CN104263682A

CN104263682A - 一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用

Info

Publication number: CN104263682A
Application number: CN201410467144.8A
Authority: CN
Inventors: 高彦征; 刘娟; 刘爽; 孙凯
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2034-09-12
Also published as: CN104263682B

Abstract

本发明公开了一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用。一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌马赛菌(Massilia sp.)Pn2，于2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12927。利用该菌株制备的菌剂在实验室摇瓶培养条件下3d内对初始浓度为150mg·L^‐1的菲降解率可达95％以上，同时该菌可在不同程度上降解萘、苊、蒽和芘。利用浸根处理将菌剂定殖于植物根表后将植物种植于受菲污染的营养液中，能够在短时间内使植物体内的菲含量降低50％以上，显著降低了植物体的菲污染风险，且对植物生长有明显的促进作用。

Description

一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用

技术领域

本发明属于环境多环芳烃(PAHs)污染生物修复领域，涉及一种具有PAHs降解功能的植物促生内生细菌及其生产的菌剂和应用。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是由2个或2个以上苯环组成的土壤环境中常见的一类重要持久性有机污染物，其疏水性强、难于降解。作为疏水性有机污染物，土壤中PAHs可被植物吸收并在体内积累。如何减低植物PAHs污染风险是当前农业环境领域研究的热点之一。

植物内生细菌是指能够定殖在植物健康组织间隙或细胞内、并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物，具有促进植物生长、增强宿主植物抗逆性、抗病虫害等作用，并可作为生防菌和外源基因的重要载体。然而，关于植物内生菌影响植物吸收有机污染物的报道至今仍很少。有研究表明，内生细菌可以提高有机污染土壤上植株的根长和生物量，增强植株对有机污染物的耐受性。而Barac等将利用基因改造过的内生细菌浸染黄色羽扇豆，发现通过植物叶片挥发的甲苯量减少50～70％。

有学者推测筛选具有降解特性的植物内生菌并将其定殖在目标植物上，有望提高植物对有机污染物的降解作用，降低有机物在植物体内的积累，进而减低作物有机污染风险。然而，针对PAHs等持久性有机污染物，国内外仍少有资料报道，且未见相关专利研究和应用报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种具有PAHs降解功能的植物促生内生细菌(以下简称功能内生细菌)。

本发明的另一目的是提供该功能内生细菌生产的菌剂。

本发明的又一目的是提供该功能内生细菌在降低植物PAHs污染风险中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

功能内生细菌马赛菌(Massilia sp.)Pn2，2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12927, 保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一种用所述的马赛菌(Massilia sp.)Pn2所生产的功能内生细菌菌剂，是通过以下方法生产而成：

1)将保藏编号为CGMCC 1.12927的马赛菌(Massilia sp.)Pn2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％(V/V，以培养基体积为基准，下同)的接种量接种入种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为200转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：胰蛋白胨0.5g·L^-1，可溶性淀粉0.5g·L^-1，葡萄糖0.5g·L^-1，酵母膏0.5g·L^-1，酪蛋白氨基酸0.5g·L^-1，磷酸氢二钾0.3g·L^-1，丙酮酸钠0.3g·L^-1，七水合硫酸镁0.05g·L^-1，pH 7.0-7.4；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝0.55，即为功能内生细菌菌剂，可直接用于植物的浸根处理。

所述的保藏编号为CGMCC 1.12927的马赛菌(Massilia sp.)Pn2在降解PAHs的应用；优选所述的马赛菌(Massilia sp.)Pn2在降解水体，土壤以及植物体内PAHs的应用。

所述的多环芳烃(PAHs)选自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一种或多种。

本发明所述的降解菌剂在降解多环芳烃中的应用；优选在降解水体，土壤或植物体内多环芳烃的应用。

所述的多环芳烃优选自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一种或多种。

有益效果

本发明筛选获得一株马赛菌(Massilia sp.)Pn2(CGMCC 1.12927)，利用该菌株制备的功能内生细菌菌剂在实验室摇瓶培养条件下3d内对初始浓度为150mg·L^-1的菲降解率可达95％以上,同时该菌可在不同程度上降解萘、苊、蒽和芘。利用浸根处理将该菌剂定殖于植物根表后将植物种植于受菲污染的营养液中，能够在短时间内使植物体内的菲含量降低50％以上，显著降低了植物体的菲污染风险，且对植物生长有明显的促进作用。

本发明描述的环境修复菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理水体，土壤以及植物体内的PAHs污染。本发明为在PAHs污染区生产健康的农产品提供了技术支持，同时对于保障PAHs污染环境下的农产品安全具有重要意义。

附图说明

图1菌株Pn2的菌落照片和透射电镜照片

A图为菌株Pn2的菌落照片，B图为菌株Pn2的透射电镜照片

图2菌株Pn2以150mg·L-1菲为唯一碳源时的生长和降解曲线

生物材料保藏信息

功能内生细菌Pn2，分类命名为马赛菌(Massilia sp.)保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 1.129271，保藏日期为2014年8月26日。

具体实施方式

实施例1 菌株的分离和鉴定

将采自南京江宁扬子石化芳烃厂排污口的新鲜看麦娘植株进行表面消毒：植物用自来水冲洗干净后，于超净台内用75％酒精漂洗3～5min，而后用无菌水冲洗3～4次，再用1％次氯酸钠溶液漂洗2～5min，最后用无菌水再冲洗数次。将经表面消毒的植物样品移入LB固体平板上，于30℃培养24h后，检查平板上是否有细菌生长。若无菌落长出，则说明植株表面消毒成功。

将经检验消毒完全的植株移入无菌研钵，用灭菌剪刀剪碎后，加无菌水充分研磨，取上清液以5％的接种量加入到100mL的无机盐培养基中，并添加菲至150mg·L^‐1作为唯一碳源，于30℃，180r·min^‐1摇床培养7d，以5％的接种量转接到相同的培养基中，连续转接三次后，梯度稀释富集液，取10^‐4‐10^‐7稀释度的富集液各0.1mL涂布于添加150mg·L^‐1菲的无机盐平板上，于30℃恒温培养3d后，挑取长出的单菌落接种于含有150mg·L^‐1菲的无机盐液体培养基中，于30℃，180r min^‐1摇床培养7d，验证其对菲的降解效果。无机盐培养基配方为：NH₄NO₃1.0g·L^‐1，KH₂PO₄0.5g·L^‐1，K₂HPO₄1.5g·L^‐1，NaCl 1.0g·L^‐1，MgSO₄·7H₂O 0.2g·L^‐1，pH 7.0；固体培养基加16g·L^‐1琼脂。

降解效果的验证方法：向培养液中加入等体积色谱甲醇后，超声处理30min，使瓶中菲全部溶解，12000r min^‐1离心去除沉淀后取上清液用滤膜过滤(孔径0.22μm)，用高效液相色谱法测定其中的菲含量。高效液相色谱(岛津LC‐20AT，检测器型号SPD‐20A)设定参数为：Inertsil ODS‐SP‐C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇:水＝90:10，流速0.90mL·min^‐1，柱温40℃，紫外检测波长245nm，进样量10μl。外标法按峰面积定量。

从富集液中分离到一株菲降解菌，命名为菌株Pn2。菌株Pn2降解菲前后的液相色谱检测结果表明菌株Pn23d内对初始浓度为150mg·L^‐1的菲降解率大于95％。菌株Pn2在固体培养基上生长3d后，菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐，呈乳白色，有光泽，菌体易挑起。在透射电子显微镜下该菌呈短杆状，端生鞭毛，不形成芽孢。G^‐，好氧生长，其生理生化特性见表1。菌株Pn2的形态和生理生化特征和Bergey's manual of systematic bacteriology上对马赛菌的描述是一致的。

以菌株Pn2的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度为1400bp的16S rRNA基因序列(GenBank登录号为JX270637)。在RDP数据库(https://rdp.cme.msu.edu/)中进行Blast，结果表明菌株Pn2与马赛菌属菌株的同源性最近，与Massilia niastensis 5516S‐1T菌株的序列相似性达到98％。结合生理生化特征将该菌鉴定为马赛菌属(Massilia sp.)，将该菌送交中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC 1.12927，保藏日期为2014年8月26日。

表1 菌株Pn2的生理生化特性

注：+表示发酵糖类只产酸不产气及其它试验中呈阳性反应，‐为阴性反应。

实施例2 修复菌剂的发酵

使用上述菌株Pn2生产修复菌剂的工艺为：斜面种—摇瓶种子液—种子罐—产品(包装剂型为液体菌剂)。

2)将上述培养好的菌种按5％的接种量接种入种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为200转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；

其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：胰蛋白胨0.5g·L^‐1，可溶性淀粉0.5g·L^‐1，葡萄糖0.5g·L^‐1，酵母膏0.5g·L^‐1，酪蛋白氨基酸0.5g·L^‐1，磷酸氢二钾0.3g·L^‐1，丙酮酸钠0.3g·L^‐1，七水合硫酸镁0.05g·L^‐1，pH 7.0‐7.4；

实施例3 培养基中菌株Pn2对PAHs的生物降解实验

在无机盐培养基(同实施例1)中加入终浓度为150mg·L^‐1的菲，以5％接种量接入菌株Pn2(CGMCC 1.12927)，设接种灭活的菌株Pn2对照，30℃恒温摇床振荡培养。定时取样检测菌株Pn2以150mg·L^‐1的菲为唯一碳源生长时的生长情况以及对菲的降解情况，结果见图2。菌株Pn2可以菲为唯一碳源生长良好，且在3d内对初始浓度为150mg·L^‐1的菲的降解率达到95％以上。

按上述方法，将菌株Pn2(CGMCC 1.12927)依次接入含萘(100mg·L^‐1)、苊(100mg·L^‐1)、蒽(50mg·L^‐1)、芘(20mg·L^‐1)和苯并[a]芘(10mg·L^‐1)的无机盐培养基(同实施例1)中，设接种灭活的菌株Pn2对照，30℃恒温摇床振荡培养。定时取样检测菌株Pn2以上述各种PAH为唯一碳源生长时的生长情况以及对各PAH的降解情况，结果见表2。各种PAH的检测方法参照文献进行。其中，萘的检测参照Zhang J等2012年发表在《Bioresour Technol》杂志上的文章《Isolation of a thermophilic bacterium,Geobacillus sp.SH‐1,capable of degrading aliphatic hydrocarbons and naphthalene simultaneously,and identification of its naphthalene degrading pathway》(124:83‐89)中关于萘的检测方法进行。苊的检测参照Ghosal D等2013年发表在《Res Microbiol》杂志上的文章《Characterization of the metabolic pathway involved in assimilation of acenaphthene in Acinetobacter sp.strain AGAT‐W》(164:155‐163)中关于苊的检测方法进行。蒽的检测参照Jacques RJS等2005年发表在《Int Biodeter Biodegr》杂志上的文章《Anthracene biodegradation by Pseudomonas sp.isolated from a petrochemical sludge landfarming site》(56:143‐150)中关于蒽的检测方法进行。芘的检测方法按如下进行：向培养液中加入二倍体积色谱甲醇后，超声处理30min，使瓶中芘全部溶解，12000r min^‐1离心去除沉淀后取上清液用滤膜过滤(孔径0.22μm)，用高效液相色谱法测定其中的芘含量。高效液相色谱(岛津LC‐20AT，检测器型号SPD‐20A)设定参数为：Inertsil ODS‐SP‐C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇:水＝90:10，流速1.00mL·min^‐1，柱温40℃，紫外检测波长245nm，进样量20μl。外标法按峰面积定量。苯并[a]芘的检测参照Moody JD等2004年发表在《Appl Environ Microbiol》杂志上的文章《Degradation of Benzo[a]pyrene by Mycobacterium vanbaalenii PYR‐1.》(70:340‐345)中关于苯并[a]芘的检测方法进行。

表2.菌株Pn2对各种PAH的降解能力

实施例4 功能内生细菌菌剂的应用

黑麦草种子经1％次氯酸钠表面消毒10min后，无菌水冲洗3次，催芽后播种于装有灭菌蛭石的育苗盘中，出苗7d后，选取长势一致的植株，将黑麦草的根浸泡于制备好的功能内生细菌Pn2的菌悬液中(OD₆₀₀＝0.55)3h，设接种灭活的菌株Pn2为对照。将处理好的植株移入300mL棕色玻璃器皿中，其中含有250mL Hoagland营养液(菲含量为0或2mg·L^‐1，每皿10株植物)，于光照培养箱中进行水培处理。培养12d后分别取黑麦草的根和茎叶部检测植物生物量，植物体内功能内生细菌Pn2的数量以及菲含量。

植物体内功能内生细菌Pn2的数量检测方法如下：将植物样品表面消毒后研磨(同实施例1)，将研磨液适当稀释后(同实施例1)涂布于含有终浓度为150mg·L^‐1菲，75mg·L^‐1氨苄青霉素以及25mg·L^‐1氯霉素的无机盐平板，于30℃恒温培养7d后，对平板上长出的产生明显水解圈的菌落进行计数，并随机挑取产生水解圈的菌落进行16S rRNA基因测序分析以及菲降解功能验证，以确保这些菌株为功能内生细菌Pn2。

培养液中菲的测定方法如下：准确移取一定量培养液于玻璃离心管中，用等体积甲醇稀释后过0.22μm孔径滤膜，利用HPLC分析其中的菲含量(分析条件同实施例1)。植物样品中菲的测定方法如下：植物样品经蒸馏水充分淋洗后，用滤纸吸干表面水分，将其剪碎混匀后，取一定量于25mL玻璃离心管中，用30mL 1：1的丙酮和正己烷溶液分3次、每次10mL超声萃取30min，并将萃取液收集、过无水硫酸钠柱后，转移到旋转蒸发瓶中。40℃恒温下将萃取液浓缩至干，用正己烷定容到2mL，取1mL过硅胶柱净化，并用12mL二氯甲烷和正己烷(1：1)溶液洗脱。洗脱液收集到旋转蒸发瓶后，40℃恒温下浓缩至干，用甲醇定容到2mL，过0.22μm孔径滤膜后，利用HPLC分析其中的菲含量(分析条件同实施例1)。

结果表明，经浸根处理后，功能内生细菌Pn2可以在黑麦草根表定殖并形成生物膜结构，且定殖在植物根表的菌株Pn2可以进入到植物根内部组织，并可进一步迁移到植物的茎叶部(表3)。功能内生细菌Pn2在植物体内的定殖有效促进了植物的生长，植物的鲜重、干重、根长和茎叶长都有明显增加(表4)。此外，功能内生细菌Pn2在植物体内的定殖有效降低了菲在植物体内的累积，与接种灭活菌株Pn2的对照相比，植物地上部和地下部中的菲含量皆降低了50％以上(表5)。

表3.水培培养12天后定殖在黑麦草根表和体内的功能内生细菌Pn2数量

URB(菲含量为0mg·L^‐1，种植黑麦草且接种Pn2),CRB(菲含量为2mg·L^‐1，种植黑麦草且接种Pn2).

表4.水培培养12天后黑麦草根部和茎叶部的生物量

UR(菲含量为0mg·L^‐1，种植黑麦草且接种灭活Pn2),URB(菲含量为0mg·L^‐1，种植黑麦草且接种Pn2),CR(菲含量为2mg·L^‐1，种植黑麦草且接种灭活Pn2),CRB(菲含量为2mg·L^‐1，种植黑麦草且接种Pn2).

表5.水培培养12天后黑麦草根部和茎叶部的菲含量和积累量

CR(菲含量为2mg·L^‐1，种植黑麦草且接种灭活Pn2),CRB(菲含量为2mg·L^‐1，种植黑麦草且接种Pn2)。

Claims

1.一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌马赛菌(Massilia sp.)Pn2，2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12927。

2.一种用权利要求1所述的功能内生细菌马赛菌Pn2所生产的降解菌剂，其特征在于是通过以下方法生产而成：

1)将保藏编号为CGMCC 1.12927的马赛菌Pn2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为200转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为55～60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝0.55，即为所述的降解菌剂。

3.权利要求1所述的功能内生细菌马赛菌Pn2在降解多环芳烃中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的功能内生细菌马赛菌Pn2在降解水体，土壤或植物体内多环芳烃中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的多环芳烃选自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一种或多种。

6.权利要求2所述的降解菌剂在降解多环芳烃中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于权利要求2所述的降解菌剂在降解水体，土壤或植物体内多环芳烃的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的多环芳烃选自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一种或多种。