应用前景，具有无二次污染、能耗低、适用能力强等特点，培养和筛选出分解能力强、培养周期短的生物菌群是目前生物法废气净化技术趋势，本发明的发明人正是在这一前提下，经过深入的研究从石化污水处理的活性污泥及废气处理装置中分离出5株具有降解活性的菌株，并分别进行分离纯化，从中选出1株降解率最高的菌株，并对该菌株进行比较深入的遗传稳定性及苯系物、石油烃降解效率等研究，发现本菌株对苯系物和石油烃降解效率高、易于培养且有稳定的传代特性，
该菌株形态特征革兰氏阳性菌，无荚膜，短杆状；菌株在普通营养琼脂上形成不规则突起的菌落，菌落表面光滑不透明，较湿润，在显微镜下观察呈快速游动状态；
发明人对其进行进行了16SrDNA测序，其核苷酸序列如Seq ID No：1所示，该序列为菌株的16SrDNA的全序列；所测得的16SrDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株Bacillus subtilis的16SrDNA的核苷酸序列与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株有100％同源性。
因此发明人将其菌株代码命名为YJY18-05；并对其进行了生物保藏，其生物保藏编号为CGMCC NO.16167；
获得上述菌株后，发明人还提供了对应的菌剂生产方法如下：
(1)菌种活化：将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20℃-25℃)活化4h-8h；
(2)液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有100ml LB灭菌液体培养基的三角瓶中，1只试管菌种接种1个三角瓶，振荡培养12-18h制备种子液；
(3)发酵：
①发酵培养基配方：葡萄糖1.5％、麸皮1％、酵母粉1％、硫酸铵3.2％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.03％、硫酸亚铁0.005％、CaCl2 0.02％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水；
②发酵罐灭菌：121℃下灭菌半小时；
③摇瓶倒种:罐压下降至接近零，打开接种口，按体积比1‰倒入步骤(2)中的种子液；
④发酵控制：温度35℃，罐压0.05MPa，起始转速200rpm，溶氧≧20％，空气1：1；
⑤发酵终点判断：溶氧降为20％，pH上升至8.8即为发酵完成；
⑥菌剂应用：菌剂应用于无组织废气的处理时要将其吸附与载体上，因此菌剂应用时最好是现发酵现用，直接用菌液进行挂菌。
菌株的驯化：
(1)挂膜处理：将发酵好的菌剂接入装有填料的如图2所示的生物处理装置中，菌液没过填料为宜；
(2)体系指标控制：温度为室温，PH控制7-8，停留时间20.5s；
(3)苯系物驯化：苯系物浓度从500ppm开始驯化提量，甲苯和苯的体积比为3：1，按照驯化量加入气体发生装置中，每隔2-3h补加一次，驯化梯度按照5％递增，最终驯化浓度为1500ppm；
(3)烷烃驯化：烷烃驯化浓度从500ppm开始驯化提量，正戊烷、正己烷、正庚烷与正辛烷四种物质的体积比为1:1:1:1，按照驯化量加入气体发生装置中，每隔3-4h补加一次，驯化梯度按照5％递增，最终驯化浓度为1500ppm；
(4)苯系物和烷烃混合驯化：苯系物和烷烃添加体积比为1：4(其中甲苯和苯体积比为3：1，正戊烷、正己烷、正庚烷与正辛烷四种物质的体积比为1:1:1:1)，驯化浓度从500ppm开始驯化提量，按照驯化量将苯系物和烷烃加入到气体发生装置中，每隔3h左右补加一次，驯化梯度按照5％递增，最终驯化至1500ppm；
本发明所获得的菌株对苯系物和石油烃有高效降解效果，具体验证方法如下：
A.摇瓶降解实验：
将菌株活化后以5％接种率分别接入含有1000ppm甲苯和1000ppm汽油的培养液中，30℃震荡培养36h，然后进行甲苯与汽油含量测定。
结果如图1所示，该菌株对含1000ppm的甲苯溶液降解率36h为80％，对1000ppm汽油中烷烃的36h降解率为100％。
B.小试模拟实验：
根据无组织废气生物处理装置自行改装一套模拟装置(如图2所示)进行苯系物和烷烃类废气降解实验，该装置由生物处理装置、曝气装置及气体发生装置三部分组成，活化菌株2L，灌入装有火山岩和松树皮的生物处理装置中，以没过填料为宜，挂菌18-72h，期间来回浇灌多次，使菌株充分挂于载体上，苯系物和烷烃按照驯化量加入气体发生装置中，开启曝气装置通气进行实验，苯系物和烷烃通过气体压力作用从生物处理装置底部压入，经过挂菌的填料后从装置上部排出：
结果发现在对甲苯、苯、烷烃进行了梯度驯化后，经检测对这些气体的净化效果较好，苯系物浓度为120-1000mg/m3时降解率基本稳定在90％以上，浓度提高至1200-3000mg/m3时降解率有所下降，随着驯化时间延长最终降解率能维持在80％以上；烷烃浓度为120-1000mg/m3时降解率一直维持在90％-100％，浓度提高至1200-3000mg/m3时降解率有所下降，随着驯化时间延长最终降解率能稳定在90％以上，通过实验跟踪菌株对废气的耐受度及装置运行情况，曝气容器中驯化到最大浓度至0.2％，菌剂对苯系物和烃类物质的降解速率图见图3和图4。
根据石化废水处理厂区废气检测结果取一级气浮与二级气浮废水各一半装与曝气容器中，其它处理条件不变，处理24h后开始取样检测，如图5所示，处理前气体中非甲烷总烃为20-30mg/m3，苯系物为10-20mg/m3，处理后基本检测不到，去除率为100％。
在上述实验的基础上，发明人将上述菌剂应用于无组织废气处理装置，该装置采用生物滤池为主的生物处理工艺，即对各个臭源构筑物产生的臭气加盖密封收集后，通过风机将集中收集的臭气吸入生物滤池，在生物滤池中经过加湿预处理、生物处理，使废气中的恶臭污染物质有效分解，再行排放到大气中，跟踪现有工艺废气处理效果，处理效果不稳定，排出废气中非甲烷总烃在10-100mg/m3波动，苯系物介于10-20mg/m3，结果发现加如本发明驯化后菌剂5d左右检测数据表明处理后非甲烷总烃约10mg/m3，苯系物低于4mg/m3，降解率都在95％以上，与原工艺相比，排出废气中非甲烷总烃和苯系物减少约60％。随着时间的延长对废气的净化效果有所增强，加菌剂10d后检测数据表明处理后非甲烷总烃低于7mg/m3，苯系物约1mg/m3，与原工艺相比，排出废气中非甲烷总烃减少约70％，苯系物减少约90％，两种工艺对废气降解率显著性分析如图6和图7所示；
综上所述，将本发明提供的该菌株制备的菌剂投加到处理装置后对废气的降解效果明显提高，排出的废气中非甲烷总烃减少约70％，苯系物减少约90％，本发明的菌株对苯系物和石油烃具有较好的降解特性，并且不会对环境造成二次污染，在气态污染物治理领域展现了良好的应用前景，具有无二次污染、能耗低、适用能力强等特点。
保藏信息
保藏时间：2018年7月27日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.16167
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所
分类命名:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
附图说明
图1为菌剂对甲苯和汽油溶液的降解效果；
图2为本发明小试和驯化时采用的实验室组装废气处理装置示意图；
该装置由生物处理装置、曝气装置及气体发生装置三部分组成，其中曝气装置设置在气体发生装置内，优选为曝气用气泵，首先将填料加入生物处理装置中，加入培养好的菌剂进行挂膜处理，使菌株充分挂于载体上，苯系物和烷烃按照驯化量加入气体发生装置中，开启曝气装置通气进行实验，苯系物和烷烃通过气体压力作用从生物处理装置底部压入，经过挂菌的填料后从装置上部排出；
图3为苯系物降解速率柱形图；
图4为烷烃降解速率柱形图；
图5为本发明所提供的菌剂对石化气浮废气处理前后气相图谱；
图6为现有工艺与实施例中处理工艺非甲烷总烃降解率对比图；
图7为现有工艺与实施例中处理工艺苯系物降解率对比图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。
实施例1菌株的获得
从石化污水处理的活性污泥及废气处理装置中分离出5株具有降解活性的菌株，并分别进行分离纯化，从中选出1株降解率最高的菌株，并对该菌株进行比较深入的遗传稳定性及苯系物、石油烃降解效率等研究，发现本菌株对苯系物和石油烃降解效率高、易于培养且有稳定的传代特性，
该菌株形态特征革兰氏阳性菌，无荚膜，短杆状；菌株在普通营养琼脂上形成不规则突起的菌落，菌落表面光滑不透明，较湿润，在显微镜下观察呈快速游动状态；
发明人对其进行进行了16SrDNA测序，其序列如Seq ID No：1所示，该序列为菌株的16SrDNA的全序列；所测得的16SrDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株Bacillussubtilis的16SrDNA的核苷酸序列与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株有100％同源性。
因此发明人将其菌株代码命名为YJY18-05；并对其进行了生物保藏，其生物保藏编号为CGMCC NO.16167。
实施例2菌株的发酵
(1)菌种活化：将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20℃-25℃)活化4h-8h，活化时无需额外补加培养基；
(2)液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有100mlLB灭菌液体培养基的三角瓶中，1只试管菌种接种1个三角瓶，振荡培养12-18h制备种子液；
(3)发酵：
①发酵培养基配方：葡萄糖1.5％、麸皮1％、酵母粉1％、硫酸铵3.2％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.03％、硫酸亚铁0.005％、CaCl2 0.02％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水；
②发酵罐灭菌：121℃下灭菌半小时；
③摇瓶倒种:罐压下降至接近零，打开接种口，按体积比1‰倒入步骤(2)中的种子液；
④发酵控制：温度35℃，罐压0.05MPa，起始转速200rpm，溶氧≧20％，空气1：1；
⑤发酵终点判断：溶氧降为20％，pH上升至8.8即为发酵完成；
⑥菌剂应用：菌剂应用于无组织废气的处理时要将其吸附与载体上，因此菌剂应用时最好是现发酵现用，直接用菌液进行挂菌。
实施例3菌株的驯化
(1)挂膜处理：将发酵好的菌剂接入装有填料的装置中，菌液没过填料为宜；
(2)体系指标控制：温度为室温，PH控制7-8，停留时间20.5s；
(3)苯系物驯化：苯系物浓度从500ppm开始驯化提量，甲苯和苯的体积比为3：1，按照驯化量加入气体发生装置中，每隔2-3h补加一次，驯化梯度按照5％递增，最终驯化浓度为1500ppm；
(3)烷烃驯化：烷烃驯化浓度从500ppm开始驯化提量，正戊烷、正己烷、正庚烷与正辛烷四种物质的体积比为1:1:1:1，按照驯化量加入气体发生装置中，每隔3-4h补加一次，驯化梯度按照5％递增，最终驯化浓度为1500ppm；
(4)苯系物和烷烃混合驯化：苯系物和烷烃添加体积比为1：4(其中甲苯和苯体积比为3：1，正戊烷、正己烷、正庚烷与正辛烷四种物质的体积比为1:1:1:1)，驯化浓度从500ppm开始驯化提量，按照驯化量将苯系物和烷烃加入到气体发生装置中，每隔3h左右补加一次，驯化梯度按照5％递增，最终驯化至1500ppm。
实施例4小试实验
A.摇瓶降解实验：
将菌株活化后以5％接种率分别接入含有1000ppm甲苯和1000ppm汽油的培养液中，30℃震荡培养36h，然后进行甲苯与汽油含量测定。
结果如图1所示，该菌株对含1000ppm的甲苯溶液降解率36h为80％，对1000ppm汽油中烷烃的36h降解率为100％。
B.小试模拟实验：
根据无组织废气生物处理装置自行改装一套模拟装置(如图2所示)进行苯系物和烷烃类废气降解实验，该装置由生物处理装置、曝气装置及气体发生装置三部分组成，活化菌株2L，灌入装有火山岩和松树皮的生物处理装置中，以没过填料为宜，挂菌18-72h，期间来回浇灌多次，使菌株充分挂于载体上，苯系物和烷烃按照驯化量加入气体发生装置中，开启曝气装置通气进行实验，苯系物和烷烃通过气体压力作用从生物处理装置底部压入，经过挂菌的填料后从装置上部排出：
结果发现在对甲苯、苯、烷烃进行了梯度驯化后，经检测对这些气体的净化效果较好，苯系物浓度为120-1000mg/m3时降解率基本稳定在90％以上，浓度提高至1200-3000mg/m3时降解率有所下降，随着驯化时间延长最终降解率能维持在80％以上；烷烃浓度为120-1000mg/m3时降解率一直维持在90％-100％，浓度提高至1200-3000mg/m3时降解率有所下降，随着驯化时间延长最终降解率能稳定在90％以上，通过实验跟踪菌株对废气的耐受度及装置运行情况，曝气容器中驯化到最大浓度至0.2％，菌剂对苯系物和烃类物质的降解速率图见图3和图4。
根据石化废水处理厂区废气检测结果取一级气浮与二级气浮废水各一半装与曝气容器中，其它处理条件不变，处理24h后开始取样检测，如图5所示，处理前气体中非甲烷总烃为20-30mg/m3，苯系物为10-20mg/m3，处理后基本检测不到，去除率为100％。
实施例5菌剂的利用
在某石化污水处理公司无组织废气处理装置中进行应用实验，该装置主要针对污水处理场的平流隔油池、涡凹气浮池、溶气气浮池、水解酸化池、A池产生的臭气进行处理，处理气量为6500m3/h，停留时间35.4s，填料为火山岩和腐殖树皮，约40方，处理温度维持20℃以上。
无组织废气处理装置中菌剂接种方法如下：开启无组织废气处理装置中自带系统对填料进行吹脱处理，离心后的菌体加适量清水稀释后加入装置循环水箱中，接种率0.2％，通过装置循环进入生物除臭系统，由内部循环泵将菌液在系统中循环3-4次。
加菌剂5d左右检测数据表明处理后非甲烷总烃约10mg/m3，苯系物低于4mg/m3，降解率都在95％以上，与原工艺相比，排出废气中非甲烷总烃和苯系物减少约60％。随着时间的延长对废气的净化效果有所增强，加菌剂10d后检测数据表明处理后非甲烷总烃低于7mg/m3，苯系物约1mg/m3，与原工艺相比，排出废气中非甲烷总烃减少约70％，苯系物减少约90％，两种工艺对废气降解率显著性分析见表2、图6和图7。
表2原工艺与现工艺降解率显著性比较
注：＊＊表示P<0.01差异极显著。
序列表
<110> 黄河三角洲京博化工研究院有限公司
<120> 一株可降解苯系物和石油烃的菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
aagcggctgg ctccaaaggt tacctcaacg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120
tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaacagattt 180
gtgggattgg cttagcctcg cggcttcgct gccctttgtt ctgcccattg tagcacgtgt 240
gtagcccagg tcaaaagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300
caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc 360
tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420
gtcactctgc ccccgaaggg gaagccctat ctctagggtt gtcagaggat gtcaagacct 480
ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540
cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600
tttgctgcag cactaaaggg cggaaaccct ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt 660
ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgcgcctca gcgtcagtta 720
cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct 780
acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc 840
ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgcgc gctttacgcc 900
caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggcggctggc acgtagttag 960
ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg taccgcccta ttcgaacggt acttgttctt 1020
ccctaacaac agagttttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacggggcg ttgttccgtc 1080
agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg 1140
tttcagtccc agtgtggccg atcacccttt caggtcggct acgcatggtc gccttggtga 1200
gccgttacct caccaactag ctattgcgcc gcgggtccat ctgcaagtgg tagctaaaag 1260
ccacctttta tgattgaacc atgcggttca atcaagcatc cggtattagc cccggtttcc 1320
cggagttatc ccagtcttac aggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctga 1380
cctaagggag caagctcccg tcggtccgct cgactgcatg tt 1422

Claims (3)

1.一株可降解苯系物和石油烃的菌株，其生物保藏编号为CGMCC NO.16167；菌株代码YJY18-05，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
2.根据权利要求1所述的一株可降解苯系物和石油烃的菌株，其特征在于：其核苷酸序列如Seq ID No：1所示。
3.权利要求1所述可降解苯系物和石油烃的菌株在处理石化无组织废气中的应用。
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