CN110283772A - 一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，包括：以待修复石油烃污染土壤或地下水的土著微生物作为菌源；将菌源接种到含有石油烃的培养液中进行菌群诱导驯化，构建原场地污染条件下的功能菌群；将功能菌群接种到含有石油烃的发酵罐中进行混合发酵；收集发酵液中的菌体，并制备菌粉，得到用于修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群。本发明的功能菌群对石油烃污染土壤及地下水具有广泛适用性，功能菌群的构建基于原污染环境土著微生物，菌群组成随污染环境动态变化，对于无法人工分离培养的污染物降解菌种能够有效富集培养，对所修复的目标环境适应性和针对性强，投加后可快速起效且稳定持久，无需长期持续投加。
Description
技术领域
本发明涉及生化环保技术领域，具体涉及一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法。
背景技术
随着原油开采、石油炼化行业的迅速发展，各类工业含石油烃废弃物的产生也相应增多，含油废水、落地原油排入环境，对土壤及地下水造成严重污染，石油烃污染土壤及地下水的修复工作刻不容缓。
目前，石油烃污染土壤及地下水的修复方法主要有热脱附、化学氧化、淋洗和生化处理等，传统的物理、化学方法处理成本较高，易产生二次污染，对某些中间产物降解不彻底；相比之下，生物修复技术具有操作简单、绿色、安全、费用较低、长效性较好等优点，是最符合自然规律的一类技术，在石油烃污染土壤及地下水修复领域具有良好的发展前景。
生物强化是土壤及地下水生物修复领域中的一类重要技术，通过向土壤和地下水中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种，以去除某一种或某一类有害物质。目前为止，国内外研究热点在于寻找或构建高效降解菌种，通过单一菌种或其相互间的复配制备生物菌剂，用于环境修复。国内外已有较为成熟的生物菌剂产品投入市场，但类似产品均为外源菌种，且菌种组成较为单一，对特定的土壤及地下水环境适应性和针对性较差，在待修复场地中难以成为优势菌种，需长期持续投加，加之高效菌种的分离、构建难度大，研发周期长，因此菌剂产品大多价格昂贵，运行成本高昂，并且外源菌种的投加还有可能因与土著菌种生态位重叠而造成生物安全性问题。同时，市售石油烃降解菌剂以降解直链烷烃的菌种居多，对石油烃中的芳香烃降解能力有限。另外，依靠目前生物技术仅能分离自然界1％左右的菌种，多数菌种无法分离，因此生态环境中土著微生物对污染物降解的巨大潜力尚未充分发掘。
从已有的研究成果来看，以待修复污染土壤及地下水土著微生物为菌种来源，制备具有针对性的石油烃降解功能菌群，用于原石油烃污染场地环境修复的技术方法和工程实例尚不多见。
发明内容
针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法。
本发明公开了一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，包括：
菌源采样：以待修复石油烃污染土壤或地下水的土著微生物作为菌源；
功能菌群构建：将所述菌源接种到含有石油烃的培养液中进行菌群诱导驯化，构建原场地污染条件下的功能菌群；
混合发酵：将所述功能菌群接种到含有石油烃的发酵罐中进行混合发酵；
发酵后处理：收集发酵液中的菌体，并制备菌粉，得到用于修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群。
作为本发明的进一步改进，所述功能菌群构建，包括：
配制培养液：所述培养液的配方为：基础无机盐培养基、待修复石油烃污染土壤的渗滤液或待修复石油烃污染地下水、无机载体、表面活性剂、自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀；
接种：在所述培养液中添加原油、诱导底物并混合均匀，将所述菌源接入培养容器中；
菌群诱导驯化：对接种后的培养液进行曝气培养，得到含诱导驯化完成的培养液；
菌群构建：将诱导驯化完成的培养液静置，弃去培养液的部分上层清液，并补充预设量的新鲜培养液至培养容器中，继续培养，直至功能菌群构建完成。
作为本发明的进一步改进，
在所述配制培养液过程中：所述培养液的配方为：0.1-1.2％w/v基础无机盐培养基、10-60％v/v待修复石油烃污染土壤的渗滤液或待修复石油烃污染地下水、0.2-2％w/v无机载体、0.02-0.2％w/v表面活性剂、余量为自来水；所述培养液体积为预计总培养体积的30-50％；
在所述接种过程中：在所述培养液中添加原油、诱导底物并混合均匀，使培养液中石油烃C6-C40浓度达到100-200mg/L、诱导底物浓度达到50-100mg/L，调节pH至6-8，将所述菌源接入培养容器中，使接种后的菌源浓度以污泥干质量计为3-12g/L；
在所述菌群诱导驯化过程中：对接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：2-4mg/L，温度：15-37℃，每24h检测培养液石油烃含量；石油烃去除率达到90％以上后，补充原油、诱导底物，使培养液中石油烃浓度达到200-400mg/L，诱导底物浓度达到100-200mg/L；继续培养至石油烃去除率达到90％以上后，补充原油、诱导底物，使培养液中石油烃浓度达到400-800mg/L，诱导底物浓度达到200-400mg/L；继续培养至石油烃去除率达到90％以上后，即得到含诱导驯化完成的培养液；
在所述菌群构建过程中：将诱导驯化完成的培养液静置，弃去培养液体积10-50％的上层清液，并按所述培养液的配方配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃浓度达到800-1600mg/L，继续培养；此后石油烃去除率每达到90％以上，将培养液静置，弃去培养液体积10-50％的上层清液，按所述培养液的配方配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃浓度达到800-1600mg/L，继续培养；连续培养5-10个周期，功能菌群构建完成。
作为本发明的进一步改进，
按重量份计，所述基础无机盐培养基包括：氮源6-14份、磷源3-7份、CaCl20.6-1.4份、NaCl1.5-2.5份、MgSO40.6-1.4份、MnSO40.02-0.18份、FeSO40.02-0.18份；其中，所述氮源包括尿素、硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵中的一种或几种的组合；所述磷源包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三聚磷酸钠、三聚磷酸钾中的一种或几种的组合；
所述无机载体包括沸石粉、硅藻土、活性炭、碳酸钙中的一种或几种的组合；
所述表面活性剂包括鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂中的一种或几种的组合；
所述诱导底物为甲苯和邻苯二酚，二者为任意比例的组合。
作为本发明的进一步改进，所述混合发酵，包括：
发酵条件准备：对发酵罐进行空消灭菌，加入速效碳源、酵母浸粉、表面活性剂和基础无机盐培养基，进行实消灭菌后添加原油；
接种发酵：将构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，开始发酵；
培养基流加：发酵液DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基；
发酵终点控制：若发酵过程中连续2次测样菌液OD值下降或达到发酵时长，则发酵结束。
作为本发明的进一步改进，
在所述发酵条件准备过程中：所述空消灭菌的温度120℃、时长25min；加入0.1-0.5％w/v速效碳源、0.02-0.2％w/v酵母浸粉、0.02-0.2％w/v表面活性剂和0.1-0.5％w/v基础无机盐培养基；所述实消灭菌的温度120℃、时长25min；温度降至30℃时，添加原油，使初始石油烃含量为200-600mg/L，通气15min；
在所述接种发酵过程中：所述功能菌群的接种量为2-8％，发酵温度25-35℃，罐内压力0.05Mpa，通气量40-80m3/h；
在所述培养基流加过程中：速效碳源的流加速率为100-400mg/(L.h)，硝酸铵的流加速率为10-20mg/(L.h)，原油的流加速率为10-40mg/(L.h)；
在所述发酵终点控制过程中：发酵时长控制在48h之内，36h后每2h取样测定菌液OD值，如发现连续2次测样OD值下降，立即放罐，否则在48h时放罐。
作为本发明的进一步改进，
按重量份计，所述基础无机盐培养基包括：氮源6-14份、磷源3-7份、CaCl20.6-1.4份、NaCl1.5-2.5份、MgSO40.6-1.4份、MnSO40.02-0.18份、FeSO40.02-0.18份；其中，所述氮源包括尿素、硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵中的一种或几种的组合；所述磷源包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三聚磷酸钠、三聚磷酸钾中的一种或几种的组合；
所述表面活性剂包括鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂中的一种或几种的组合；
所述速效碳源包括葡萄糖、海藻糖、乙酸钠、丁二酸钠、甲醇、糖蜜中的一种或几种的组合。
作为本发明的进一步改进，所述发酵后处理，包括：
菌体收集：将发酵液注入搅拌罐中，加入硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
固体菌粉制备：在收集的菌体中添加固体保藏载体和D-海藻糖，充分混合均匀，自然风干或低温烘干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
作为本发明的进一步改进，
在所述菌体收集过程中：所述硅藻土的加入量为15-25g/L；
在所述固体菌粉制备过程中：所述固体保藏载体的添加量与菌体湿重等量，所述D-海藻糖的添加量为菌体湿重的0.2-0.8％w/w，所述自然风干或低温烘干在40℃以下。
作为本发明的进一步改进，
所述固体保藏载体包括硅藻土、沸石粉、陶土粉中的一种或几种的组合。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的功能菌群，有效菌种含量达到50亿/克以上，可直接应用于石油烃污染土壤及地下水修复，对水中石油烃(C6-C40)的耐受浓度达到1500mg/L以上，对土壤中的石油烃(C6-C40)的耐受浓度达到20000mg/kg以上，投加应用后最高降解速率达到100mg/(L.d)或200mg/(kg.d)以上，适应性、有效性良好；
本发明利用待修复场地土著微生物构建功能菌群，有效菌种浓度高，适应性强，投加后可快速起效且稳定持久，无需长期持续投加，运行成本低廉；
本发明功能菌群的构建过程始终处于待修复场地环境条件下，使功能菌群对待修复场地保持良好的适应性，最终定向制备相对稳定的对原污染环境具有良好适应性的高效功能菌群，使其分别适应其所对应的应用环境，工程应用效果显著；
本发明的培养方式对于传统生物技术无法分离培养的功能菌种，也可随功能菌群的构建过程和混合发酵过程优势生长，从而最大程度发挥土著微生物的处理能力；
本发明充分运用微生物固定化技术、驯化技术、发酵技术、生物强化技术，各工艺步骤设计合理，操作简单，对于不同石油烃污染场地的土壤及地下水具有普遍适用性，不需对功能菌群的特定菌种组成进行限定，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为本发明一种实施例公开的修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法的工艺流程图；
图2为本发明实施例1公开的场地污染土壤在处理前的有机物组成图；
图3为本发明实施例1公开的采用制备的功能菌群修复土壤后土壤有机物组成图；
图4为本发明实施例公开的投加菌群的实验组(菌剂组)地下水处理过程中石油烃(C8-C32)物质降解曲线图；
图5为本发明实施例公开的各组别对该场地地下水中石油烃(C10-C40)污染物的降解曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，包括：以待修复石油烃污染土壤或地下水的土著微生物作为菌源；将菌源接种到含有石油烃的培养液中进行菌群诱导驯化，构建原场地污染条件下的功能菌群；将功能菌群接种到含有石油烃的发酵罐中进行混合发酵；收集发酵液中的菌体，并制备菌粉，得到用于修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群。本发明的功能菌群对石油烃污染土壤及地下水具有广泛适用性，功能菌群的构建基于原污染环境土著微生物，菌群组成随污染环境动态变化，对于无法人工分离培养的污染物降解菌种能够有效富集培养，对所修复的目标环境适应性和针对性强，投加后可快速起效且稳定持久，无需长期持续投加；本发明工艺合理，成本低廉，易于推广实施，具有良好的环境效益、经济效益和社会效益。
具体的：
本发明提供一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，包括：
S1、菌源采样：
以待修复石油烃污染土壤或地下水的土著微生物作为菌源；
S2、功能菌群构建：
配制培养液：培养液的配方为：基础无机盐培养基、待修复石油烃污染土壤的渗滤液或待修复石油烃污染地下水、无机载体、表面活性剂、自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀；
接种：在培养液中添加原油、诱导底物并混合均匀，将菌源接入培养容器中；
菌群诱导驯化：对接种后的培养液进行曝气培养，得到含诱导驯化完成的培养液；
菌群构建：将诱导驯化完成的培养液静置，弃去培养液的部分上层清液，并补充预设量的新鲜培养液至培养容器中，继续培养，直至功能菌群构建完成；
S3、混合发酵：
发酵条件准备：对发酵罐进行空消灭菌，加入速效碳源、酵母浸粉、表面活性剂和基础无机盐培养基，进行实消灭菌后添加原油；
接种发酵：将构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，开始发酵；
培养基流加：发酵液DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基；
发酵终点控制：若发酵过程中连续2次测样菌液OD值下降或达到发酵时长，则发酵结束；
S4、发酵后处理：
菌体收集：将发酵液注入搅拌罐中，加入硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
固体菌粉制备：在收集的菌体中添加固体保藏载体和D-海藻糖，充分混合均匀，自然风干或低温烘干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：
如图1所示，本发明提供一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，包括：
S1、菌源采样：
以待修复石油烃污染土壤或地下水的土著微生物作为菌源；
其中，本发明之所以选择待修复污染场地的石油烃污染土壤作为菌源采样点，主要原因在于该土壤中含有大量土著微生物，种类丰富，且对于石油烃已具备一定的耐受和降解能力，易于强化培养，功能菌群制备完毕后再投加回原污染场地，菌群适应能力强，可快速起效并形成优势菌种，无需长期持续投加，且不会因生态位重叠造成不良影响。
S2、功能菌群构建：
S21、配制培养液：培养液配方为：0.1-1.2％w/v基础无机盐培养基、10-60％v/v待修复石油烃污染土壤的渗滤液或待修复石油烃污染地下水、0.2-2％w/v无机载体、0.02-0.2％w/v表面活性剂、余量为自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀，培养液体积为预计总培养体积的30-50％；
S22、接种：在上述培养液中添加原油、诱导底物并混合均匀，使培养液石油烃(C6-C40)浓度达到100-200mg/L，诱导底物浓度达到50-100mg/L，调节pH至6-8，将上述S1中采集的土著微生物菌源接入培养容器中，使接种后土著微生物菌源浓度以污泥干质量计为3-12g/L；
S23、菌群诱导驯化：对上述接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：2-4mg/L，温度：15-37℃，每24h检测培养液石油烃(C6-C40)含量；石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上后，补充原油、诱导底物，使培养液中石油烃(C6-C40)浓度达到200-400mg/L，诱导底物浓度达到100-200mg/L；继续培养至石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上后，补充原油、诱导底物，使培养液中石油烃(C6-C40)浓度达到400-800mg/L，诱导底物浓度达到200-400mg/L；继续培养至石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上后，即得到含诱导驯化完成的培养液；
S24、菌群构建：将S23得到的诱导驯化完成的培养液静置，弃去培养液体积10-50％的上层清液，并按S21的配方配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃(C6-C40)浓度达到800-1600mg/L，继续培养；此后石油烃(C6-C40)去除率每达到90％以上，将培养液静置，弃去培养液体积10-50％的上层清液，按S21的配方配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃(C6-C40)浓度达到800-1600mg/L，继续培养；连续培养5-10个周期，功能菌群构建完成。
进一步，本发明基础无机盐培养基成分组成及相对比例如下：氮源6-14份、磷源3-7份、CaCl20.6-1.4份、NaCl1.5-2.5份、MgSO40.6-1.4份、MnSO40.02-0.18份、FeSO40.02-0.18份。其中氮源包括尿素、硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵中的一种或几种的组合，磷源包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三聚磷酸钠、三聚磷酸钾中的一种或几种的组合。采用这种组成的基础无机盐培养基可以解决菌群构建过程中使用的污染地下水成分单一的问题，为土著菌群的强化培养提供必要的营养物质，加快功能菌群的构建。
进一步，本发明无机载体为沸石粉、硅藻土、活性炭、碳酸钙等常用无机载体中的一种或几种的组合。无机载体的添加可为微生物附着生长提供场所，从而提高菌群浓度。
进一步，本发明表面活性剂包括鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂中的一种或几种的组合。表面活性剂的添加可增加原油和诱导底物在水中的溶解度，提高微生物降解效率，加快菌群驯化培养进度。
进一步，本发明诱导底物为甲苯和邻苯二酚，二者为任意比例的组合。诱导底物甲苯的添加主要作用在于诱导菌群产生降解苯系物的酶，诱导底物邻苯二酚的添加主要原因在于邻苯二酚是苯系物降解过程中重要的中间产物，能够进一步诱导菌群产生降解苯系物的酶。添加诱导底物的主要目的在于解决石油烃中芳香烃化合物难降解的问题，通过底物诱导，促进芳香烃降解微生物的生长，提高菌群降解石油烃中的苯系物的能力。
在构建功能菌群时待修复污染场地的石油烃污染地下水的投加为关键步骤，通常情况下待修复场地的污染物组成较为复杂，如果功能菌群的构建脱离原场地环境，则菌群的适应性和有效性难以保证，待修复污染场地的石油烃污染地下水的投加可使功能菌群的构建过程始终处于待修复场地环境条件下，使功能菌群对待修复场地保持良好的适应性，有助于定向制备对特定污染场地具有针对性的石油烃污染物降解功能菌群，使其分别适应其所对应的应用环境。
进一步，本发明在S23的菌群诱导驯化中，采用了石油烃和诱导底物含量梯度增加的方式进行，目的在于逐步将培养环境转变为高污染物环境，淘汰无法适应高污染物环境的杂菌，使能够耐受并降解高含量石油烃类物质的菌种逐步适应并成为优势菌群，提高适应能力和处理能力。
进一步，本发明在S24的菌群构建过程中，有弃去培养液体积10-50％的上层清液并补加新鲜培养液的步骤，该步骤的原因在于经过长时间的培养，培养液中可能积累了大量对微生物生长有抑制作用的代谢产物，需要将其排出培养液，同时，补充新的氮源、磷源、无机盐等营养物质，为菌群的富集培养提供足够的营养物质，加快菌群构建进程。
对于某一特定污染场地而言，菌群构建的过程其菌种组成随培养时间保持优胜劣汰的动态平衡状态，最终形成相对稳定的对该场地污染土壤及地下水具有良好适应性的高效功能菌群，上述方法的优势还在于，对于传统生物技术无法分离培养的功能菌种，也可随菌群的培养过程优势生长，从而最大程度发挥土著微生物的处理能力，降低菌种培养的成本；
在通过上述方法获得了适合于对应污染场地的功能菌群后，即可利用该功能菌群进行大规模的混合发酵生产。
S3、混合发酵：
S31、发酵条件准备：对发酵罐进行灭菌，空消灭菌温度120℃，时长25min，之后加入0.1-0.5％w/v速效碳源，0.02-0.2％w/v酵母浸粉、0.02-0.2％w/v表面活性剂和0.1-0.5％w/v基础无机盐培养基，实消灭菌，温度120℃，时长25min；温度降至30℃时，添加原油，使初始石油烃(C6-C40)含量为200-600mg/L，通气15min；
S32、接种发酵：将上述S2构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，接种量2-8％，开始发酵，温度25-35℃，罐内压力0.05Mpa，通气量40-80m3/h；
S33、培养基流加：发酵液DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基，速效碳源流加速率为100-400mg/(L.h)，硝酸铵流加速率为10-20mg/(L.h)，原油流加速率为10-40mg/(L.h)；
S34、发酵终点控制：发酵时长控制在48h之内，36h后每2h取样测定菌液OD值，如发现连续2次测样OD值下降，立即放罐，否则在48h时放罐。
进一步，本发明的速效碳源包括葡萄糖、海藻糖、乙酸钠、丁二酸钠、甲醇、糖蜜中的一种或几种的组合。混合发酵阶段的目的是将上述构建完成的功能菌群进行规模化生产，由于石油烃本身水溶性较差且具有一定毒性，不利于微生物快速利用和生长繁殖，因此添加上述速效碳源，使功能菌群快速扩繁，同时添加一定浓度的原油，保证功能菌群对石油烃的降解能力，同时抑制杂菌生长；
进一步，本发明在S33中选择培养基流加在发酵液DO值降至最低点开始上升后开始，此时初始培养基的营养物质已大量消耗，以速效碳源和原油作为碳源、硝酸铵作为氮源进行流加，保证混合发酵所需营养；
进一步，本发明在S33的发酵终点控制中，将发酵时长控制在48h之内，原因在于此时菌群浓度已达到最高，石油烃降解活性也达到较高水平，继续培养则进入内源呼吸阶段，菌体浓度不再生长，同时代谢产物的积累开始抑制菌种生长和活性，对功能菌群的构建产生负面作用。对菌液OD值的测定目的也是在于检测菌体浓度，如发现连续2次测样OD值下降，则发酵培养提前进入内源呼吸阶段，达到发酵重点，应立即放罐进行后处理。
S4、发酵后处理：
S41、菌体收集：将发酵液注入搅拌罐中，加入15-25g/L硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
S42、固体菌粉制备：在收集的菌体中添加与菌体湿重等量的固体保藏载体，同时添加菌体湿重0.2-0.8％w/w的D-海藻糖，充分混合均匀，40℃以下自然风干或低温烘干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
进一步，本发明的固体保藏载体包括硅藻土、沸石粉、陶土粉中的一种或几种的组合。固体保藏载体能够高效吸附发酵液中的菌体，从而制备高菌种含量的固体功能菌群；所选择的固体保藏载体具有一定的污染物去除功能，功能菌群制备完成后，随菌群一起投加至待修复场地，一方面可吸附污染物，供其表面附着生长的功能菌群降解，另一方面，还可吸附重金属、氨氮等特定污染物，达到处理目的。
进一步，本发明在S42的固体菌粉制备中，D-海藻糖的作用是菌种保护剂，可在干燥过程中降低菌种损失。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明。
实施例1：某石油烃(C6-C40)污染场地土壤及地下水功能菌群制备及应用
某污染场地土壤及地下水的特征污染物为石油烃(C6-C40)，土壤中最高浓度为24300mg/kg，地下水中最高浓度为1500mg/L，存在NAPL相，采用本发明工艺制备功能菌群用于场地修复，具体实施情况如下：
S1、菌源采样：
在该污染场地采集石油烃污染土壤，作为功能菌群构建的土著微生物菌源；
S2、功能菌群构建：
配置培养液，配方为：0.8％w/v基础无机盐培养基、10％v/v该场地石油烃污染地下水、2％w/v硅藻土、0.02％鼠李糖脂、余量为自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀，培养液体积为预计总培养体积的30％；
采用的基础无机盐培养基成分组成及相对比例为：(NH4)2SO410份、K2HPO41.5份、KH2PO41.5份、CaCl21.4份、NaCl2份、MgSO41.4份、MnSO40.18份、FeSO40.02份。
在上述培养液中添加原油、诱导底物甲苯、邻苯二酚并混合均匀，使培养液石油烃(C6-C40)浓度达到200mg/L，甲苯浓度20mg/L，邻苯二酚浓度30mg/L，调节pH至6，将采集的土著微生物菌源接入培养容器中，使接种后土著微生物菌源浓度以污泥干质量计为8g/L；
对接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：4mg/L，温度：25、℃，每24h检测培养液石油烃(C6-C40)含量；石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上后，补充原油、甲苯、邻苯二酚，使培养液中石油烃(C6-C40)浓度达到400mg/L，甲苯浓度40mg/L，邻苯二酚浓度60mg/L；继续培养至石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上后，补充原油、甲苯、邻苯二酚，使培养液中石油烃(C6-C40)浓度达到800mg/L，甲苯浓度80mg/L，邻苯二酚浓度120mg/L；继续培养至石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上；
将诱导驯化完成的培养液静置，弃去培养液体积30％的上层清液，配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃(C6-C40)浓度达到1600mg/L，继续培养；此后石油烃(C6-C40)去除率每达到90％以上，将培养液静置，弃去培养液体积30％的上层清液，并配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃(C6-C40)浓度达到1600mg/L，继续培养；共连续培养5个周期，功能菌群构建完成；
S3、混合发酵：
对发酵罐进行灭菌，空消灭菌温度120℃，时长25min，之后加入0.1％w/v速效碳源乙酸钠，0.2％w/v酵母浸粉，0.02％w/v鼠李糖脂和0.3％w/v基础无机盐培养基，实消灭菌，温度120℃，时长25min；温度降至30℃时，添加原油，使初始石油烃(C6-C40)含量为600mg/L，通气15min；
将上述构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，接种量2％，开始发酵，温度30℃，罐内压力0.05Mpa，通气量60m3/h；
发酵过程中检测发酵液DO值，DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基，速效碳源乙酸钠流加速率为100mg/(L.h)，硝酸铵流加速率为20mg/(L.h)，原油流加速率为10mg/(L.h)；
发酵36h后每2h取样测定菌液OD值，连续2次测样OD值下降后立即放罐，在40h时放罐；
S4、发酵后处理：
将发酵液注入搅拌罐中，加入20g/L硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
在收集的菌体中添加与菌体湿重等量的硅藻土，同时添加菌体湿重0.8％w/w的菌体保护剂D-海藻糖，充分混合均匀，40℃以下低温烘干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
经检测，制备的功能菌群有效菌种含量达到80亿/克，功能菌群制备完成后直接应用于该场地石油烃污染土壤及地下水修复，投加应用后在地下水修复过程中最高降解速率达到150mg/(L.d)，在土壤修复过程中最高降解速率达到280mg/(kg.d)。
经气-质联用检测，该场地污染土壤在处理前的有机物组成如图2所示；
采用制备的功能菌群修复土壤后，土壤有机物组成如图3所示。
由检测数据可知，采用制备的功能菌群对该场地污染土壤修复完成后，原本存在的石油烃(C6-C40)污染物几乎全部去除，功能菌群降解性能优良。
实施例2：某石油烃(C10-C40)污染场地土壤及地下水功能菌群制备及应用
某污染场地土壤及地下水的特征污染物为石油烃(C10-C40)，土壤中最高浓度为12260mg/kg，地下水中最高浓度为180mg/L，采用本发明工艺制备功能菌群用于场地修复，具体实施情况如下：
S1、菌源采样：
在该污染场地采集石油烃污染土壤，作为功能菌群构建的土著微生物菌源；
S2、功能菌群构建：
配置培养液，配方为：1.2％w/v基础无机盐培养基、60％v/v该场地石油烃污染地下水、0.2％w/v沸石粉、0.1％槐糖脂、余量为自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀，培养液体积为预计总培养体积的40％；
采用的基础无机盐培养基成分组成及相对比例为：NH4NO314份、三聚磷酸钠5份、CaCl21份、NaCl1.5份、MgSO41份、MnSO40.02份、FeSO40.18份。
在上述培养液中添加原油、诱导底物甲苯、邻苯二酚并混合均匀，使培养液石油烃(C6-C40)浓度达到100mg/L，甲苯浓度40mg/L，邻苯二酚浓度40mg/L，调节pH至8，将采集的土著微生物菌源接入培养容器中，使接种后土著微生物菌源浓度以污泥干质量计为12g/L；
对接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：2mg/L，温度：37℃，每24h检测培养液石油烃(C6-C40)含量；石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上后，补充原油、甲苯、邻苯二酚，使培养液中石油烃(C6-C40)浓度达到200mg/L，甲苯浓度80mg/L，邻苯二酚浓度80mg/L；继续培养至石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上后，补充原油、甲苯、邻苯二酚，使培养液中石油烃(C6-C40)浓度达到400mg/L，甲苯浓度160mg/L，邻苯二酚浓度160mg/L；继续培养至石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上；
将诱导驯化完成的培养液静置，弃去培养液体积10％的上层清液，配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃(C6-C40)浓度达到800mg/L，继续培养；此后石油烃(C6-C40)去除率每达到90％以上，将培养液静置，弃去培养液体积10％的上层清液，并配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃(C6-C40)浓度达到800mg/L，继续培养；共连续培养8个周期，功能菌群构建完成；
S3、混合发酵：
对发酵罐进行灭菌，空消灭菌温度120℃，时长25min，之后加入0.5％w/v速效碳源糖蜜，0.02％w/v酵母浸粉，0.1％w/v槐糖脂和0.5％w/v基础无机盐培养基，实消灭菌，温度120℃，时长25min；温度降至30℃时，添加原油，使初始石油烃(C6-C40)含量为200mg/L，通气15min；
将上述构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，接种量5％，开始发酵，温度35℃，罐内压力0.05Mpa，通气量40m3/h；
发酵过程中检测发酵液DO值，DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基，速效碳源糖蜜流加速率为400mg/(L.h)，硝酸铵流加速率为10mg/(L.h)，原油流加速率为40mg/(L.h)；
发酵36h后每2h取样测定菌液OD值，连续2次测样OD值下降后立即放罐，在46h时放罐；
S4、发酵后处理：
将发酵液注入搅拌罐中，加入25g/L硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
在收集的菌体中添加与菌体湿重等量的沸石粉，同时添加菌体湿重0.5％w/w的菌体保护剂D-海藻糖，充分混合均匀，40℃以下自然风干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
经检测，制备的功能菌群有效菌种含量达到65亿/克，功能菌群制备完成后直接应用于该场地石油烃污染土壤及地下水修复，投加应用6个月后检测，对地下水中石油烃(C10-C40)污染物去除率达到99％，对土壤中石油烃(C10-C40)污染物去除率达到98％，土壤和地下水均修复达标。
实施例3：某石油烃(C8-C32)污染场地土壤及地下水功能菌群制备及应用
某污染场地土壤及地下水的特征污染物为石油烃(C8-C32)，土壤中最高浓度为18000mg/kg，地下水中最高浓度为1600mg/L，存在NAPL相，采用本发明工艺制备功能菌群用于场地修复，具体实施情况如下：
S1、菌源采样：
在该污染场地采集石油烃污染土壤，作为功能菌群构建的土著微生物菌源；
S2、功能菌群构建：
配置培养液，配方为：0.1％w/v基础无机盐培养基、40％v/v该场地石油烃污染地下水、1％w/v碳酸钙、0.2％海藻糖脂、余量为自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀，培养液体积为预计总培养体积的50％；
采用的基础无机盐培养基成分组成及相对比例为：尿素7份、(NH4)2SO4 7份、(NH4)2HPO47份、CaCl20.6份、NaCl2.5份、MgSO40.6、份、MnSO40.1份、FeSO40.1份。
在上述培养液中添加原油、诱导底物甲苯、邻苯二酚并混合均匀，使培养液石油烃(C6-C40)浓度达到150mg/L，甲苯浓度60mg/L，邻苯二酚浓度40mg/L，调节pH至7，将采集的土著微生物菌源接入培养容器中，使接种后土著微生物菌源浓度以污泥干质量计为3g/L；
对接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：3mg/L，温度：15℃，每24h检测培养液石油烃(C6-C40)含量；石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上后，补充原油、甲苯、邻苯二酚，使培养液中石油烃(C6-C40)浓度达到300mg/L，甲苯浓度120mg/L，邻苯二酚浓度80mg/L；继续培养至石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上后，补充原油、甲苯、邻苯二酚，使培养液中石油烃(C6-C40)浓度达到600mg/L，甲苯浓度240mg/L，邻苯二酚浓度160mg/L；继续培养至石油烃(C6-C40)去除率达到90％以上；
将诱导驯化完成的培养液静置，弃去培养液体积50％的上层清液，配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃(C6-C40)浓度达到1200mg/L，继续培养；此后石油烃(C6-C40)去除率每达到90％以上，将培养液静置，弃去培养液体积50％的上层清液，并配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃(C6-C40)浓度达到1200mg/L，继续培养；共连续培养10个周期，功能菌群构建完成；
S3、混合发酵：
对发酵罐进行灭菌，空消灭菌温度120℃，时长25min，之后加入0.3％w/v速效碳源丁二酸钠，0.1％w/v酵母浸粉，0.2％w/v海藻糖脂和0.1％w/v基础无机盐培养基，实消灭菌，温度120℃，时长25min；温度降至30℃时，添加原油，使初始石油烃(C6-C40)含量为400mg/L，通气15min；
将上述构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，接种量8％，开始发酵，温度25℃，罐内压力0.05Mpa，通气量80m3/h；
发酵过程中检测发酵液DO值，DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基，速效碳源丁二酸钠流加速率为250mg/(L.h)，硝酸铵流加速率为15mg/(L.h)，原油流加速率为25mg/(L.h)；
发酵36h后每2h取样测定菌液OD值，未检测到连续2次OD值下降的情况，故在发酵至48h时放罐；
S4、发酵后处理：
将发酵液注入搅拌罐中，加入15g/L硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
在收集的菌体中添加与菌体湿重等量的陶土粉，同时添加菌体湿重0.2％w/w的菌体保护剂D-海藻糖，充分混合均匀，40℃以下自然风干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
经检测，制备的功能菌群有效菌种含量达到108亿/克，功能菌群制备完成后直接应用于该场地石油烃污染土壤及地下水修复，投加应用5个月后检测，对地下水中石油烃(C8-C32)污染物去除率达到99％，对土壤中石油烃(C8-C32)污染物去除率达到97％，土壤和地下水均修复达标。
同时，与不投加功能菌群的地下水做对照，投加菌群的实验组(菌剂组)地下水处理过程中石油烃(C8-C32)物质降解曲线如图4所示，投加菌群的实验组效果显著。
对比例
以实施例2为基础，设置对比例1和对比例2，其中对比例1在混合发酵过程中不加速效碳源，对比例2在功能菌群诱导驯化过程中不添加诱导底物。经检测，所制备的功能菌群有效菌种含量如下所示：
| 编号 | 组别 | 有效菌种含量(亿/克) |
| 1# | 对比例1 | 17.3 |
| 2# | 对比例2 | 42 |
| 3# | 实施例2 | 65 |
各组别对该场地地下水中石油烃(C10-C40)污染物的降解曲线如图5所示。
由对比例1可知，混合发酵过程中不加速效碳源对功能菌群有效菌种含量具有显著不利影响；
由对比例2可知，在功能菌群诱导驯化过程中不添加诱导底物，所构建的功能菌群有效性和适应性较差，石油烃污染物降解速率较低；
与对比例相比，实施例2制备的功能菌群在有效菌种含量和石油烃污染物降解速率方面均为最佳，采用本发明所提出的技术方案的参数和范围才能够取得较好的应用效果。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于，包括：
菌源采样：以待修复石油烃污染土壤或地下水的土著微生物作为菌源；
功能菌群构建：将所述菌源接种到含有石油烃的培养液中进行菌群诱导驯化，构建原场地污染条件下的功能菌群；
混合发酵：将所述功能菌群接种到含有石油烃的发酵罐中进行混合发酵；
发酵后处理：收集发酵液中的菌体，并制备菌粉，得到用于修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述功能菌群构建，包括：
配制培养液：所述培养液的配方为：基础无机盐培养基、待修复石油烃污染土壤的渗滤液或待修复石油烃污染地下水、无机载体、表面活性剂、自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀；
接种：在所述培养液中添加原油、诱导底物并混合均匀，将所述菌源接入培养容器中；
菌群诱导驯化：对接种后的培养液进行曝气培养，得到含诱导驯化完成的培养液；
菌群构建：将诱导驯化完成的培养液静置，弃去培养液的部分上层清液，并补充预设量的新鲜培养液至培养容器中，继续培养，直至功能菌群构建完成。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
在所述配制培养液过程中：所述培养液的配方为：0.1-1.2％w/v基础无机盐培养基、10-60％v/v待修复石油烃污染土壤的渗滤液或待修复石油烃污染地下水、0.2-2％w/v无机载体、0.02-0.2％w/v表面活性剂、余量为自来水；所述培养液体积为预计总培养体积的30-50％；
在所述接种过程中：在所述培养液中添加原油、诱导底物并混合均匀，使培养液中石油烃C6-C40浓度达到100-200mg/L、诱导底物浓度达到50-100mg/L，调节pH至6-8，将所述菌源接入培养容器中，使接种后的菌源浓度以污泥干质量计为3-12g/L；
在所述菌群诱导驯化过程中：对接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：2-4mg/L，温度：15-37℃，每24h检测培养液石油烃含量；石油烃去除率达到90％以上后，补充原油、诱导底物，使培养液中石油烃浓度达到200-400mg/L，诱导底物浓度达到100-200mg/L；继续培养至石油烃去除率达到90％以上后，补充原油、诱导底物，使培养液中石油烃浓度达到400-800mg/L，诱导底物浓度达到200-400mg/L；继续培养至石油烃去除率达到90％以上后，即得到含诱导驯化完成的培养液；
在所述菌群构建过程中：将诱导驯化完成的培养液静置，弃去培养液体积10-50％的上层清液，并按所述培养液的配方配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃浓度达到800-1600mg/L，继续培养；此后石油烃去除率每达到90％以上，将培养液静置，弃去培养液体积10-50％的上层清液，按所述培养液的配方配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充原油至石油烃浓度达到800-1600mg/L，继续培养；连续培养5-10个周期，功能菌群构建完成。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，
按重量份计，所述基础无机盐培养基包括：氮源6-14份、磷源3-7份、CaCl20.6-1.4份、NaCl1.5-2.5份、MgSO40.6-1.4份、MnSO40.02-0.18份、FeSO40.02-0.18份；其中，所述氮源包括尿素、硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵中的一种或几种的组合；所述磷源包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三聚磷酸钠、三聚磷酸钾中的一种或几种的组合；
所述无机载体包括沸石粉、硅藻土、活性炭、碳酸钙中的一种或几种的组合；
所述表面活性剂包括鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂中的一种或几种的组合；
所述诱导底物为甲苯和邻苯二酚，二者为任意比例的组合。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合发酵，包括：
发酵条件准备：对发酵罐进行空消灭菌，加入速效碳源、酵母浸粉、表面活性剂和基础无机盐培养基，进行实消灭菌后添加原油；
接种发酵：将构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，开始发酵；
培养基流加：发酵液DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基；
发酵终点控制：若发酵过程中连续2次测样菌液OD值下降或达到发酵时长，则发酵结束。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
在所述发酵条件准备过程中：所述空消灭菌的温度120℃、时长25min；加入0.1-0.5％w/v速效碳源、0.02-0.2％w/v酵母浸粉、0.02-0.2％w/v表面活性剂和0.1-0.5％w/v基础无机盐培养基；所述实消灭菌的温度120℃、时长25min；温度降至30℃时，添加原油，使初始石油烃含量为200-600mg/L，通气15min；
在所述接种发酵过程中：所述功能菌群的接种量为2-8％，发酵温度25-35℃，罐内压力0.05Mpa，通气量40-80m3/h；
在所述培养基流加过程中：速效碳源的流加速率为100-400mg/(L.h)，硝酸铵的流加速率为10-20mg/(L.h)，原油的流加速率为10-40mg/(L.h)；
在所述发酵终点控制过程中：发酵时长控制在48h之内，36h后每2h取样测定菌液OD值，如发现连续2次测样OD值下降，立即放罐，否则在48h时放罐。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，
按重量份计，所述基础无机盐培养基包括：氮源6-14份、磷源3-7份、CaCl20.6-1.4份、NaCl1.5-2.5份、MgSO40.6-1.4份、MnSO40.02-0.18份、FeSO40.02-0.18份；其中，所述氮源包括尿素、硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵中的一种或几种的组合；所述磷源包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三聚磷酸钠、三聚磷酸钾中的一种或几种的组合；
所述表面活性剂包括鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂中的一种或几种的组合；
所述速效碳源包括葡萄糖、海藻糖、乙酸钠、丁二酸钠、甲醇、糖蜜中的一种或几种的组合。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵后处理，包括：
菌体收集：将发酵液注入搅拌罐中，加入硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
固体菌粉制备：在收集的菌体中添加固体保藏载体和D-海藻糖，充分混合均匀，自然风干或低温烘干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，
在所述菌体收集过程中：所述硅藻土的加入量为15-25g/L；
在所述固体菌粉制备过程中：所述固体保藏载体的添加量与菌体湿重等量，所述D-海藻糖的添加量为菌体湿重的0.2-0.8％w/w，所述自然风干或低温烘干在40℃以下。
10.如权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，
所述固体保藏载体包括硅藻土、沸石粉、陶土粉中的一种或几种的组合。
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