CN106434467B - 一种青霉素废水高效处理菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青霉素废水高效处理菌剂及其制备方法和应用，包括以下步骤：(1)取生活污水处理厂曝气池中的混合液，加入适量玻璃珠，震荡，然后静置；(2)取上清液，进行梯度稀释，并在含有氯化钠或硫酸钠的固体培养基上进行平板涂布，筛选耐盐菌株；(3)对筛选出的菌株的耐药性进行分析；(4)将上述培养所得的菌株中耐药性高的菌株单独或混合接种到含盐液体培养基中进行培养，即可获得青霉素高效降解菌剂。本发明的制备方法非常简单易行、安全性高、菌剂生产过程中不需要使用抗生素，成本低；所得的菌剂能够高效降解抗生素，可以应用于青霉素污水的高效处理。

Description

一种青霉素废水高效处理菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于废水处理技术领域，更具体地，尤其涉及一种青霉素废水高效处理菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着我国制药工业的快速发展,制药废水的排放问题日益突出，抗生素废水年排放量已达数亿立方米，青霉素废水通常含有高浓度的有机污染物、高盐度和残留青霉素及其相关产物，这样的废水直接使用好氧生物处理技术，能耗非常高。同时由于抗生素的抑菌作用，生物处理效果也不稳定，常规处理工艺无法实现抗生素生产废水的达标排放，更无法适应提标后的排放要求。另外，废水中未降解的抗生素进入环境通过施加选择压力使得抗药菌和抗药基因的丰度增加，抗药菌和抗药基因一旦进入人体就会使药物效果降低，具有很大风险性。因此，如何控制其从废水处理系统中的排放成为一个重要的问题。
生化法作为抗生素废水的主要处理技术，与物化处理技术相比成本大大降低，但是现有生物处理技术仍然存在处理效果不理想、耐冲击能力差、出水水质不稳定等问题。因此，对现有生物处理系统进行优化并开发出新的高效生物强化技术就有着十分重要的意义，其中开发高效生物处理菌剂是解决抗生素废水生物处理过程中各种问题的一种有效途径，通过向生物反应器投加抗生素废水高效处理菌剂可有效提高处理效率、增强系统耐冲击负荷的能力，并保持出水水质稳定。
经检索，关于抗生素废水处理菌剂的研究已有相关公开。如中国专利申请号为201310148812.6的发明专利公开了一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，该申请案包括以下步骤：(1)将活性污泥加入培养基中，以梯度压力式驯化法驯化；驯化后，静置，取上层水样，梯度稀释后采用涂布分离法和平板划线法分离，然后再进行培养、纯化，将分离出的菌株接种至牛肉膏和蛋白胨培养基中，振荡培养至其处于对数生长期；(2)将上述培养所得的菌株接入培养基中培养，即得。此外，中国专利申请号为201610109635.4的发明专利公开了一种磷霉素降解菌筛选及其菌剂制备方法和应用，该申请案所使用的富集培养基、筛选培养基和驯化培养基是以磷霉素作为唯一碳源的培养基，在磷霉素浓度梯度逐渐升高的培养基中，强化微生物对磷霉素的耐受力和降解效率，并是这些微生物成为混合菌的优势菌种。通过这些申请案提到的方法虽然可以得到高效降解菌剂，但其在筛选过程中需使用大量抗生素选择培养，以筛选分离出高效菌株，导致菌剂制备和生产成本较高，工艺复杂。因此，研究出一种成本较低、工艺操作简单，同时能够有效保证废水处理效果的抗生素废水处理菌剂的制备方法对废水处理意义重大。
发明内容
1.发明要解决的技术问题：
本发明针对现有青霉素废水处理菌剂的制备和生产成本相对较高、制备工艺复杂，从而限制了其在水处理过程中应用的问题，本发明的目的之一是提供了一种青霉素废水高效处理菌剂，对青霉素废水的处理效果非常好，能够应用于其他污水中青霉素及高浓度有机物的有效去除。
本发明的另一目的是提供这种菌剂的制备方法，本发明的制备方法简单易行、安全性高、菌剂制备过程中不需要大量使用青霉素，成本较低。
本发明的另一目的是提供这种菌剂的应用，本发明制备所得的菌剂能够用于高效降解青霉素，可以应用于污水处理中青霉素及高浓度有机物的有效去除。
2.技术方案
本发明的一种青霉素废水高效处理菌剂的制备方法，其步骤为：
(1)取生活污水处理厂曝气池中的混合液，通过震荡处理使污泥充分打散，然后进行静置处理；
(2)取静置后得到的上清液进行梯度稀释，并在含有氯化钠或硫酸钠的固体培养基上进行平板涂布，于20～32℃下培养24h～48h，筛选耐盐菌株；
(3)对筛选出的菌株的耐药性进行分析得到耐药菌株；
(4)将培养所得的耐药菌株单独或混合接种到液体培养基中进行培养，即获得所述的青霉素高效降解菌剂。
更进一步的，所述步骤(1)中将生活污水处理厂曝气池中的混合液置于离心管中，加入适量直径为0.2～1.0mm的玻璃珠，填充比为1％～3％，然后置于涡旋振荡器上振荡10～30min，振荡结束后静置10～60min。
更进一步的，所述步骤(2)中固体培养基所含NaCl或Na2SO4的质量浓度各为2～10％。
更进一步的，所述步骤(2)中筛选耐盐菌株的具体操作为：菌株培养结束后挑取单菌落至相应平板上划线培养，反复挑取分离纯化，并将单菌株在与固体培养基相应的液体培养基中进行扩大培养，一部分加入10～50％的甘油保存。
更进一步的，所述步骤(3)中采用微量肉汤稀释法对初筛菌株进行药物敏感性分析，以待处理青霉素作为敏感性药品。
更进一步的，所述步骤(3)中采用微量肉汤稀释法对初筛菌株进行药物敏感性分析时，在无菌96孔板中浓度梯度设置为：256ppm、128ppm、64ppm、32ppm、16ppm、8ppm、4ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0ppm，并设置一组对照组，将96孔板置于30℃培养24h后，用酶标分析仪于600nm测各孔OD值，获得不同菌株的最小抑制浓度，最小抑制浓度越高，菌株的耐药性越好。
更进一步的，所述步骤(4)中液体培养基的配方为：蛋白胨0.5～2％，牛肉膏0.3～1.2％，氯化钠或硫酸钠2％～10％，加水定容至1000mL，调节该液体培养基的pH值为7.0～7.3。
更进一步的，所述步骤(2)中固体培养基的配方为：蛋白胨0.5～2％，牛肉膏0.3～1.2％，氯化钠或硫酸钠2％～10％，琼脂1.8％～3.6％，加水定容至1000mL，调节该液体培养基的pH值为7.0～7.3。
更进一步的，一种青霉素废水高效处理菌剂，采用上述的方法制备得到。
更进一步的，一种青霉素废水高效处理菌剂的应用，根据本发明的制备方法制备得到的菌剂可应用于污水处理领域。
更进一步的，一种青霉素废水高效处理菌剂，该菌剂为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)，其菌株于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.12829。
3.有益效果
(1)本发明的一种青霉素废水高效处理菌剂的制备方法，该方法与其它青霉素降解菌剂制备过程不同，采用本发明的方法制备青霉素废水高效处理菌剂时无需大量使用抗生素，其制备工艺简单易行、安全性高、成本低，且其制备得到的菌剂同时能够有效保证对青霉素废水的处理效果，便于推广应用，为废水处理技术的发展做出了较大贡献；
(2)采用本发明的方法制备得到的菌剂同时能够应用于其他污水中抗生素及高浓度有机物的有效去除。
附图说明
图1为本发明的一种青霉素废水高效处理菌剂的制备方法的工艺流程图；
图2为实施例1中摇瓶实验菌株的青霉素降解速率图；
图3为污水处理小试实验中投加实施例1制备的青霉素废水高效处理菌剂与未投加青霉素废水高效处理菌剂的COD去除率对比图；
图4为污水处理小试实验中投加实施例1制备的青霉素废水高效处理菌剂与未投加青霉素废水高效处理菌剂的青霉素去除率对比图。
生物样品保藏信息：
本发明中的菌剂为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)，该菌株于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏号为CGMCC NO.12829。
具体实施方式
实施例1
1.菌株分离和鉴定
本实施例展示了一种青霉素废水高效处理菌剂的制备方法，其工艺流程图如图1所示，其具体步骤为：
(1)采集生物污水处理厂曝气池中的混合液10mL，放入50mL离心管中，加入直径为0.5mm的玻璃珠，填充比为1％，然后置于涡旋振荡器上振荡10分钟，充分打散污泥，然后静置10分钟。
(2)取1mL静置后的上清液进行梯度稀释，然后分别平板涂布于含有2％(质量浓度)硫酸钠的固体培养基中，于20℃下培养24h，挑取单菌落至新的平板上划线培养，反复挑取分离纯化，并将单菌株在与固体培养基相应的液体培养基中进行扩大培养，一部分加入10％的甘油保存。其中，固体培养基的配方为：蛋白胨1％，牛肉膏0.6％，硫酸钠2％，琼脂1.8％，加水定容至1000mL，调节pH值至7.0-7.3。
(3)采用微量肉汤稀释法对初筛菌株进行青霉素耐药性分析，以青霉素作为敏感性药品。在无菌96孔板中浓度梯度设置为：256ppm、128ppm、64ppm、32ppm、16ppm、8ppm、4ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0ppm，并设置一组对照组，将96孔板置于30℃培养24h后，用酶标分析仪于600nm测各孔OD值，获得不同菌株的最小抑制浓度。
(4)通过上述筛选获取了一株耐药性较高的菌株，将该菌株接种到100mL的液体培养基，置于250mL锥形瓶中，在温度为30℃和搅拌速度为150r/min条件下避光振荡培养，培养至对数增长期，即获得本发明的青霉素高效降解菌剂。液体培养基的配方为：蛋白胨1％，牛肉膏0.6％，硫酸钠2％，加水定容至1000mL，调节pH值至7.0～7.3。
经16S测序和生理生化鉴定，本发明培养得到的菌株为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)，该菌株生物学特性为G-，菌体呈短杆状，有较厚荚膜，无芽孢，无鞭毛，其菌落呈灰白色粘液状，菌体大小为0.5～0.8um×1～2um。该菌株已于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号是：CGMCC NO.12829。
2.摇瓶实验
本实施例所提供的青霉素废水高效处理菌剂在菌株接种量为2％，青霉素初始浓度为200mg/L，pH为7.0～7.5，培养温度为30℃，振荡速率为160r/min条件下的实验数据如图2所示，由图2所示，经24h培养后，剩余青霉素的浓度为30.3mg/L，降解效率达85％以上，对青霉素的降解效果较好。
3.污水处理小试实验
本实施例制备所得的青霉素废水高效处理菌剂可以应用于污水处理领域。将本实施例制备得到的青霉素废水高效处理菌剂按5％的比例投加于小试装置中，在进水温度为20～35℃，pH为6.5～7.8，停留时间为14h的条件下，处理模拟青霉素废水，废水成分为：COD1000mg/L，NH4 +-N 200mg/L，青霉素200mg/L，盐度为2％，其实验数据如图3-图4所示，由图可以看出，投加青霉素废水高效处理菌剂后，小试装置出水中COD浓度为50～149mg/L，青霉素浓度为11～40mg/L，相比未投加青霉素废水高效处理菌剂前，COD去除率平均提高45％，青霉素去除率平均提高51％。因此，本实施例制备得到的青霉素废水高效处理菌剂对污水的处理效果较好。
实施例2
1.菌株分离和鉴定
本实施例展示了一种青霉素废水高效处理菌剂的制备方法，其工艺流程图如图1所示，其具体步骤为：
(1)采集生物污水处理厂曝气池中的混合液10mL，放入50mL离心管中，加入直径为1.0mm的玻璃珠，填充比为2％(占离心管的体积比)，然后置于涡旋振荡器上振荡20分钟，充分打散污泥，然后静置30分钟。
(2)取1mL静置后的上清液进行梯度稀释，然后分别平板涂布于含有2％(质量浓度)氯化钠的固体培养基中，于25℃下培养32h，挑取单菌落至新的平板上划线培养，反复挑取分离纯化，并将单菌株在与固体培养基相应的液体培养基中进行扩大培养，一部分加入20％的甘油保存。其中，固体培养基的配方为：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，氯化钠2％，琼脂2.4％，加水定容至1000mL，调节pH值至7.0-7.3。
(3)采用微量肉汤稀释法对初筛菌株进行青霉素耐药性分析，以青霉素作为敏感性药品。在无菌96孔板中浓度梯度设置为：256ppm、128ppm、64ppm、32ppm、16ppm、8ppm、4ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0ppm，并设置一组对照组，将96孔板置于30℃培养24h后，用酶标分析仪于600nm测各孔OD值，获得不同菌株的最小抑制浓度。
(4)通过上述筛选获取了一株耐药性较高的菌株，将该菌株接种到100mL的液体培养基，置于250mL锥形瓶中，在温度为30℃和搅拌速度为150r/min条件下避光振荡培养，培养至对数增长期，即获得本发明的青霉素高效降解菌剂。液体培养基的配方为：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，氯化钠2％，加水定容至1000mL，调节pH值至7.0～7.3。
经16S测序和生理生化鉴定，本发明培养得到的菌株为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)，该菌株生物学特性为G-，菌体呈短杆状，有较厚荚膜，无芽孢，无鞭毛，其菌落呈灰白色粘液状，菌体大小为0.5～0.8um×1～2um。
2.摇瓶实验
本实施例所提供的青霉素废水高效处理菌剂在菌株接种量为2％，青霉素初始浓度为200mg/L，pH为7.0～7.5，培养温度为30℃，振荡速率为160r/min条件下，对青霉素的降解效果基本同实施例1。
3.污水处理小试实验
本实施例制备所得的青霉素废水高效处理菌剂可以应用于污水处理领域。将本实施例制备得到的青霉素废水高效处理菌剂按5％的比例投加于小试装置中，实验条件同实施例1，,本实施例制备得到的青霉素废水高效处理菌剂对污水的处理效果基本同实施例1。
实施例3
1.菌株分离和鉴定
本实施例采用上述方法展示了一种四环素废水高效处理菌剂的制备过程，其工艺流程图如图1所示，其具体步骤为：
(1)采集生物污水处理厂曝气池中的混合液10mL，放入50mL离心管中，加入直径为0.2mm的玻璃珠，填充比为3％，然后置于涡旋振荡器上振荡20分钟，充分打散污泥，然后静置30分钟。
(2)取1mL静置后的上清液进行梯度稀释，然后分别平板涂布于含有10％(质量浓度)硫酸钠的固体培养基中，于25℃下培养48h，挑取单菌落至新的平板上划线培养，反复挑取分离纯化，并将单菌株在与固体培养基相应的液体培养基中进行扩大培养，一部分加入50％的甘油保存。其中，固体培养基的配方为：蛋白胨2％，牛肉膏1.2％，硫酸钠10％，琼脂3.6％，加水定容至1000mL，调节pH值至7.0-7.3。
(3)采用微量肉汤稀释法对初筛菌株进行四环素耐药性分析，以四环素作为敏感性药品。在无菌96孔板中浓度梯度设置为：256ppm、128ppm、64ppm、32ppm、16ppm、8ppm、4ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0ppm，并设置一组对照组，将96孔板置于25℃培养24h后，用酶标分析仪于600nm测各孔OD值，获得不同菌株的最小抑制浓度。
(4)通过上述筛选获取了一株耐药性较高的菌株，将该菌株接种到100mL的液体培养基，置于250mL锥形瓶中，在温度为30℃和搅拌速度为150r/min条件下避光振荡培养，培养至对数增长期，即获得本发明的青霉素高效降解菌剂。液体培养基的配方为：蛋白胨2％，牛肉膏1.2％，硫酸钠10％，加水定容至1000mL，调节pH值至7.0～7.3。
由于本实施例中采集的生物污水处理厂曝气池中的混合液不同于实施例1，所以经16S测序和生理生化鉴定，本实施例培养得到的菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，该菌株生物学特性为G-，菌体呈杆状，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，菌体大小为1.5～5.0um×0.5～1um。
2.污水处理小试实验
本实施例制备所得的四环素废水高效处理菌剂可以应用于污水处理领域。取某四环素废水好氧活性污泥段出水进行小试，废水中COD浓度为500mg～1000mg/L，NH4 +-N浓度为40～80mg/L，四环素浓度为100～200mg/L，盐度为3～5％，将本实施例制备得到的四环素废水高效处理菌剂按10％的比例投加于小试装置中，在进水温度为25℃，pH为6.5～7.8，停留时间为24h的条件下，其出水中COD的浓度为50～100mg/L，四环素浓度为10～30mg/L，小试装置处理效果良好，主要污染物去除率均在85％以上。结果表明，本实施例制备得到的四环素废水高效处理菌剂对污水的处理效果较好。
实施例4
1.菌株分离和鉴定
本实施例采用上述方法展示了一种四环素废水高效处理菌剂的制备过程，其工艺流程图如图1所示，其具体步骤为：
(1)采集生物污水处理厂曝气池中的混合液10mL，放入50mL离心管中，加入直径为0.8mm的玻璃珠，填充比为1％，然后置于涡旋振荡器上振荡30分钟，充分打散污泥，然后静置60分钟。
(2)取1mL静置后的上清液进行梯度稀释，然后分别平板涂布于含有10％(质量浓度)氯化钠的固体培养基中，于32℃下培养48h，挑取单菌落至新的平板上划线培养，反复挑取分离纯化，并将单菌株在与固体培养基相应的液体培养基中进行扩大培养，一部分加入20％的甘油保存。其中，固体培养基的配方为：蛋白胨1.5％，牛肉膏0.8％，氯化钠10％，琼脂2.4％，加水定容至1000mL，调节pH值至7.0-7.3。
(3)采用微量肉汤稀释法对初筛菌株进行四环素耐药性分析，以四环素作为敏感性药品。在无菌96孔板中浓度梯度设置为：256ppm、128ppm、64ppm、32ppm、16ppm、8ppm、4ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0ppm，并设置一组对照组，将96孔板置于25℃培养24h后，用酶标分析仪于600nm测各孔OD值，获得不同菌株的最小抑制浓度。
(4)通过上述筛选获取了一株耐药性较高的菌株，将该菌株接种到100mL的液体培养基，置于250mL锥形瓶中，在温度为30℃和搅拌速度为150r/min条件下避光振荡培养，培养至对数增长期，即获得本发明的青霉素高效降解菌剂。液体培养基的配方为：蛋白胨1.5％，牛肉膏0.8％，氯化钠10％，加水定容至1000mL，调节pH值至7.0～7.3。
经16S测序和生理生化鉴定，本实施例培养得到的菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)，该菌株生物学特性为G-，菌体呈杆状，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，菌体大小为1.5～5.0um×0.5～1um。
2.污水处理小试实验
本实施例制备所得的四环素废水高效处理菌剂可以应用于污水处理领域。取某四环素废水好氧活性污泥段出水进行小试，废水中COD浓度为500mg～1000mg/L，NH4 +-N浓度为40～80mg/L，四环素浓度为100～200mg/L，盐度为3～5％，将本实施例制备得到的四环素废水高效处理菌剂按实施例3中所述的条件进行试验，结果表明，本实施例制备得到的四环素废水高效处理菌剂对污水的处理效果较好。
综上，本发明的青霉素废水高效处理菌剂的制备方法与其它青霉素降解菌剂制备过程不同，采用本发明的方法制备青霉素废水高效处理菌剂时无需大量使用抗生素，其制备工艺简单易行、安全性高、成本低，且其制备得到的菌剂同时能够有效保证对青霉素废水的处理效果，便于推广应用。此外，采用本发明的方法制备得到的菌剂能够应用于其他污水中青霉素及高浓度有机物的有效去除。

Claims (2)

1.一种青霉素废水高效处理菌剂，其特征在于：该菌剂为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)，其菌株于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.12829。
2.一种权利要求1所述菌剂在青霉素废水处理中的应用。
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