CN104403965B - 一种降解水体四环素污染物的栖木槿假单胞菌及其应用 - Google Patents

一种降解水体四环素污染物的栖木槿假单胞菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种降解水体四环素污染物的栖木槿假单胞菌及其应用。该栖木槿假单胞菌DT1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014244。该栖木槿假单胞菌DT1在含有四环素的环境中具有较强的生长能力和良好的降解四环素的能力，该菌株能在72小时之内有效去除废水中的四环素，去除效率达到83.21wt%。本发明为降解四环素类有机污染物提供了有用的菌源，拓宽了对栖木槿假单胞菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。

Description

一种降解水体四环素污染物的栖木槿假单胞菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种降解水体四环素污染物的栖木槿假单胞菌及其应用。
背景技术
四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，其结构均含有并四苯基本骨架。四环素类抗生素是目前世界上使用最广泛、用量最大的抗生素种类之一，近些年来，四环素类抗生素在畜禽和水产养殖过程中作为兽药和饲料添加剂被大量使用，然而这些抗生素未被完全吸收，大部分通过原药和代谢产物的形式排除，其中80％的粪便未经综合处理施用于农田，造成土壤污染。四环素类抗生素进入土壤环境后，通过吸附和分配作用长期存在于土壤环境中。抗生素在环境中持续暴露对生态系统产生明显的毒性效应：抑制微生物的生长代谢，诱发微生物抗性基因污染，破坏土壤中土著微生物群落结构及功能，抑制植物叶绿体活性和根系生长等。四环素对生态和人类健康的危害成为人们普遍关注的对象和研究的热点，其相关研究也得到越来越多的重视。
四环素的降解途径主要包括水解、光解和生物降解，其中，微生物降解是四环素的主要降解途径，也是重要的驱动力之一。在微生物与污染物交互作用中，生物酶是污染物降解过程的直接参与者。微生物通过各类生物酶的作用将抗生素降解转化为能源物质或者对自身无毒害作用的其他代谢产物。因此，筛选到合适的高效的降解菌株显得尤为重要。利用微生物酶的催化作用来处理有机污染物能有效的降低有毒有机污染物的含量，同时还能降低其毒性，因此，微生物降解是一种很有潜力的处理有机污染物的方法，在工业生产的各个方面具有很高的推广价值。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种降解水体四环素污染物的栖木槿假单胞菌及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种水体四环素污染物降解菌，经鉴定命名为栖木槿假单胞菌DT1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年6月4，保藏号为CCTCC NO:M 2014244。
该菌株的菌落形态特征以及生理生化特性为：菌落呈黄色、不透明、圆形、表面光滑，中间隆起、边缘整齐；需氧，革兰氏阴性菌，硝酸盐可以还原成亚硝酸盐；接触酶阳性，氧化酶阳性，脲酶阳性；MR阳性，VP阴性；不产硫化氢，不能淀粉水解；能利用葡萄糖等碳源；最适生长pH值：6.5～9，最适生长温度：25～35℃。
上述栖木槿假单胞菌DT1在降解水体四环素污染物中的应用。
按上述方案，所述栖木槿假单胞菌DT1在降解水体四环素污染物的应用方法为：(1)挑取栖木槿假单胞菌DT1单菌落，于LB液体培养基中培养过夜；(2)取栖木槿假单胞菌DT1菌液，将菌液以体积百分比为0.5％～2％的比例接种于含四环素污染物的废水中，pH值调节为6～9，置于30～35℃的条件下恒温培养48～72小时。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明所述栖木槿假单胞菌DT1在含有四环素污染物的环境中具有较强的生长能力和良好的降解四环素的能力，该菌株能在72小时之内有效降解废水中的四环素有机污染物，降解率达到83.21wt％。本发明为降解四环素有机污染物提供了有用的菌源，同时拓宽了对栖木槿假单胞菌功能方面的应用，因此具有较强的应用价值。
附图说明
图1为栖木槿假单胞菌DT1的16S rDNA分子鉴定过程中PCR产物琼脂糖电泳图(左为Marker；右为扩增产物)。
图2为栖木槿假单胞菌DT1的发育树。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。
实施例1栖木槿假单胞菌DT1的筛选：
(一)、材料准备：
1、实验土壤为模拟四环素污染的土壤，取自中国地质大学。
2、培养基：
筛选培养基：10g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，0.5g/L磷酸氢二钾，1.5g/L琼脂，pH值7。
液体富集培养基：10g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，0.5g/L磷酸氢二钾，pH值7。
LB液体培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，蒸馏水1000mL，pH7.0。
LB固体培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，蒸馏水1000mL，琼脂15g/L(固)，pH7.0。
LB斜面培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，蒸馏水1000mL，琼脂20g/L(固)，pH7.0。
3、实验仪器和设备：
国华SHA-B恒温振荡器，
东器SPX生化培养箱，
立式压力蒸汽灭菌器，
光学显微镜-----Olympus有限公司，
pH计等-----sarporiusPD-10
超净工作台，
PTC200型PCR仪，
电泳仪及电泳槽，
UVP凝胶紫外观测仪。
(二)、菌株的筛选分离与纯化：
1、称取1克四环素污染土壤样品，加入事先灭菌好的装有100mL无菌水的250mL的三角瓶内，30℃、200rpm振荡20min，备用；
2、配置浓度为1000mg/L的四环素母液，微滤除菌后，备用；
3、将100ul四环素母液加入20ml 50℃的筛选培养基中，摇匀并倒入无菌平板上，待培养基冷却，即得到含50mg/L四环素的筛选培养基平板，将土壤水混合物样品在含50mg/L四环素的筛选培养基平板上划线分离，30℃恒温培养几天，直至有菌落出现；
4、将平板上的不同菌落分别在含50mg/L四环素的筛选培养基平板上划线分纯，30℃恒温培养，反复划线操作4-5次。
5、分别将不同平板上的单菌落挑入到液体富集培养基中，30℃恒温震荡培养2d，再以1％接种量加入含50mg/L四环素的液体富集培养基中(取2.5ml四环素母液加入到47.5ml液体富集培养基中得到含50mg/L四环素的液体富集培养基)，30℃避光震荡培养3d，测定培养基中四环素含量，淘汰不能降解四环素的菌株，得到一株能高效降解四环素的菌株，将此菌株置于甘油管中-20℃条件下冷冻保藏。
二、菌株的16S rDNA分子鉴定：
16S rDNA分子鉴定主要按照以下步骤：
(1)细菌核DNA的提取
使用北京百泰克生物技术有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒，
(2)16S rDNA基因的PCR扩增，
由上海桑尼生物工程有限公司合成细菌的通用引物
27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3
在50μL反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，1.5μL 27F和1492R(终浓度为10μM)，1μL dNTP(10mM)，1μLTaq聚合酶(5U/μL)和5μL 10×PCR缓冲液，39μL ddH2O。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；在95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环35次；最后72℃终延伸10min。
(3)PCR产物的回收
将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后(扩增带长度为1412bp，如图1所示)，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5mL离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用浓度为70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。(4)16S rDNA的序列的测定和分析
取菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序，其序列见SEQ IDNO:1。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，该菌株与栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)的同源性高达99.0％，最终从分子水平上确定该菌的种属为栖木槿假单胞菌。
三、菌落形态特征以及生理生化特性：
栖木槿假单胞菌DT1的菌落形态为：菌落呈黄色、不透明、圆形、表面光滑，中间隆起、边缘整齐；需氧，革兰氏阴性菌；硝酸盐可以还原成亚硝酸盐；接触酶阳性，氧化酶阳性，脲酶阳性；MR阳性，VP阴性；不产硫化氢，不能淀粉水解；能利用葡萄糖等碳源；最适生长pH值：6.5～9，最适生长温度：25～35℃。
综合菌株的分子鉴定结果以及生理生化特性，确定该菌株为栖木槿假单胞菌，并命名为栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)DT1。栖木槿假单胞菌DT1的发育树见图2。从图2可以看到，菌株DT1的16S rDNA序列和假单胞菌属的细菌归属于同一簇群，同源性在99％以上，且菌株DT1与Pseudomonas hibiscicola聚在一起，证明DT1菌株为栖木槿假单胞菌。查阅有关资料，尚无此菌株有关降解四环素能力研究的报道。栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)DT1，已于2014年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO:M 2014244。
本发明从模拟四环素长期污染土壤中筛选分离出这一株细菌，并发现其有较好降解四环素的功能。这拓宽了人们对栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)在其功能方面的应用研究思路，并为环境中四环素污染的降解提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。
四、栖木槿假单胞菌DT1的应用：
挑取栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)DT1单菌落于LB固体培养基中培养过夜，待平板菌落长出后挑选单菌落至LB液体培养基中培养24h后，按体积分数比为0.5％-2％的接种量将栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)的种子液接种至含有四环素类污染物的模拟污水中，30～35℃恒温培养，pH值为6.5～9，反应48～72小时。
五、栖木槿假单胞菌DT1降解四环素污染物的能力验证:
分别挑取栖木槿假单胞菌DT1单菌落于LB液体培养基中培养过夜，取0.5mL菌液接种于装有50mL四环素模拟污水中(其四环素含量为50mg/L)的三角瓶中，留一瓶作空白对比。置于30℃、150rpm振荡培养3d，检测四环素残留量计算菌株对四环素去除情况。该菌株能在72小时之内有效去除四环素模拟污水中的四环素，其去除率为83.21wt％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
＜110＞ 中国地质大学（武汉）
＜120＞ 栖木槿假单胞菌DT1
＜160＞ 1
＜210＞ 1
＜211＞ 1412bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 栖木槿假单胞菌
＜400＞ 1
cgagtcgaac ggcagcacag aggagcttgc tccttgggtg gcgagtggcg gacgggtgag 60
gaatacatcg gaatctactc tgtcgtgggg gataacgtag ggaaacttac gctaataccg 120
catacgacct acgggtgaaa gcaggggatc ttcggacctt gcgcgattga atgagccgat 180
gtcggattag ctagttggcg gggtaaaggc ccaccaaggc gacgatccgt agctggtctg 240
agaggatgat cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tggacaatgg gcgcaagcct gatccagcca taccgcgtgg gtgaagaagg 360
ccttcgggtt gtaaagccct tttgttggga aagaaatcca gccggctaat acctggttgg 420
gatgacggta cccaaagaat aagcaccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
aagggtgcaa gcgttactcg gaattactgg gcgtaaagcg tgcgtaggtg gtcgtttaag 540
tccgttgtga aagccctggg ctcaacctgg gaactgcagt ggatactggg cgactagagt 600
gtggtagagg gtagcggaat tcctggtgta gcagtgaaat gcgtagagat caggaggaac 660
atccatggcg aaggcagcta cctggaccaa cactgacact gaggcacgaa agcgtgggga 720
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccctaaac gatgcgaact ggatgttggg 780
tgcaatttgg cacgcagtat cgaagctaac gcgttaagtt cgccgcctgg ggagtacggt 840
cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gtatgtggtt 900
taattcgatg caacgcgaag aaccttacct ggccttgaca tgtcgagaac tttccagaga 960
tggatgggtg ccttcgggaa ctcgaacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1020
gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gtccttagtt gccagcacgt 1080
aatggtggga actctaagga gaccgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140
aagtcatcat ggcccttacg gccagggcta cacacgtact acaatggtag ggacagaggg 1200
ctgcaagccg gcgacggtaa gccaatccca gaaaccctat ctcagtccgg attggagtct 1260
gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga 1320
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtttgt tgcaccagaa 1380
gcaggtagct taaccttcgg gagggcgctg cc 1412

Claims (3)

1.一种降解水体四环素污染物的栖木槿假单胞菌DT1，其特征在于，保藏号为CCTCCNO： M 2014244。
2.权利要求1所述的栖木槿假单胞菌DT1在降解水体四环素污染物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述栖木槿假单胞菌DT1在降解水体四环素污染物中的应用方法为：（1）挑取栖木槿假单胞菌DT1单菌落，于LB液体养基中培养过夜；（2）取栖木槿假单胞菌DT1菌液，将菌液以体积百分比为0.5%~2%的比例接种于含四环素污染物的废水中，pH值调节为6~9，置于30~35℃的条件下恒温培养48~72小时。
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