CN102652957A

CN102652957A - 表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法

Info

Publication number: CN102652957A
Application number: CN2012101405542A
Authority: CN
Inventors: 肖翔; 司春灿; 林英; 杜道林; 曹丹鸣; 王明娜
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2012-05-08
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2012-09-05

Abstract

本发明表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法,属于环境修复、污染物处理领域。针对目前植物修复或者菌根修复所面临的实际瓶颈，通过将生物表面活性剂surfactin的高产菌株枯草芽孢杆菌B.subtilisBS1和AMF相结合，充分发挥了两者的功能和特性：B.subtilisBS1作为生物表面活性剂的供体，能够增强有机污染物向根际的迁移；AMF增强植物对有机污染物的亲和与吸收效果，提高植物对有机污染物毒性胁迫的耐受性，同时增强根际微生物的代谢活性。该专利建立了新型的高效集成修复技术，提高土壤中PAHs的修复效率，缩短修复时间，具有很强的实际应用价值。

Description

表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法

技术领域

本发明涉及一种利用表面活性剂产生菌和菌根联用修复土壤中多环芳烃的技术，属于环境修复、污染物处理领域。

背景技术

随着煤、石油在工业生产、交通运输以及生活中被广泛应用，多环芳烃（PAHs）已成为世界各国共同关注的有机污染物。我国政府已经列出7种PAHs于“中国环境优先污染物黑名单”中。由于其化学结构特殊，PAHs类污染物很容易在生物体内富集，具有较高的生物毒性。但这类污染物在土壤中附着性强，难以清除和降解，因此PAHs在土壤中的积累已经越来越严重的威胁着农业生产、食品安全、以及人类的健康。

用于有机物污染的土壤修复的方法有多种，其中植物修复由于具有成本低、无二次污染和适用于大面积场地修复的优点，而被视为最有前途的方法。但是，越来越多的研究表明，土壤中有机污染物的植物修复效果取决于根际植物-微生物相互作用。丛枝菌根真菌（AMF）是专性营养微生物，可以和地球上90%以上的植物形成共生体。它可以促进植物对营养和水分的吸收，提高寄主植物对土壤有机污染胁迫的耐受性，并对根际土壤中的微生物的组成和活动产生影响。菌根修复正在成为土壤有机污染物修复方法中一个新兴的领域。近年来的研究表明，菌根根际对有机污染土壤的植物修复具有更好的促进效果，而且发现菌根真菌能够从受污染的土壤中吸收和积累PAHs。

但是，土壤基质对PAHs具有很强的亲和作用，严重束缚了有机污染物在土壤中的迁移，从而严重限制了根际修复效果。因此，化学表面活性剂已被尝试用于促进PAHs的土壤迁移和植物修复。但是这种方法有可能引入二次污染，因而受到较广泛的争议。生物表面活性剂因具有效率高，无毒性，易降解等优点，而在有机污染土壤的修复研究领域受到了越来越多的关注。近期的研究表明，生物表面活性剂可以通过增溶和乳化作用，促进土壤中PAHs的解离，增强其向根际的迁移，从而使得污染物能更好的被生物降解。

然而，生物表面活性剂由于成本高昂、易被降解等缺点，使得其在土壤有机物的实际修复中难以被大规模应用。因此，向根际环境中引入能产生生物表面活性剂的微生物，通过其不断地合成并分泌表面活性剂，促进污染物的土壤迁移，是增强菌根修复效果的一种有效手段。向实际环境中引入表面活性剂产生菌已经得到了较为广泛的应用。

枯草芽孢杆菌菌株B. subtilis BS1是从土壤中分离出的表面活性剂产生菌，具有高效的生产环脂肽类表面活性剂surfactin的能力。表面活性剂surfactin对解离有污染物有着显著的效果。

本发明针对目前植物修复或者菌根修复所面临的实际瓶颈，通过将生物表面活性剂surfactin的高产菌株枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1和AMF相结合，充分发挥了两者的功能和特性：B. subtilis BS1作为生物表面活性剂的供体，能够增强有机污染物向根际的迁移；AMF增强植物对有机污染物的亲和与吸收效果，提高植物对有机污染物毒性胁迫的耐受性，同时增强根际微生物的代谢活性。该专利通过AMF和B. subtilis BS1联合使用，建立了新型的高效集成修复技术，提高土壤中PAHs的修复效率，缩短修复时间，具有很强的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于通过向植物根际引入生物表面活性剂高效产生菌——枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1，促进PAHs向植物根际的迁移，并利用植物共生真菌AMF提高植物对污染毒理胁迫的耐受能力，增强根际修复活力，从而构建“表面活性剂产生菌-菌根联用”的新型高效的集成修复方法，实现土壤中PAHs经济、快速、高效的清除。

本发明的技术方案如下：

表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法，按照下述步骤进行：

（1）枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1的扩增培养：

将枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1用酵母膏蛋白胨液体培养基，于30 ^oC，转速180 rpm条件下进行培养，当菌体生长到对数生长期后期时收集菌体，制备种子液。

（2）枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1菌剂制备：

将步骤（1）所得的种子液在发酵罐中扩大培养，发酵温度30 ^oC，初始pH值7.2，26~28 h即得液体菌剂；按照质量比草炭土45%，活性炭30%，锯末10%，稻壳15%配置载体，并经风干研磨，过60目筛，混合均匀制成固体载体，灭菌风干，按照液体菌剂与固体载体按质量比例1：1混合均匀即得BS1固体菌剂。

（3）AMF菌剂的制备

将菌根真菌Glomus etunicatum用10 mM柠檬酸钠以1: 10 (v: v)的体积混合溶解其中的植物凝胶，然后将提取其中的真菌孢子；将河砂过60目筛，与田园土按2：1的比例混合均匀，灭菌，盛于花盆中；在砂土混合基质上接种获得的孢子，同时种植玉米，适当浇灌霍格兰营养液，60天后将收获AMF菌剂。

（4）PAHs污染土壤的表面活性剂产生菌-菌根联用修复

在被PAHs污染的土壤中，先将步骤（3）中的AMF菌剂混入土壤中，然后种植一棵玉米；待玉米幼苗高度约30 cm时，将步骤（2）中的BS1固体菌剂接种在玉米的根际，使得根际的菌浓达到l×10⁵CFU/ 每克土壤；待玉米完成生长周期后，即可达到修复土壤多环芳烃的目的。

其中步骤（1）中所述的酵母膏蛋白胨液体培养基成分如下：胰蛋白胨 10 g/L，酵母膏提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，其余为水。

本项目通过向植物根际引入生物表面活性剂产生菌，促进疏水性有机污染物向植物根际的迁移，并利用植物共生菌AMF提高植物对污染毒理胁迫的耐受能力，增强根际修复活力，从而构建“表面活性剂产生菌-菌根联用”的新型高效的集成修复方法，实现土壤中疏水有机污染物经济、快速、高效的清除。

附图说明

图1为本发明表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法的工艺流程图。

图2为不同程度菲污染下接种BS1菌剂和AMF菌剂对根际土壤过氧化氢酶活性的影响（mean±SE, n=3）；CK 为对照组； BS为BS1处理组； GE 为AMF处理组； BS+GE 为BS1和AMF联合处理组。

图3为不同程度菲污染下接种BS1菌剂和AMF菌剂对根际土壤多酚氧化酶活性的影响（mean±SE, n=3）；CK 为对照组； BS为BS1处理组； GE 为AMF处理组； BS+GE 为BS1和AMF联合处理组。

图4为不同程度菲污染下接种BS1菌剂和AMF菌剂对根际土壤中菲含量的影响（mean±SE, n=3）。CK 为对照组； BS为BS1处理组； GE 为AMF处理组； BS+GE 为BS1和AMF联合处理组。

具体实施方式

本发明枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1购置于镇江维赛生物科技发展有限公司。

菌根真菌Glomus etunicatum 购于比利时菌根真菌体外菌种保藏中心（Glomeromycota In vitro Collection，GINCO）。

由于多环芳烃根据不同苯环数目，可有分为很多种类。以下以菲的降解作为具体实施例，其过程如图1所示：

菲分子结构式

步骤一、枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1的扩增培养和菌剂制备

将枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1用酵母膏蛋白胨液体培养基（胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L），于30 ^oC，转速180 rpm条件下进行培养。当菌体生长到对数生长期后期时收集菌体，制备种子液。将种子液在发酵罐中扩大培养即得液体菌剂。草炭土45g，活性炭30 g，锯末10 g，稻壳15 g。以上载体均风干研磨，过60目筛，混合均匀制成固体载体，灭菌风干。取液体菌剂1 L与固体载体1 kg混合均匀，即得约2 kg的BS1固体菌剂。

步骤二、菌根真菌Glomus etunicatum无菌体系扩增和菌剂制备

将购于比利时菌根真菌体外菌种保藏中心（Glomeromycota In vitro Collection，GINCO）的菌根真菌Glomus etunicatum无菌体系30 ml，用300 ml 10 mM柠檬酸钠溶解其中的植物凝胶，然后将提取其中的真菌孢子。将河砂与田园土分别过60目筛，取2 kg河砂与1 kg田园土混合均匀，灭菌，盛于花盆中。在砂土混合基质上接种获得的孢子，同时种植玉米作为共生植物，适当浇灌霍格兰营养液，60天后将收获AMF菌剂。

步骤三、模拟菲污染土壤

在江苏大学校内取地表土（5-20 cm），风干过2 mm筛；取河砂自来水冲洗杂质后过2 mm筛。取1 kg地表土和1 kg 河砂混合均匀。将菲的丙酮溶液掺入土壤中并混合均匀，使土壤中的菲浓度为0, 50, 250 mg kg^-1，待丙酮挥发完全后将土砂混合物装入花盆。

步骤四、种植玉米并接种枯草芽孢杆菌BS1菌剂和AMF菌剂

在不同菲污染程度的土壤中加入10gAMF菌剂，再种植一株玉米。待玉米苗长至30 cm左右时，向玉米苗根结接种枯草芽孢杆菌BS1菌剂，使得根际的菌浓达到l×10⁵CFU/ 每克土壤。接种方式分4种处理：（1）对照组，接种灭菌后的枯草芽孢杆菌BS1菌剂和灭菌后的AMF菌剂；（2）BS1处理组，接种枯草芽孢杆菌BS1菌剂和灭菌后的AMF菌剂；（3）AMF处理组，接种AMF菌剂和灭菌后的枯草芽孢杆菌BS1菌剂；（4）BS1和AMF联合处理组，同时接种枯草芽孢杆菌BS1菌剂和AMF菌剂。

步骤五、测定玉米根际土的磷酸酶活性和过氧化氢酶活性

在种植玉米90天后，测定不同程度菲污染下玉米根际土壤过氧化氢酶和多酚氧化酶活性。过氧化氢酶是植物体内防御体系的关键酶之一，它可以防御过氧化物对植物机体的毒害。AMF处理组、BS1和AMF联合处理组玉米根际土壤具有较高的过氧化氢酶活性，可见AMF菌剂对有机污染物修复具有明显的促进作用。（见图2）。

多酚氧化酶是植物体内对植物抗病性和酚类有毒物质降解有重要作用的酶，BS1和AMF联用处理组具有较高的多酚氧化酶活性，说明BS1菌剂和AMF菌剂对菲污染的修复具有明显的促进作用。（见图3.）

步骤六、测定玉米根际土壤中菲含量

在种植玉米并接种BS1菌剂和AMF菌剂修复90天后，用HPLC法测定玉米根际土壤中菲的含量。在不同菲污染程度下，BS1菌剂处理组玉米根际土壤中具有最高的菲含量，说明BS1菌剂可以提高菲的流动性，促进菲向植物根系的迁移。BS1和AMF联合修复处理组的玉米根际土壤都比其他处理组具有更低的菲含量，说明构建的“表面活性剂产生菌-菌根联用”的新型高效的集成修复方法，能够实现土壤中PAHs经济、快速、高效的清除（见图4）。

Claims

1.表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1的扩增培养：

将枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1用酵母膏蛋白胨液体培养基，于30 ^oC，转速180 rpm条件下进行培养，当菌体生长到对数生长期后期时收集菌体，制备种子液；

（2）枯草芽孢杆菌B. subtilis BS1菌剂制备：

将步骤（1）所得的种子液在发酵罐中扩大培养，发酵温度30 ^oC，初始pH值7.2，26~28 h，即得液体菌剂；按照质量比草炭土45%，活性炭30%，锯末10%，稻壳15%配置载体，并经风干研磨，过60目筛，混合均匀制成固体载体，灭菌风干，按照液体菌剂与固体载体按质量比例1：1混合均匀即得BS1固体菌剂；

（3）AMF菌剂的制备：

将菌根真菌Glomus etunicatum用10 mM柠檬酸钠以1: 10的体积比混合溶解其中的植物凝胶，然后将提取其中的真菌孢子；将河砂过60目筛，与田园土按2：1的比例混合均匀，灭菌，盛于花盆中；在砂土混合基质上接种获得的孢子，同时种植玉米，适当浇灌霍格兰营养液，60天后将收获AMF菌剂；

（4）PAHs污染土壤的表面活性剂产生菌-菌根联用修复：

2.根据权利要求1所述的表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法，其特征在于其中步骤（1）中所述的酵母膏蛋白胨液体培养基成分如下：胰蛋白胨 10 g/L，酵母膏提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，其余为水。