CN112048461A - 一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及地下水污染治理领域，尤其涉及一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其主要操作方法为采用培养器构建电化学菌液培养装置，通过电解水为微生物提供O2和H2，在所述培养器中加入无机盐培养基、共代谢基质及受卤代烃污染的沉积物，采用TCE梯度驯化的方法，进行传代培养，培养过程中的TCE浓度为76～608μmol/L，最终获得卤代烃降解菌群。该菌群主要优势菌属包括：金黄杆菌属(Chryseobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、微杆菌属(Microbacterium)。本发明的卤代烃降解菌群的获取方法提供了一种可在电化学修复系统中生存并对卤代烃具有一定降解能力的菌群的获取方法，该菌群可用于强化电化学原位微生物修复效果，具有广阔的工程化应用前景。

Description

一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取 方法
技术领域
本发明涉及地下水污染治理领域，尤其涉及一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法。
背景技术
卤代烃是一类重要的有机合成中间体，是许多有机合成的原料，广泛应用于各种工业过程中，如生产塑料、橡胶、纤维、硅树脂、粘合剂、热传导液、金属清洗剂等，其中一些被归类为已知或可疑的致癌物质。由于其广泛使用和处理方法不当，经常对土壤和地下水造成严重污染，对生态环境和人类健康危害极大。三氯乙烯(TCE)作为卤代烃的典型代表，在地下水修复中引起了极大的关注。
在这种情况下，地下水修复是完全恢复生态环境和保护人类健康所必需的。现场修复的方法主要包括物理法、化学法和生物法。物理法主要包括气提法、吸附法和萃取法等，其缺点是无法实现污染物的彻底去除而是将其转移，可行性差。化学法主要包括焚烧法、高级氧化法和零价铁还原等方法，但是其成本较高而且易产生二次污染问题。生物修复方法主要有还原脱氯、直接好氧氧化和好氧共代谢三种。相对于物理法和化学法，生物法具有环境友好、经济可行、操作简单等优点因而受到广泛的关注。
在原位修复位点，生物降解法是一种去除卤代烃的有效方法，但常常受到电子受体和电子供体的限制，难以被自然界中的微生物降解，或自然界中的微生物对其降解效率相当低。目前，适用于地下水生物修复的供氧方式有很多，主要有空气注入、纯氧及臭氧注入、释氧化合物引入及H2O2引入等。空气注入氧气补给效率低并且容易向含水层中补给惰性气体组分和空气中的杂质，纯氧及臭氧注入成本较高且安全性较差，一般较少采用。释氧化合物与水反应后产生的氢氧化物会使环境pH值升高，高pH值会对微生物的活性造成抑制，从而影响污染物的去除效果。而H2O2对于微生物存在比较大的毒性。在实际修复过程中，由于氢气很难溶于水的特性以及直接注入氢气的代价较高等因素，一般通过注入有机供电基质进行修复，但有机供电基质的注入往往会对环境造成污染。
在电化学循环井修复技术中，通过电解水同时产生O2和H2，其中的O2可能会促进卤代溶剂的生物氧化，H2可能会促进卤代溶剂的生物还原。由于同时产生O2和H2，其中发挥降解作用的微生物菌群不同于单独存在O2和H2的情况。同时，土壤中可能缺少降解卤代烃的微生物，制约了卤代烃污染地下水生物修复技术的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法。
本发明提供一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其操作步骤主要在电化学菌液培养装置中进行，所述电化学菌液培养装置包括培养器、阴极片、阳极片和搅拌单元，所述培养器为圆柱体结构，所述阴极片和所述阳极片可拆卸的安装所述培养器内，并分别与直流电源的正极和负极连接，所述搅拌单元用于对所述培养器内物质进行搅拌，所述培养器的上端设有与其内部连通的第一取料口；
卤代烃降解菌群的获取方法，其主要包括以下几个步骤：
S1、向所述培养器内依次加入灭菌后的无机盐培养基、沉积物、共代谢基质和三氯乙烯，以得到第一混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，启动搅拌单元，对所述第一混合液进行充分搅拌，培养7d后，即获得第一代驯化菌液，其中，所述第一混合液中所述无机盐培养基与所述沉积物的水土比为15～5:1，所述共代谢基质的浓度为3～8mmol/L，所述三氯乙烯的浓度为76～608μmol/L；
S2、采用三氯乙烯梯度驯化的方法，取第N-1代驯化菌液，与所述无机盐培养基、所述共代谢基质和所述三氯乙烯依次加入洁净的所述培养器内，以得到第N混合液，重复S1中的操作，对所述第N混合液进行充分搅拌，以得到第N代驯化菌液，其中，N为大于2的自然数，且第N混合液中所述无机盐培养基与所述第N-1驯化菌液的体积比为6～12:1，所述共代谢基质的浓度为3～8 mmol/L，三氯乙烯的浓度为76～608μmol/L；
S3、将S2中的所述第N代驯化菌液进行冷冻保存后，即得卤代烃降解菌群。进一步地，所述电化学菌液培养装置还包括废气收集单元，所述废气收集单元与所述培养器的内部连通，其用于收集培养器中的废气。
进一步地，所述培养器为圆柱体结构，其内部中空且上端敞口，其上端可拆卸的设有盖板，所述盖板用于关闭或打开所述培养器的上端敞口，所述盖板上设有与所述培养器内部连通的第一出气孔、第一取料孔和两个第一通孔，每个所述第一通孔内均可拆卸的安装有电极夹，且所述电极夹的夹持部朝向所述培养器内设置，其导电部穿过对应的所述第一通孔伸出所述培养器外，所述阴极片和所述阳极片分别对应夹持在两个所述电极夹的夹持部，所述废气收集单元上设有第二进气口，所述第二进气口与所述第一出气孔连通。
进一步地，所述废气收集单元包括废气收集瓶，所述废气收集瓶的上端为敞口结构，并在其上端设有与其匹配的第一密封件，所述第一密封件与所述废气收集瓶的上端可拆卸连接，并用于盖住或打开所述废气收集瓶的上端，所述第一密封件上设有与所述废气收集瓶内部连通的进气口和所述第二出气口，所述第一出气孔通过气管与所述进气口连通，所述废气收集瓶内填充有净化单元，所述净化单元用于对废气进行净化。
进一步地，所述净化单元为甲醇和水的混合物。
进一步地，所述搅拌单元包括磁力搅拌器和磁转子，所述磁力搅拌器水平设置，所述培养器竖直设置在所述磁力搅拌器的上端，所述磁转子设置在所述培养器内。
进一步地，所述阴极片和所述阳极片均选用钛涂层电极板。
进一步地，所述直流电源的输出电流为0～50mA。
进一步地，S1中所述共代谢基质为葡萄糖、铵盐或醋酸钠。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法的有益效果为：
(1)本发明将电化学这一能有效促进微生物作用降解卤代烃的技术创新性地用于微生物菌群的富集和驯化，从典型受卤代烃污染场地沉积物中富集和驯化出可适用于电化学修复系统并对卤代烃具有一定降解能力的菌群；
(2)本发明的电化学体系具有结构简单和操作方便等优点，且向微生物提供的O2和H2都是来源于电解水，不需要引入外源物质，还有能源利用率高、实施成本和环保性强等优点；
(3)本发明采用葡萄糖为共代谢基质，葡萄糖具有原料易获取、环保性强和实施成本低等优点；
(4)本发明为生物电化学修复系统提供的卤代烃降解菌群，可用于强化电化学原位微生物修复效果，具有广阔的工程化应用前景。
附图说明
图1是本发明所述电化学菌液培养装置的结构示意图；
图2是本发明另一实施例所述电化学菌液培养装置的结构示意图；
图3是本发明所述盖板的结构示意图；
图4(a)是本发明原始沉积物基于门水平的微生物群落结构组成图4(b)是本发明所述每一代驯化菌液基于门水平的微生物群落结构组成；
图5(a)是本发明原始沉积物基于属水平的微生物群落结构组成；
图5(b)是本发明所述每一代驯化菌液基于属水平的微生物群落结构组成。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
请参考图1和图3，本发明的实施例提供了一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其主要在电化学菌液培养装置中进行。
所述电化学菌液培养装置，包括培养器10、阴极片(图中未示出)、阳极片 (图中未示出)、废气收集单元40和搅拌单元，所述培养器10为圆柱体结构，其内部中空且上端敞口，其上端可拆卸的设有盖板11，所述盖板11用于关闭或打开所述培养器10的上端敞口，所述搅拌单元用于对所述培养器10内物质进行搅拌，其包括磁力搅拌器20和磁转子(图中未示出)，所述磁力搅拌器20水平设置，所述培养器10竖直设置在所述磁力搅拌器20的上端，所述磁转子设置在所述培养器10内，所述盖板11上设有与所述培养器10内部连通的第一出气孔18、第一取料孔12和两个第一通孔，每个所述第一通孔内均可拆卸的安装有电极夹30，且所述电极夹30的夹持部朝向所述培养器10内设置，其导电部穿过对应的所述第一通孔伸出所述培养器10外，所述阴极片和所述阳极片分别对应夹持在两个所述电极夹30的夹持部，并分别通过对应的所述电极夹30与直流电源的正极和负极连接，所述废气收集单元40用于收集培养器10内的废气，其包括废气收集瓶，所述废气收集瓶的上端为敞口结构，并在其上端设有与其匹配的第一密封件(图中未示出)，所述第一密封件与所述废气收集瓶的上端可拆卸连接，并用于盖住或打开所述废气收集瓶的上端，所述第一密封件上设有与所述废气收集瓶内部连通的进气口(图中未示出)和第二出气口41，所述第一出气孔18通过气管60与所述进气口连通，所述废气收集瓶内填充有净化单元(图中未示出)，所述净化单元用于对废气进行净化。
在本发明中，用于进行菌群培养的培养基、沉积物和其他物质均放置在培养器10内，接通电源，阴极片和阳极片通电后，对培养基中的液体进行电解，以产生供微生物生长的O2和H2，而在磁力搅拌器20和磁转子的作用下，可将培养器10的沉积物与培养基及其他物质进行搅拌，以使得沉积物充分混合在培养基中，并有利于对电解产生的O2和H2进行溶解，多余的O2和H2进入到废气收集瓶内进行收集，并通过净化单元将O2和H2中的氯化烃进行吸收，净化后的 O2和H2则通过第二出气口41排出。电极夹30为JJ110铂片电极夹30，所述第一通孔内均设有沿其轴向设置的内螺纹，所述电极夹30上设有与所述内螺纹匹配的外螺纹所述电极夹30与对应的第一通孔螺纹连接，螺纹连接方式具有操作方便、结构简单和实施成本低等优点，而通过将电极夹30螺纹固定在对应的第一通孔内，可防止电极夹30的位置随意移动，进而影响电解过程。阴极片和阳极片均选用钛涂层电极板，其分别夹持在两个电极夹30的夹持部，以实现对培养器10内的液体进行电解，优选的，两个所述第一通孔沿所述盖板11的径向间隔设置，两个第一通孔之间的距离满足不影响阴极片和阳极片的正常工作。在本发明中，对第一出气孔18和第一取料孔12的位置不进行限定，其与两个所述第一通孔均相互独立设置。优选的，本发明中直流电源的输出电流为0～ 50mA。如图2所示，作为本发明所述废气收集单元40的另一种实施例，其还可以为集气袋，且集气袋上仅设有所述进气口，废气进入集气袋内进行集中收集，而当废气收集单元40为集气袋时，其内可以不用设置净化单元。所述第一取料孔12用于将样品加入培养器10内或对培养器10内的沉积物进行取样，其上设有用于关闭或打开其的第三密封件14，第三密封件14与第一取料口可拆卸连接，其可以为橡胶或盖体。
在上述实施例中，所述培养器10的上端同轴设有第一法兰盘15，所述盖板 11为与所述培养器10上端匹配的圆板结构，其外周同轴设有与所述第一法兰盘 15匹配的第二法兰盘16，所述第一法兰盘15与所述第二法兰盘16通过螺栓进行可拆卸连接。
在本发明中，作为所述培养器10与所述盖板11可拆卸连接的另一种实施例，所述培养器10与所述盖板11可通过卡扣进行可拆卸连接。
在上述实施例中，所述净化单元为甲醇和水的混合物。
在本发明中，甲醇和水以任意配比即可制得所述混合物。甲醇能有效去除 O2和H2中的氯化烃，能实现对氯化烃的快速净化，防止氯化烃对环境产生污染，且甲醇和水的混合物具有净化效果好、净化速度快和净化成本低等优点。
在上述实施例中，所述第一密封件为橡胶塞。
在本发明中，橡胶塞具有密封性能好、拆装方便和实施成本低等优点。
在上述实施例中，所述培养器10的侧壁上设有与其内部连通的第二取料孔 17，并在所述第二取料孔17处可拆卸的安装有第二密封件(图中未示出)，所述第二密封件用于关闭或打开所述第二取料孔17。
在本发明中，第二取料孔17用于对培养器10内的菌液进行取样，以便于随时监控培养器10内菌液的培养状态。第二密封件可以为橡胶塞、盖体或其他能实现对第二取料孔17进行封闭的结构。
<实施例1>
一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其主要包括以下步骤：
S1、配置500ml的无机盐培养基，对所述无机盐培养基进行灭菌处理后加入所述培养器10内，再向所述培养器10内依次加入50g沉积物、0.9g共代谢基质和3.4μL三氯乙烯TCE，以得到第一混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为20mA，打开磁力搅拌器20对所述第一混合液进行充分搅拌，培养7d后，即获得第一代驯化菌液；其中，所述无机盐培养基的组成为：KH2PO4 0.53g/L、Na2HPO4·12H2O 0.43g/L、MgSO4·7H2O 0.037g/L 和NaNO3 0.85g/L，沉积物为受卤代烃污染的沉积物，共代谢基质为葡萄糖；
S2、采用TCE梯度驯化的方法进行传代培养，选取一洁净的培养器10，依次向所述培养器10内加入灭菌后的无机盐培养基450ml、S1中所述第一代驯化菌液50ml、共代谢基质0.9g和TCE 6.8μL，以得到第二混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为20mA，打开磁力搅拌器20，对所述第二混合液进行充分搅拌后，培养7d，以得到第二代驯化菌液；
再次选取一洁净的培养器10，依次向所述培养器10内加入灭菌后的无机盐培养基450ml、第二代驯化菌液50ml、共代谢基质0.9g和TCE 10.2μL，以形成第三混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为 20mA，打开磁力搅拌器20，对所述第三混合液进行充分搅拌后，培养7d，得到第三代驯化菌液，再次选取一洁净的培养器10，依次向所述培养器10内加入灭菌后的无机盐培养基450ml、第三代驯化菌液50ml、共代谢基质0.9g和13.6μL，以形成第四混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为20mA，打开磁力搅拌器20，对所述第三混合液进行充分搅拌后，培养7d，以得到第四代驯化菌液，重复上述操作，以得到第五代驯化菌液，其中，第二混合液中TCE的浓度为152μmol/L、第三混合液中TCE的浓度为228μmol/L、第四混合液中TCE的浓度为304μmol/L以及第五混合液中TCE的浓度为380 μmol/L；
S3、将S2中的所述第五代驯化菌液加入甘油中，混合后冷冻保存，即得卤代烃降解菌群。
本发明通过采用TCE梯度驯化的方法对第一代驯化菌液进行传代培养，驯化培养的过程也是对第一代驯化菌液TCE降解能力的优化过程，以得到具有TCE降解能力强的卤代烃降解菌群。
<实施例2>
S1、配置750ml的无机盐培养基，对所述无机盐培养基进行灭菌处理后加入所述培养器10内，再向所述培养器10内依次加入50g沉积物、1.44g共代谢基质和3.4μL三氯乙烯TCE，以得到第一混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为30mA，打开磁力搅拌器20对所述第一混合液进行充分搅拌，培养7d后，即获得第一代驯化菌液；其中，所述无机盐培养基的组成为：KH2PO4 0.53g/L、Na2HPO4·12H2O 0.43g/L、MgSO4·7H2O 0.037g/L 和NaNO3 0.85g/L，沉积物为受卤代烃污染的沉积物，共代谢基质为葡萄糖；
S2、采用TCE梯度驯化的方法进行传代培养，选取一洁净的培养器10，依次向所述培养器10内加入灭菌后的无机盐培养基500ml、S1中所述第一代驯化菌液50ml、共代谢基质1.44g和TCE 6.8μL，以得到第二混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为30mA，打开磁力搅拌器20，对所述第二混合液进行充分搅拌后，培养7d，以得到第二代驯化菌液；
再次选取一洁净的培养器10，依次向所述培养器10内加入灭菌后的无机盐培养基500ml、第二代驯化菌液50ml、共代谢基质1.44g和TCE 10.2μL，以形成第三混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为 20mA，打开磁力搅拌器20，对所述第三混合液进行充分搅拌后，培养7d，得到第三代驯化菌液，再次选取一洁净的培养器10，依次向所述培养器10内加入灭菌后的无机盐培养基500ml、第三代驯化菌液50ml、共代谢基质1.44g和 13.6μL，以形成第四混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为30mA，打开磁力搅拌器20，对所述第三混合液进行充分搅拌后，培养7d，以得到第四代驯化菌液，重复上述操作，以得到第五代驯化菌液，其中，第二混合液中TCE的浓度为152μmol/L、第三混合液中TCE的浓度为228 μmol/L、第四混合液中TCE的浓度为304μmol/L以及第五混合液中TCE的浓度为380μmol/L；
S3、将S2中的所述第五代驯化菌液加入甘油中，混合后冷冻保存，即得卤代烃降解菌群。
本发明通过采用TCE梯度驯化的方法对第一代驯化菌液进行传代培养，驯化培养的过程也是对第一代驯化菌液TCE降解能力的优化过程，以得到具有 TCE降解能力强的卤代烃降解菌群。
<试验例1>
本试验例用于研究在不添加共代谢基质的条件下，实施例1所制得的卤代烃降解菌群对TCE的降解能力，其主要试验方法为：向培养器10内依次加入灭菌后的无机盐培养基450ml、实施例1中得到的第五代驯化菌液50ml和 TCE3.4μL，以得到第六混合液，所述第六混合液中TCE的浓度为10mg/L，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为20mA，启动磁力搅拌器20，对所述第六混合液进行充分搅拌后，培养24h，以进行卤代烃降解菌群的TCE降解试验，实验结果表明，本试验例中卤代烃降解菌群可以对TCE进行直接好氧降解，且降解速率达到0.4-1.2mg/L·d。
<试验例2>
本试验例用于研究在共代谢基质为铵的条件下，实施例1所制得的卤代烃降解菌群对TCE的降解能力，其主要试验方法为：向培养器10内依次加入灭菌后的无机盐培养基450ml、实施例1中得到的第五代驯化菌液50ml、碳酸氢铵 5mmol/L和TCE3.4μL，以得到第七混合液，所述第七混合液中TCE的浓度为 10mg/L，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为20mA，启动磁力搅拌器20，对所述第七混合液进行充分搅拌后，培养24h后，以进行卤代烃降解菌群的TCE降解试验，实验结果表明，本试验例中卤代烃降解菌群可以对TCE进行好氧共代谢降解，且降解速率达到1.5-2.6mg/L·d。其中，铵盐可以作为生长基质，支持微生物生长，并诱导菌体产生加氧酶，降解TCE。
<试验例3>
本试验例用于研究在共代谢基质为醋酸钠的条件下，实施例1所制得的卤代烃降解菌群对TCE的降解能力，其主要试验方法为：向培养器10内依次加入灭菌后的无机盐培养基450ml、实施例1中得到的第五代驯化菌液50ml、醋酸钠5mmol/L和TCE3.4μL，以得到第八混合液，所述第八混合液中TCE的浓度为10mg/L，所述阴极片和所述阳极片接电，并设置直流电源的输出电流为 20mA，启动磁力搅拌器20，对所述第八混合液进行充分搅拌后，培养24h后，以进行卤代烃降解菌群的TCE降解试验，实验结果表明，本试验例中卤代烃降解菌群可以对TCE进行好氧共代谢降解，且降解速率达到0.8-1.9mg/L·d。其中，醋酸钠可以作为生长基质，支持微生物生长，并诱导菌体降解TCE。
微生物菌群变化分析
对实施例1获取的菌群进行宏基因组分类测序，通过NCBI数据库比对分析，表征了该菌群的群落结构变化情况。在此，需要说明的是，本发明分别对每一代驯化后的菌液以及驯化前的原始沉积物中的菌群进行宏基因组分类测序，每次测序均设置三个重复。
(1)DNA提取
原始沉积物：取原始沉积物，选用DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA。同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。
驯化后的菌液：取每一代驯化后的菌液，分别通过一个0.45μm的滤膜过滤收集菌体。将收集到的菌体连同滤膜一起放入已灭菌的10ml离心管中，保存于 -20℃的冰箱。取出滤膜，选用DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA。同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。
(2)PCR扩增
以上述提取的细菌总DNA为模板，采用下述引物进行PCR扩增。扩增体系(25μL):5×reaction buffer 5μL，5×GC buffer 5μL，dNTP(2.5mM)2μL，上游引物(10uM)1μL，下游引物(10uM)1μL，DNA模板2μL，ddH2O 8.75μL， Q5 DNA聚合酶0.25μL。扩增参数：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火 55℃30s，延伸72℃30s，最后延伸72℃5min，25-30循环。
F：5’ACTCCTACGGGAGGCAGCA3’
R：5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT3’
(3)宏基因组分类测序群落结构分析
本实验采用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序。运用QIIME软件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0， http://qiime.org/)(Caporaso et al.,2010)识别疑问序列。除了要求序列长度≥160 bp，且不允许存在模糊碱基N之外，还将剔除：1)5’端引物错配碱基数>1的序列；2)含有连续相同碱基数>8的序列。随后，通过QIIME软件(v1.8.0， http://qiime.org/)调用USEARCH(v5.2.236,http://www.drive5.com/usearch/)检查并剔除嵌合体序列。使用QIIME软件，调用UCLUST这一序列比对工具(Edgar, 2010)，对前述获得的序列按97％的序列相似度进行归并和OTU划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列。对于每个OTU的代表序列，在QIIME软件中使用默认参数，通过将OTU代表序列与对应数据库的模板序列相比对，获取每个OTU所对应的分类学信息。
结果表明，驯化过程中混合菌群的微生物群落结构变化明显。图4(a)-(b)、图5(a)-(b)显示了该菌群在驯化过程中的主要优势菌及相对含量情况。可以看出，在门水平上，驯化前期该混合菌群主要由变形菌门(Proteobacteria) 组成(如图4(a)所示，其中每一个柱状均代表一个重复，下同)，驯化到后期出现了新的优势菌门，主要由拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门 (Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)组成，其他菌门仅有少量分布(如图4(b)所示)。在属水平，微生物的种类相对复杂，驯化前期以肠杆菌属(Enterobacter)、草螺菌属(Herbaspirillum)为优势菌属(如图5(a)所示)，驯化到后期以金黄杆菌属(Chryseobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、微杆菌属(Microbacterium)为优势菌属(如图5(b)所示)。
金黄杆菌属(Chryseobacterium)为有机化学异养型，可以降解有机污染物。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是一种化学异养、严格需氧的细菌。它的独特之处在于，它拥有泛醌10作为其主要的呼吸醌，并在其细胞外膜中含有鞘糖脂 (GDLs)而不是脂多糖。这种细菌在新陈代谢方面是万能的，这意味着它可以利用各种各样的天然化合物以及某些类型的环境污染物。许多鞘氨单胞菌菌株已在污染地点被发现，其中包括有毒化合物，如多氯联苯、杂酚油、五氯酚、除草剂等。
在本文中，所涉及的前、后、上、下等方位词是以附图中零部件位于图中以及零部件相互之间的位置来定义的，只是为了表达技术方案的清楚及方便。应当理解，所述方位词的使用不应限制本申请请求保护的范围。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，其操作步骤主要在电化学菌液培养装置中进行，所述电化学菌液培养装置包括培养器(10)、阴极片、阳极片和搅拌单元，所述培养器(10)为圆柱体结构，所述阴极片和所述阳极片可拆卸的安装在所述培养器(10)内，并分别与直流电源的正极和负极连接，所述搅拌单元用于对所述培养器(10)内的物质进行搅拌，所述培养器(10)的上端设有与其内部连通的第一取料口；
卤代烃降解菌群的获取方法，其主要包括以下几个步骤：
S1、向所述培养器(10)内依次加入灭菌后的无机盐培养基、沉积物、共代谢基质和三氯乙烯，以得到第一混合液，所述阴极片和所述阳极片接电，启动搅拌单元，对所述第一混合液进行充分搅拌，培养7d后，即获得第一代驯化菌液，其中，所述第一混合液中所述无机盐培养基与所述沉积物的水土比为15～5:1，所述共代谢基质的浓度为3～8mmol/L，所述三氯乙烯的浓度为76～608μmol/L；
S2、采用三氯乙烯梯度驯化的方法，取第N-1代驯化菌液，与所述无机盐培养基、所述共代谢基质和所述三氯乙烯依次加入洁净的所述培养器(10)内，以得到第N混合液，重复S1中的操作，对所述第N混合液进行驯化培养，以得到第N代驯化菌液，其中，N为大于2的自然数，且第N混合液中所述无机盐培养基与所述第N-1驯化菌液的体积比为6～12:1，所述共代谢基质的浓度为3～8mmol/L，三氯乙烯的浓度为76～608μmol/L；
S3、将S2中的所述第N代驯化菌液进行冷冻保存后，即得卤代烃降解菌群。
2.根据权利要求1所述的一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，所述电化学菌液培养装置还包括废气收集单元(40)，所述废气收集单元(40)与所述培养器(10)的内部连通，其用于收集培养器(10)中的废气。
3.根据权利要求2所述的一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，所述培养器(10)为圆柱体结构，其内部中空且上端敞口，其上端可拆卸的设有盖板(11)，所述盖板(11)用于关闭或打开所述培养器(10)的上端敞口，所述盖板(11)上设有与所述培养器(10)内部连通的第一出气孔(18)、第一取料孔(12)和两个第一通孔，每个所述第一通孔内均可拆卸的安装有电极夹(30)，且所述电极夹(30)的夹持部朝向所述培养器(10)内设置，其导电部穿过对应的所述第一通孔伸出所述培养器(10)外，所述阴极片和所述阳极片分别对应夹持在两个所述电极夹(30)的夹持部，所述废气收集单元(40)上设有第二进气口，所述第二进气口与所述第一出气孔(18)连通。
4.根据权利要求3所述的一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，所述废气收集单元(40)包括废气收集瓶，所述废气收集瓶的上端为敞口结构，并在其上端设有与其匹配的第一密封件，所述第一密封件与所述废气收集瓶的上端可拆卸连接，并用于盖住或打开所述废气收集瓶的上端，所述第一密封件上设有与所述废气收集瓶内部连通的进气口和所述第二出气口(41)，所述第一出气孔(18)通过气管与所述进气口连通，所述废气收集瓶内填充有净化单元，所述净化单元用于对废气进行净化。
5.根据权利要求4所述的一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，所述净化单元为甲醇和水的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，所述搅拌单元包括磁力搅拌器(20)和磁转子，所述磁力搅拌器(20)水平设置，所述培养器(10)竖直设置在所述磁力搅拌器(20)的上端，所述磁转子设置在所述培养器(10)内。
7.根据权利要求1所述的一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，所述阴极片和所述阳极片均选用钛涂层电极板。
8.根据权利要求1所述的一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，所述直流电源的输出电流为0～50mA。
9.根据权利要求1所述的一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，S1中所述共代谢基质为葡萄糖、铵盐或醋酸钠。
10.根据权利要求1所述的一种适用于生物电化学修复系统的卤代烃降解菌群的获取方法，其特征在于，对S4中得到的所述卤代烃降解菌群经16S rDNA基因测序鉴定表明，该菌群主要优势菌门包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、和放线菌门(Actinobacteria)，主要优势菌属包括金黄杆菌属(Chryseobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、微杆菌属(Microbacterium)。
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