CN1800350A - 芳香烃化合物的降解细菌及其分离纯化和生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细菌，尤其涉及一种芳香烃化合物的降解细菌及其分离纯化和生产方法。降解细菌，从餐橱油烟的污染土壤与来自针叶林的腐殖土混合中培养出来，现已在中国典型培养物保藏中心保藏。细菌为帕氏氢噬胞菌，分类命名Hydrogenophaga palleronii LHJ38，保藏在CCTCC，保藏编号No：M203053。该细菌为G+，个体形态为弯杆状，大小为0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，产浅黄绿色－褐色色素，不代谢乳糖；最适宜生长温度为26－28℃，最适宜生长pH为6.8－7.2，兼性自养，兼厌气性。本发明的降解细菌，使萘等芳香烃类环境污染物降解90％以上。与已有技术相比，菌株专一性和适应性强，便于增殖和利用开发。
Description
技术领域
本发明涉及细菌，尤其涉及一种芳香烃化合物的降解细菌及其分离纯化和生产方法。
背景技术
芳香烃类化合物在自然界中普遍存在，它们是煤炭、石油等化石性燃料的天然组成成分；植物体也可产生多种酚类次生代谢产物；另外人类在工业(特别是制药、印染等工业)生产过程中也会产生大量结构复杂的芳香烃类化合物。在自然界中它们多以酚或卤代烃的形式存在。由于它们的化学结构具有特殊的热稳定性，同时又难溶于水，所以一般很难消除。而极低含量的这类物质就可以对人体造成强效的或潜在的危害。
以多环芳香烃为例，这是一类在环境中普遍存在的物质，其产生主要是有机物的不完全燃烧。如煤和石油制品的燃烧、原油加工、木材加工、汽车排放的尾气污染物以及生活或工业废物的焚烧处理等。在自然界中，这类物质[特别是较高分子量(四环以上)的]可以保持其固有的毒性而持久存在。它们难溶于水，能在土壤中积累，且它们在食物链中有累积作用。在这类物质以较低浓度存在的情况下，就能引发人体组织器官的癌变以及肝、肾、心肌等多种组织器官的功能衰竭。
如何消除这类污染物在很长时间内一直困扰着人们。微生物降解法显然是比较优秀的方法之一，而其关键就在于如何获得具有特定降解能力的微生物菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种芳香烃化合物的降解细菌。
本发明的另一个目的在于提供一种芳香烃化合物的降解细菌分离纯化方法。
本发明的再一个目的在于提供一种芳香烃化合物的降解细菌的生产方法。
本发明通过如下措施来实现：
一种芳香烃化合物的降解细菌，从餐橱油烟的污染土壤与来自针叶林的腐殖土混合中分离出来，现已在中国典型培养物保藏中心保藏。
一种芳香烃化合物的降解细菌，其特征在于，该细菌为帕氏氢噬胞菌，分类命名Hydrogenophaga palleronii LHJ38，保藏在CCTCC，保藏编号No：M203053，保藏日期2003年6月20日。
帕氏氢噬胞菌的特征为：G+，个体形态为弯杆状，大小为0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，产浅黄绿色-褐色色素，不代谢乳糖；最适宜生长温度为26-28℃，最适宜生长pH为6.8-7.2，兼性自养，兼厌气性。
一种芳香烃化合物的降解细菌分离纯化方法，其特征在于取餐橱油烟的污染土壤与来自针叶林的腐殖土混合；将该混合土壤与溶解于橄榄油的芳香烃化合物混合均匀，密闭培养3天。将含芳香烃化合物的土壤与生理盐水混合，离心分离，去除大颗粒物质后保留上层均匀浑浊的液体；将浑浊的液体再进行离心分离，收集离心所得的沉淀；将该沉淀在以萘为唯一碳源的基础盐固体琼脂平板培养基上划线接种，培养温度为27～29℃，培养2～7天，直至出现明显单个菌落；将筛选获得的单菌落，在以萘为唯一碳源的基础盐培养基上连续传6代，使之成为菌落形态稳定的纯培养。
本发明所用基础盐培养基配方为：单位为克/升
A液：
Na2HPO4·12H2O 9.0
KH2PO4 1.5
NH4Cl 2.0
B液：
MgSO4·7H2O 0.2
MnSO4·H2O 3.0毫克
ZnSO4·7H2O 0.2毫克
CoCl2·6H2O 15.3毫克
分别配制A、B液，按A液与B液的体积比为1∶0.8-1.2混合，调节pH至6.8-7.2，搅拌均匀，静置，使其无沉淀产生；将基础盐液体培养基121℃灭菌15分钟后冷却。
基础盐固体琼脂平板培养基配方：在上述培养基A、B液混合均匀，静置，无沉淀后，加入2.0～2.5wt％琼脂粉，搅拌均匀，121℃灭菌15分钟。趁热倒入培养皿平板，冷却后保藏在萘蒸气环境中。
本发明的碳源由萘组成，用丙酮溶解，丙酮与萘的质量比为5∶1-1.8。
本发明的芳香烃化合物选自萘、芴或蒽。
该菌株可用一般发酵工业中的通用发酵罐进行培养。
本发明的细菌，一个工艺流程。从常规分离、筛选方法不超过20天，且很容易将萘代谢菌与具有忍受高浓度萘的自养菌分离。
本发明采用的生产方法为：静置培养出的单菌落→种子液→种子罐→生产罐→产品分装(或用吸附剂吸附后再包装)。
一种芳香烃化合物的降解细菌的生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将菌种接种在基础盐简单培养基中，培养基配方为：单位：g/L
Na2HPO4·12H2O 9.0
KH2PO4 1.5
NH4Cl 2.0
MgSO4·7H2O 0.2
柠檬酸铁铵 5.0mg
MnSO4·H2O 3.0mg
ZnSO4·7H2O 0.2mg
CoSO4 10.0mg
三乙醇胺 10.0mg
加蒸馏水至1000.0ml，静置过夜，灭菌后倒制固体琼脂平板，含琼脂2.0-2.5wt％，冷却备用。
将菌种固体琼脂平板划线接种，碳源为萘蒸气，28℃培养48小时，至出现典型的单菌落培养物。
2)将上述培养菌种接入基础种子瓶，培养至对数生长期；
培养基配方为：单位：g/L
Na2HPO4·12H2O 9.0
KH2PO4 1.5
NH4Cl 2.0
MgSO4·7H2O 0.2
柠檬酸铁铵 5.0mg
MnSO4·H2O 3.0mg
ZnSO4·7H2O 0.2mg
CoSO4 10.0mg
三乙醇胺 10.0mg
用时加入10ml/L碳源，其中丙酮与萘的质量比为5∶1-1.8；
3)将种子液接入种子罐培养，种子罐培养基为：单位：g/L
蛋白胨 10.0
酵母浸膏 5.0
NaCl 5.0
葡萄糖 2.0
加蒸馏水充分溶解，搅拌均匀，121℃灭菌30min后冷却备用；用时加入10ml/L碳源，其中丙酮与萘的质量比为5∶1-1.8，作为限制因子。
4)将种子液接入生产罐培养，生产罐培养基为：单位：g/L
蛋白胨 10.0
酵母浸膏 5.0
NaCl 5.0
葡萄糖 2.0
加蒸馏水充分溶解，搅拌均匀，121℃灭菌30min后冷却。
5)培养液可直接分装成产品也可用吸附剂吸附后再进行分装。
降解微生物菌株的定性检测方法为：用pH6.8～7.2的磷酸盐缓冲溶液将培养收获的菌体清洗两次，并使至成为静止细胞，用此静止细胞在含有饱和萘的磷酸盐缓冲液体系中反应2小时，离心去除细胞后，将上清液用二氯甲烷等体积萃取，无水硫酸镁干燥样品后做气相色谱-质谱联用(GC/MS)检测，得到GC/MS谱。由此可知菌株对萘是否具有降解能力。
本发明的降解细菌，可使萘等芳香烃类环境污染物降解90％以上。本发明的细菌至少可用于降解废水或环境中残留的芳香化合物和稠环芳香化合物，对于保护环境，保护人们的健康具有重要的意义。它可用于被芳香烃类化合物污染的土壤及水体的环境修复，以及特殊污染物的高效、安全的集中处理，在芳香烃类化合物污染环境的修复以及特殊污染物的集中无害化处理中能长期、高效使用。适合在全国石油化工行业及因长期使用化石类燃料而出现芳香烃污染的地区使用。它使用方便，成本低，效果好。能在芳香烃类化合物过饱和的水体中生存并使其得到快速降解。
试验表明，该技术在芳香烃类化合物污染环境的修复以及特殊污染物的集中无害化处理中能长期、高效使用，与已有技术相比，本发明的菌株专一性和适应性强，便于增殖和利用开发。
具体实施方式
实施例1：
采集针叶林腐殖土与餐橱油烟混合，喷湿，密闭，28℃发酵2天。待发酵的土壤样品表面出现大量放线菌、真菌菌丝体时，用橄榄油溶解萘、芴或蒽，倾倒在土壤样品表面。密闭，28℃发酵3天。将此发酵土壤与2倍体积的生理盐水混合，在1000转/分钟条件下离心3分钟，去除大颗粒物质后保留上层均匀浑浊的液体。将此均匀浑浊的液体在6000转/分钟的离心速度下离心15分钟，收集离心所得的沉淀。将该沉淀在以萘为唯一碳源的基础盐培养基上划线接种，27～29℃培养2天，即出现明显单个菌落。将筛选获得的单菌落，分别在以萘为唯一碳源的基础盐培养基上连续传6代，每代培养48小时，使之成为菌落形态稳定的纯培养。将菌种接种在基础盐简单培养基中，培养基配方为：单位：g/L
Na2HPO4·12H2O 9.0
KH2PO4 1.5
NH4Cl 2.0
MgSO4·7H2O 0.2
柠檬酸铁铵 5.0mg
MnSO4·H2O 3.0mg
ZnSO4·7H2O 0.2mg
CoSO4 10.0mg
三乙醇胺 10.0mg
加蒸馏水至1000.0ml，静置过夜，灭菌后倒制固体琼脂平板，含琼脂2wt％，冷却备用。
将菌种固体琼脂平板划线接种，碳源为萘蒸气，28℃培养48小时，至出现典型的单菌落培养物。
2)将上述培养菌种接入基础种子瓶，培养至对数生长期；
培养基配方为：单位：g/L
Na2HPO4·12H2O 9.0
KH2PO4 1.5
NH4Cl 2.0
MgSO4·7H2O 0.2
柠檬酸铁铵 5.0mg
MnSO4·H2O 3.0mg
ZnSO4·7H2O 0.2mg
CoSO4 10.0mg
三乙醇胺 10.0mg
用时加入10ml/L碳源，其中丙酮与萘的质量比为5∶1-1.8；
鉴定所获得的菌株，每克活菌能在36小时内降解1克萘，具有较强的萘降解能力。这个菌株的主要特征为：G+，个体形态为弯杆状，大小为0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，具有比较明显的溶琼脂性，产浅黄绿色-褐色色素。最适生长温度为26-28℃，最适生长pH为6.8-7.2，兼性自养，兼厌气性。
实施例2：
将琼脂斜面上的菌种接种在固体琼脂平板上，碳源为萘蒸气，28℃培养48小时，培养至出现典型的单菌落培养物。配制4000.0ml种子瓶培养基，分装至20只500ml的锥形瓶中，121℃灭菌30min后冷却备用。用时加入40ml/L丙酮∶萘＝5∶6(w/w)，挑取固体琼脂平板上的单个菌落，接入基础种子瓶，恒温水浴摇床培养，培养温度控制在26-28℃，搅拌速度为180转/分，密闭培养24小时。24小时后更换全部基础种子瓶的无菌空气。再继续培养24小时后6000转/分，离心15分钟收获菌体。将离心获得的菌体接入种子罐。种子罐为0.5吨，投料量为0.4吨，培养基成分为：蛋白胨4kg，酵母浸膏2kg，NaCl 2kg，葡萄糖0.8kg。加蒸馏水充分溶解，搅拌均匀，121℃灭菌30min后冷却备用。用时加入4L丙酮/萘溶液，其中含萘1.6kg。种子罐须先用蒸汽灭菌并冷却至26-28℃搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8，培养至对数生长期后，将种子液接入生产罐，生产罐为5吨，投料量4吨，培养基成分为：蛋白胨40kg，酵母浸膏20kg，NaCl 20kg，葡萄糖8kg。生产罐预先用蒸汽灭菌。
Claims (8)
1、一种芳香烃化合物的降解细菌，其特征在于，该细菌为帕氏氢噬胞菌，分类命名Hydrogenophaga palleronii LHJ38，保藏在CCTCC，保藏编号No：M203053。
2、如权利要求1所述的降解细菌，其特征在于，帕氏氢噬胞菌为：G+，个体形态为弯杆状，大小为0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，产浅黄绿色-褐色色素，不代谢乳糖；最适宜生长温度为26-28℃，最适宜生长pH为6.8-7.2，兼性自养，兼厌气性。
3、如权利要求1所述的降解细菌分离纯化方法，其特征在于取餐橱油烟的污染土壤与来自针叶林的腐殖土混合；将该混合土壤与溶解于橄榄油的芳香烃化合物混合均匀，密闭培养3天。将含芳香烃化合物的土壤与生理盐水混合，离心分离，去除大颗粒物质后保留上层均匀浑浊的液体；将浑浊的液体再进行离心分离，收集离心所得的沉淀；将该沉淀在以萘为唯一碳源的基础盐固体琼脂平板培养基上划线接种，培养温度为27～29℃，培养2～7天，直至出现明显单个菌落；将筛选获得的单菌落，在以萘为唯一碳源的基础盐培养基上连续传6代，使之成为菌落形态稳定的纯培养。
4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，基础盐培养基配方为：单位为克/升
A液：
Na2HPO4·12H2O 9.0
KH2PO4 1.5
NH4Cl 2.0
B液：
MgSO4·7H2O 0.2
MnSO4·H2O 3.0毫克
ZnSO4·7H2O 0.2毫克
CoCl2·6H2O 15.3毫克
按A液与B液的体积比为1∶0.8-1.2混合，调节pH至6.8-7.2，搅拌均匀，静置，使其无沉淀产生；将基础盐液体培养基121℃灭菌15分钟。
5、如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，基础盐固体琼脂平板培养基配方：培养基A、B液混合均匀，静置，无沉淀后，加入2.0～2.5wt％琼脂粉，搅拌均匀，121℃灭菌。
6、如权利要求3所述的方法，其特征在于，碳源由萘组成，用丙酮溶解，丙酮与萘的质量比为5∶1-1.8。
7、如权利要求3所述的方法，其特征在于，芳香烃化合物选自萘、芴或蒽。
8、实现权利要求1所述的降解细菌的生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将菌种接种在基础盐简单培养基中，培养基配方为：单位：g/L
Na2HPO4·12H2O 9.0
KH2PO4 1.5
NH4Cl 2.0
MgSO4·7H2O 0.2
柠檬酸铁铵 5.0mg
MnSO4·H2O 3.0mg
ZnSO4·7H2O 0.2mg
CoSO4 10.0mg
三乙醇胺 10.0mg
加蒸馏水至1000.0ml，静置过夜，灭菌后倒制固体琼脂平板，含琼脂2.0-2.5wt％；
将菌种固体琼脂平板划线接种，碳源为萘蒸气，28℃培养48小时，至出现典型的单菌落培养物；
2)将上述培养菌种接入基础种子瓶，培养至对数生长期；
培养基配方为：单位：g/L
Na2HPO4·12H2O 9.0
KH2PO4 1.5
NH4Cl 2.0
MgSO4·7H2O 0.2
柠檬酸铁铵 5.0mg
MnSO4·H2O 3.0mg
ZnSO4·7H2O 0.2mg
CoSO4 10.0mg
三乙醇胺 10.0mg
用时加入10ml/L碳源，其中丙酮与萘的质量比为5∶1-1.8；
3)将种子液接入种子罐培养，种子罐培养基为：单位：g/L
蛋白胨 10.0
酵母浸膏 5.0
NaCl 5.0
葡萄糖 2.0
加蒸馏水充分溶解，搅拌均匀，121℃灭菌30min；用时加入10ml/L碳源，其中丙酮与萘的质量比为5∶1-1.8，作为限制因子；
4)将种子液接入生产罐培养，生产罐培养基为：单位：g/L
蛋白胨 10.0
酵母浸膏 5.0
NaCl 5.0
葡萄糖 2.0
加蒸馏水充分溶解，搅拌均匀，121℃灭菌30min；
5)培养液直接分装成产品或用吸附剂吸附后再进行分装。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410082353 CN1800350A (zh) | 2004-12-31 | 2004-12-31 | 芳香烃化合物的降解细菌及其分离纯化和生产方法 |
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| CN 200410082353 CN1800350A (zh) | 2004-12-31 | 2004-12-31 | 芳香烃化合物的降解细菌及其分离纯化和生产方法 |
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| CN1800350A true CN1800350A (zh) | 2006-07-12 |
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| CN 200410082353 Pending CN1800350A (zh) | 2004-12-31 | 2004-12-31 | 芳香烃化合物的降解细菌及其分离纯化和生产方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN1800350A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104263682A (zh) * | 2014-09-12 | 2015-01-07 | 南京农业大学 | 一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用 |
| CN113046260A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-06-29 | 兴安盟莱绅生物农业有限公司 | 一种促进大豆生长的微生物混合菌剂及其应用 |
-
2004
- 2004-12-31 CN CN 200410082353 patent/CN1800350A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104263682A (zh) * | 2014-09-12 | 2015-01-07 | 南京农业大学 | 一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用 |
| CN113046260A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-06-29 | 兴安盟莱绅生物农业有限公司 | 一种促进大豆生长的微生物混合菌剂及其应用 |
| CN113046260B (zh) * | 2021-02-04 | 2023-04-25 | 兴安盟莱绅生物农业有限公司 | 一种促进大豆生长的微生物混合菌剂及其应用 |
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