CN102533619A

CN102533619A - 一种氯代烃高效好氧降解混合菌剂的制备方法与应用

Info

Publication number: CN102533619A
Application number: CN2012100490340A
Authority: CN
Inventors: 李辉; 林匡飞; 刘勇弟; 沈婷婷; 吕树光; 陆强
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-02-29
Also published as: CN102533619B

Abstract

本发明公开一种氯代烃好氧降解混合菌剂及其制备方法与应用，包括混合降解菌剂的筛选和驯化、混合降解菌剂的制备方法和混合降解菌剂的应用。本发明设定在葡萄糖共代谢条件下，30℃、pH7、摇床转速180rpm时，混合菌剂对氯代烃的降解效果最佳，降解率达68.1%。同时研究了混合降解菌剂与植物联合对TCE的修复技术。本发明筛选出三氯乙烯的好氧混合降解菌剂，提供了一种混合菌剂的富集培养方法，并利用这些微生物与植物联合降解水或土壤中的氯代烃污染物，对有机物污染的修复具有高效、经济、无二次污染的特点；修复地下水范围宽，可去除的污染物种类多，应用广泛。

Description

一种氯代烃高效好氧降解混合菌剂的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及采用生物法治理地下水污染领域技术，更具体地讲，涉及一种氯代烃高效好氧降解混合菌剂的制备方法与应用。

背景技术

随着人类活动的加剧，地下水的污染日益严重。据我国有关部门对118个城市连续2～7年的监测统计，约有64%和33%的城市地下水遭受了重度和轻度的污染，其中有机物污染问题已经相当突出。尤其是氯代烃，在尖端工业中被大量用作清洁剂，由于人们越来越关注由这些物质或含这些物质的废水引起的地下水污染，所以有必要立即采取措施对付这种污染。

目前地下水污染治理与修复的方法主要有：物理法、化学法、生物法。物理法主要是指抽出处理法，是地下水修复的代表性技术，应用最为广泛。化学氧化法也常用于石油烃污染及氯代烃污染的地下水修复，但是成本较高。生物法包括微生物降解和植物修复，在土壤中接种高效的菌种可以显著提高降解效果；实践研究表明生物法处理石油烃污染、多环芳烃污染和氯代烃污染能达到较高的去除效率，并与上述物理、化学方法相比，生物法处理无需大量的能量，成本较低，同时，它们也能够完全降解污染物和使之脱毒而不会引起二次污染。而且即使污染物处于低浓度也可以进行降解，可以完全意义上的实现降低污染，且降低治理费用。

采用微生物净化土壤的方法包括异位修复和原位修复，其中异位修复法主要包括固相处理法及泥浆处理法，固相处理法是将微生物与磷、氮等营养源混入翻挖的土壤中促进污染物的降解；泥浆处理法是将微生物与水和营养源混入翻挖的土壤中，以流体形式处理土壤，促进污染物的降解；原位处理法，是将空气、营养源等注入污染土壤中，无需翻挖来促进土壤中存在的微生物降解污染物。

在上述生物处理法中，异位处理法由于需要翻挖土壤，应用范围受到限制，处理和设备费用相对较高。原位处理法费用低，操作便捷，但由于土壤中微生物含量较少，尤其是氯代烃降解微生物，土壤中可能并不存在。在这种情况之下，通过实验筛选培养获得能够降解氯代烃的微生物并将它们接种至土壤中，使得净化速率提高。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，从受三氯乙烯（TCE）污染场地土壤中，驯化、筛选出可耐受并对TCE具有一定降解能力的微生物菌株，然后将菌株制成菌剂。

本发明的第二个目的在于，提供一种氯代烃好氧降解混合菌剂。

本发明的第三个目的在于，提供一种氯代烃好氧降解混合菌剂在净化含氯代烃的水或土壤中的应用。

为实现第一个目的，本发明采取了以下技术方案：

一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，包括驯化、分离和鉴定，包括以下步骤：

（1）取999.0mL基础培养基、1.0mL微量元素，摇匀后作为液体无机盐培养基备用；取50mL所述液体无机盐培养基，在温度为121℃的高压锅内灭菌20分钟，在超净台中冷却，再加入2 g受TCE污染的土壤，30 ℃，转速180 r/min条件下，避光、恒温振荡，培养36 h，获得培养菌液；

（2）取步骤（1）中获得的培养菌液5 mL, 转接到装有10 mg/L TCE和0.15 g/L葡萄糖的上述新鲜液体无机盐培养基中，驯化培养直至溶液浑浊得到驯化培养基；

（3）配置分离培养基，调pH至7.0，用去离子水定容至1000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌后，在超净台中冷却至38~40℃，在超净工作台中取步骤（2）获得的驯化培养基1 mL，按10倍稀释法将菌液稀释成10^-1-10^-7梯度的菌悬液，取0.1 mL涂布于上述分离培养基上，用无菌涂布器涂布均匀，将培养皿置于30 ℃的生化培养箱中培养观察，48h后便可发现有明显菌落出现，挑选菌落，将其接种至上述分离培养基中，在温度30℃、转速180 r/min的振荡器中培养48 h得到菌液；

（4）以所得菌液作为接种物，添加到含有TCE 50 mg/L的基础培养基中，菌液和基础培养基的体积比为1:10，培养温度为30 ℃，培养时间为36~48 h，经离心得到菌液，按体积比500：1加入酵母提取物和麦麸的保护剂，然后利用真空冷冻干燥机制备成固体氯代烃好氧降解混合菌剂。

作为一个优选，在步骤（3）之后、步骤（4）之前还包括步骤（3A），所述步骤（3A）为：将步骤（2）至步骤（3）作为一个分离纯化周期，重复步骤（2）至步骤（3），但每次用前一个分离纯化周期中步骤（3）获得的菌液代替步骤（2）中初始用到的培养菌液，分离纯化6个周期以上得到菌液。

步骤（1）中所述基础培养基的组成为：Na₂HPO₄：4.26g.L^-1，KH₂PO₄ ：2.65 g.L^-1 ，NH₄Cl：0.5 g.L^-1，FeCl₂·4H₂O ：0.01 g.L^-1，CaCl₂：0.02 g.L^-1，MgSO₄·7H₂O ：0.2 g.L^-1；所述微量元素的组成为：HBO₃：0.3 g.L^-1，ZnCl₂：0.07g.L^-1，NaMoO₄·2H₂O：0.024g.L^-1，MnCl₂·4H₂O：0.006g.L^-1，NiCl₂·6H₂O：0.75 g.L^-1，CoCl₂·6H₂O：0.19 g.L^-1。

步骤（2）的驯化培养，一般以3 d作为一个驯化周期，一个驯化周期后，取5 mL驯化后的菌液转接至设定TCE浓度的新鲜液体培养液中，驯化过程中的TCE的浓度为10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L。

步骤（3）中分离培养基的配制方法为，NaCl 5g,，牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，用5 mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1000mL，121 ℃高压蒸汽灭菌后，在超净台中冷却至38—40℃获得。

为了实现第二个目的，本发明公开按照上述制备方法获得的氯代烃好氧降解混合菌剂。通过鉴定，将混合菌归类于不动杆菌属(Acinetobacter)，考察优势菌的生理生化指标，发现其革兰氏染色呈阴性、无芽孢、短杆状。

为了实现第三个目的，本发明公开氯代烃好氧降解混合菌剂在净化含氯代烃的水或土壤中的应用。

作为一个优选方案，降解条件为，TCE浓度50 mg/L，葡萄糖浓度150 mg/L。

作为一个优选方案，降解条件为，温度30 ℃、pH值7、摇床转速180 rpm。本发明在TCE浓度为50 mg/L，葡萄糖浓度为150 mg/L时，研究了不同的环境因素对混合菌降解TCE的影响，实验结果表明：在30 ℃、pH=7、摇床转速180 rpm的条件下，混合菌对TCE的降解效果最佳，降解率达68.1 %。

作为一个优选方案，在净化时，加入菌剂的同时联合植物修复。

本发明的优点在于：（1）本发明根据地下水污染具体情况构建了原位修复有机物污染地下水的修复系统，采用葡萄糖为共代谢基质，从典型受TCE污染场地土壤中筛选、驯化出可耐受并对TCE具有一定降解能力的微生物菌株；以及使用这些微生物与植物联合对水和土壤进行净化的方法；（2）本发明的体系设计相对简单，实施起来较为方便，对有机物污染的地下水具有高效、经济、无二次污染的特点；（3）本发明修复地下水范围宽，修复效果好；（4）本发明并不只局限于对地下水的治理，也可以应用于城市污水和生活污水的治理。

附图说明

图1 混合菌的显微观察图。

图2ASTT-1菌株16S rDNA序列构建的系统发育树。

图2BSTT-2菌株16S rDNA序列构建的系统发育树。

图3混合菌群生长曲线。

图4不同浓度对三氯乙烯（TCE）降解菌的影响。

图5温度对混合菌生长情况的影响。

图6温度对三氯乙烯（TCE）降解的影响。

图7不同pH值条件下三氯乙烯（TCE）的降解情况。

图8摇床转速对三氯乙烯（TCE）降解的影响。

图9不同苯酚/TCE浓度比下三氯乙烯（TCE）的降解情况。

图10不同苯酚/TCE浓度比下三氯乙烯（TCE）的降解动力学方程。

图11不同甲苯/TCE浓度比下三氯乙烯（TCE）的降解情况。

图12不同甲苯/TCE浓度比下三氯乙烯（TCE）的降解动力学方程。

图13混合菌剂与植物联合修复三氯乙烯（TCE）污染湿地，图13A为对照组，无填料，图13B为实验组，有填料。

具体实施方式

本发明型采用葡萄糖为共代谢基质，以受三氯乙烯（TCE）污染严重的土壤为菌源，驯化分离出高效降解TCE的混合菌群。通过鉴定，将混合菌归类于不动杆菌属(Acinetobacter)。并提供将上述微生物联合植物加入含氯代烃的水或土壤来净化水和土壤的方法。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1氯代烃快速混合降解菌的筛选、驯化、分离和鉴定

1、菌种的筛选，取上海市浦东某地氯代烃污染土壤样品2 g，置于装有50 mL无机盐培养基的100 mL的三角烧瓶中，在30 ℃恒温振荡器，180 rpm条件下，避光、恒温振荡36 h后，取5 mL菌液接种于装有TCE 10 mg/L和葡萄糖，0.15 g.L^-1，Na₂HPO₄4.26g.L^-1，KH₂PO₄2.65 g.L^-1 ，NH₄Cl0.5 g.L^-1，FeCl₂·4H₂O 0.01 g.L^-1 ， CaCl₂0.02g.L^-1，MgSO₄·7H₂O0.2g.L^-1，HBO₃0.3g.L^-1，ZnCl₂0.07g.L^-1，NaMoO₄·2H₂O0.024g.L^-1，MnCl₂·4H₂O0.006g.L^-1，NiCl₂·6H₂O0.75 g.L^-1，CoCl₂·6H₂O0.19 g.L^-1混合构成的种子培养液中，再培养3 d，即为TCE的好氧降解菌群。

2、取上述菌液5 ml，6000 rpm离心5 min，用灭菌的无机盐培养基洗涤2次，在接种至新鲜含有TCE 的种子培养液中，在30 ℃，180 rpm摇床里培养3 d，重新传代。驯化过程中的TCE的浓度按10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L依次增加，共驯化6次。

3、待驯化结束后，将所得的驯化菌群应用下述方法分离纯化，得到两株混合菌群，4℃冰箱保存。使用驯化最后阶段的培养液用于菌种的划线分离。取最后一个周期的驯化培养基1 mL，按10倍稀释法将菌液稀释成10^-1-10^-7梯度的菌悬液，取0.1 mL涂布于牛肉膏培养基上，用无菌涂布器涂布均匀，置于30 ℃的生化培养箱中培养。待长成独立菌落后，观察各菌落形态，用接种环挑取不同形态的菌落，在平板中划线分离。重复该步骤分离微生物。

将挑出的菌落分别接种至装有100 mg/L TCE和NaCl 5 g.L^-1,，牛肉膏5 g.L^-1，胰蛋白胨10 g.L^-1， pH 7.0构成的分离培养基中，在温度30℃、转速180 rpm的振荡器中培养48 h得到菌液。取菌液1 mL，按10倍稀释法将菌液稀释成10^-1-10^-7梯度的菌悬液，取0.1 mL涂布于牛肉膏培养基上，用无菌涂布器涂布均匀，置于30 ℃的生化培养箱中培养。待长成独立菌落后，重复该步骤6次以上，分离出混合菌。

基于其在平板上的形态单一，无法进一步分离。下面的研究均选用该混合菌。在分离培养基上，混合菌落呈圆形，直径2 mm，乳白色，边缘整齐，表面干燥，不易挑起。革兰氏染色呈阴性，杆状，无芽孢。其在平板上的形态及革兰氏染色结果如图1示。

4、对混合菌群进行鉴定并构建系统发育树，在上述培养基中挑取细菌于10 μl灭菌水中变性后离心取上清作为模板。进行PCR扩增。使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)，进行PCR扩增目的片段。PCR扩增的反应体系及条件如表1及表2所示。

表1.PCR扩增反应体系

反应体系	体积(μl)
		上述1的变性反应液	1
PCR Premix	25
		Forward primer(20 pmol/μl)	0.5
Reverse primer2(20 pmol/μl)	0.5
		16S-free H₂O	23
Total	50

表2.反应条件

然后将PCR产物进行克隆测序，使用TaKaRa DNA Ligation Kit中的连接酶，将PCR产物与pMD19-T Vector连接后，热转化至 E.coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37 ℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒并命名为STT-1、STT-2。使用pMD18 F/pMD18 R/Seq Internal 引物对STT-1、STT-2质粒测序。结果如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。不动杆菌属(Acinetobacter)STT-1和STT-2，考察优势菌的生理生化指标，发现其革兰氏染色呈阴性、无芽孢、短杆状。

将上述测序结果输入NCBI，通过blast比对，选取与该序列相关性较高的序列，运用primer软件将序列复制至记事本，用MAGE软件包以Neighbor-Joining法，对两株降解菌分别构建系统发育树。其结果如图2A和图2B所示。

实施例2 菌群生长曲线

将30 ℃在斜管中生长48 h的菌群接种于装有50 mL LB培养基的250 mL的三角瓶中，在30 ℃，180 rpm的恒温摇床上振荡培养48 h。最后将种子液经过离心、用磷酸缓冲液反复洗涤并离心3次后配成一定浓度的菌悬液备用。

将一定量的菌悬液接种于合适的培养基，在适宜的温度培养时，微生物的生长具有规律性。微生物的生长一般要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。在100 mL无机盐培养基中接种混合菌群，间隔取样，置于4 ℃冰箱保存，实验结束后，将所有样品于波长600 nm处测定吸光度值。以生长时间为横坐标，OD值为纵坐标作图，得到的曲线即为生长曲线。结果于图3中示出。

实施例3 氯代烃快速混合降解菌剂的制备方法

本实施例在驯化分离获得混合菌群的基础上，采用对数生长期的菌群，并且利用发酵罐进行了扩大化培养，以便获得高浓度菌剂。

1、将降解菌在含有TCE 50 mg/L，基础培养基混合构成的培养液中活化，并传代2次。

2、将活化后的降解菌重新接种于含有TCE 50 mg/L，基础培养基混合构成的培养液中，振荡培养至对数生长期。

3、将培养至对数生长期的菌种按照10 %的接种量接入种子罐，培养至对数生长期。

4、将培养至对数生长期的种子培养液按照10 %的接种量转入生产罐进行扩大化培养，培养温度为30 ℃，通气量70-80 L/min，培养时间为36~48 h。经离心得到菌液，菌液立即加入按质量分数每100 mL菌液加入灭菌后的0.2 g酵母提取物和麦麸的保护剂，分装后利用真空冷冻干燥机制备成固体菌剂。

实施例4 氯代烃高效好氧降解混合菌剂降解条件优化

1、降解期间初始浓度影响

在驯化培养混合菌群的过程中，通过不停地改变TCE初始浓度，来得到高效降解菌。设置TCE浓度，分别为1 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L，混合菌对TCE的降解率分别为83.7 %、74.6 %、68.1 %、34.4 %。30 ℃培养2 d后，发现TCE的初始浓度比较低时，混合菌对TCE的降解效果较好；而随着体系中TCE初始浓度的增加，混合菌对TCE的降解率逐渐降低，结果如图4所示。其原因可能是由于高浓度TCE对混合菌有一定的毒性效应，或者是由于TCE聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，而导致其不能有效释放酶分子，从而使得微生物对TCE的降解效果降低。

2、降解期间温度影响

在含100 mL无机盐的250 mL三角烧瓶中加入TCE，使其初始浓度为50 mg/L，分别设定摇床温度为20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃，接种相同的菌悬液，反应48 h后，发现当温度在30 ℃、35 ℃时，混合菌的生长情况较好。在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃时，不动杆菌属混合菌48 h时对TCE的降解率分别为57.4 %，60.0 %，68.1 %，65.8 %，结果如图5、图6所示。在30 ℃时混合菌降解TCE效率最高，当温度偏离30 ℃时，对TCE降解都产生了一定的影响。因而表明这些微生物在30 ℃下降解TCE最佳。

3、降解期间pH影响

在含100 mL无机盐的250 mL三角烧瓶中加入TCE，使其初始浓度为50 mg/L，在30 ℃下调节溶液的pH值为6.5、7、7.5、8，接种相同的菌悬液，48 h后混合菌群对TCE的降解率分别为60.2 %、67.8 %、52.4 %、46.2 %，结果如图7所示。在pH值偏酸性的条件下，混合菌对TCE的降解效果略高于偏碱性条件，在中性条件下，降解程度最为彻底。因此表明pH7为混合菌群对TCE的最佳降解pH值。

4、降解期间振荡速率影响

在含100 mL无机盐的250 mL三角烧瓶中加入TCE，使其初始浓度为50 mg/L，在30 ℃下调节溶液的pH值为7，接种相同的菌悬液，摇床的振荡速率分别为 160 rpm、180 rpm、200 rpm，结果如图8所示，研究表明三个转速下，混合菌对TCE的降解效果影响不大。表明在这三个转速下，摇瓶中氧气含量没有太大的差异。

5、苯酚为共代谢基质对混合菌群降解特性的影响

选择苯酚作为共代谢基质，模拟地下水环境，选用筛选出的混合菌作为研究对象，在温度为30 oC，pH7，摇床转速在180 rpm，TCE浓度为50 mg/L条件下，设定不同的苯酚对TCE浓度比下培养48 h后，结果表明苯酚/TCE的浓度比为1:1、5:1、25:1时，混合菌对TCE的降解率分别为45.8 %，55.0 %，40.2 %，结果如图9、图10所示。当浓度比为5:1时，TCE的降解效率最高。过高或过低的苯酚浓度都不利于TCE的降解效果。苯酚作为生长基质，支持微生物生长，并且诱导菌体产生加氧化酶，降解TCE。当苯酚浓度过低，微生物不能很好的生长，产生的加氧化酶比较少，TCE降解效果不佳；苯酚浓度高时，菌体的生长受到抑制，最终将导致TCE降解效果减弱。

6、甲苯为共代谢基质对混合菌群降解特性的影响

选择甲苯作为共代谢基质，模拟地下水环境，选用筛选出的混合菌作为研究对象，在温度度 30 ℃，PH 7，摇床转速在180 rpm，TCE浓度为50 mg/L条件下，设定不同的甲苯对TCE浓度比下培养48 h后，结果表明当甲苯/TCE的浓度比为1:1、5:1、10:1时，48 h后混合菌对TCE的降解率分别为37.3 %，47.2 %，31.5 %，结果如图11、图12所示。当浓度比为5:1时，TCE的降解效果最高。过高或过低的甲苯浓度都不利于TCE的降解效果。通过对所设定的甲苯/TCE的3个浓度比下微生物菌对TCE的降解动力学进行研究，发现TCE的好氧微生物降解符合一级动力学方程。其中，当甲苯/TCE浓度比为5:1时，混合菌对TCE的降解效率最高，反应速率常数为0.0331 h^-1，半衰期为20.93 h。

实施例5 氯代烃高效好氧降解混合菌剂与植物联合去除TCE污染的应用

模拟人工湿地，在TCE污染土壤上种植杨树，杨树的生长和根际微生物的活动以及分泌物和酶的作用，加入土壤的上述混合菌剂对TCE有良好的降解效果，杨树能够促进该混合菌剂对土壤中TCE的降解，因此通过种植杨树可降解土壤中高浓度的TCE，从而达到清除土壤中氯代烃的目的，可以避免二次污染。

模拟的人工湿地装置总长59.5 cm，总宽39.8 cm，总高50.0 cm。主要由池体、填料区（含混合菌剂）、水生植物、气室和管路组成。其土壤层高度为12.2 cm，水溶液区的高度为19.0 cm，上层气体高度为30.2 cm，保证枝叶能完全展开。将填料置于装置底部填料区，并把上述混合菌剂与填料拌匀，然后配置一定浓度TCE的水溶液注入该填料层中，待达到吸附平衡后测得TCE的初始浓度为143.5 mg/L。将意杨的根部浸入填料层中，叶片在气室中充分展开。每24 h取样，定量测得装置中TCE的剩余浓度，装置如图13A和图13B所示。

模拟人工湿地内部的填料主要取自华东理工大学校园内部的沙砾，粒径在1-4 mm和取自上海市园林科学研究所的土壤。填料层分为沙砾层、土壤层，高度比设为4:1。由于杨树有较强的根系泌氧能力强的植物，所以选择杨树作为湿地中种植的植物。另设对照湿地，其结构和运行条件相同但是湿地内部没有填料，只有含水层和气室。

当装有填料时，TCE在12 d内去除率达71.2%。5 d内杨树对TCE的修复效果比较好，去除率达到51.4 %，对比没有填料的实验组可以得到，在相同的TCE浓度下，5 d内，杨树对水溶液中TCE的去除率只为24.8 %，前6 d杨树对水溶液中TCE的去除趋势比较快，尤其是第1 d，这是由于杨树对TCE的吸附所致。当吸附达到平衡后，杨树对TCE的修复主要靠微生物降解所致。在8 d后，TCE的去除趋势趋于平缓，可能是由于装置中氧气的量不足，微生物和植物生长受到抑制，引起降解率下降。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种氯代烃高效好氧降解混合菌剂的制备方法与应用

<130> 。

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1483

<212> DNA

<213> Acinetobacter

<400> 1

tggctcagat tgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcgg agatgaggtg 60

cttgcacctt atcttagcgg cggacgggtg agtaatgctt aggagtctgc ctattagtgg 120

gggacaacat tccgaaaggg atgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga 180

tcttcggacc ttgcgctaat agatgggcct aagtcggatt agctagttgg tggggtaaag 240

gcctaccaag gcgacgatct gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca ctgggactga 300

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat ggggggaacc 360

ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttatgg ttgtaaagca ctttaagcga 420

ggaggaggct actgagacta atactcttgg atagtggacg ttactcgcag aataagcacc 480

ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg cgagcgttaa tcggatttac 540

tgggcgtaaa gcgtgcgtag gcggcttttt aagtcggatg tgaaatcccc gagcttaact 600

tgggaattgc attcgatact gggaagctag agtatgggag aggatggtag aattccaggt 660

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<211> 1482

<212> DNA

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ttcggtaact gagctagcgg cggacgggtg agtaatgctt aggaatctgc ctattagtgg 120

gggacaacat ttcgaaaggg atgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga 180

ccttcgggcc ttgcgctaat agatgagcct aagtcggatt agctagttgg tggggtaaag 240

gcctaccaag gcgacgatct gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca ctgggactga 300

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat ggggggaacc 360

ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttttgg ttgtaaagca ctttaagtgg 420

gaggaggctc tcttggttaa tacctaagaa gagttgacgt tacccacaga ataagcaccg 480

gctaactctg tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc gagcgttaat cggatttact 540

gggcgtaaag cgtgcgtagg cggcttttta agtcggatgt gaaatccccg agcttaactt 600

gggaattgca ttcgatactg ggaagctaga gtatgggaga ggatggtaga attccaggtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga ataccgatgg cgaaggcagc catctggcct 720

aatactgaca ctgaggtgcg aaagcatggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780

catgccgtaa acgatgtcta ctagccgttg agggatttga tcctttagtg gcgcagctaa 840

cgcgataagt agaccgcctg gggagtacgg tcgcaagact aaaactcaaa tgaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc 960

tggccctgac atagtagaga ctttccagag atggattggt gccttcggga atctacatac 1020

aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tttccttact tgccagcatt tcggatggga actttaagga tactgccagt 1140

gacaaactgg aggaaggcgg ggacgacgtc aagtcatcat ggcccttacg gccagggcta 1200

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aaaagctgat cgtagtccgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagt cggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagaatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccatg ggagtttgtt gcaccagaag taggtagtct aaccgcaagg aggacgctta 1440

ccacggtgtg gccgatgact ggggtgaagt cgtaacaagg ta 1482

Claims

1.一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，包括驯化、分离和鉴定，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤（3）之后、步骤（4）之前还包括步骤（3A），所述步骤（3A）为：将步骤（2）至步骤（3）作为一个分离纯化周期，重复步骤（2）至步骤（3），但每次用前一个分离纯化周期中步骤（3）获得的菌液代替步骤（2）中初始用到的培养菌液，分离纯化6个周期以上得到菌液。

3.根据权利要求1所述的一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述基础培养基的组成为：Na₂HPO₄：4.26g.L^-1，KH₂PO₄ ：2.65 g.L^-1 ，NH₄Cl：0.5 g.L^-1，FeCl₂·4H₂O ：0.01 g.L^-1，CaCl₂：0.02 g.L^-1，MgSO₄·7H₂O ：0.2 g.L^-1；所述微量元素的组成为：HBO₃：0.3 g.L^-1，ZnCl₂：0.07g.L^-1，NaMoO₄·2H₂O：0.024g.L^-1，MnCl₂·4H₂O：0.006g.L^-1，NiCl₂·6H₂O：0.75 g.L^-1，CoCl₂·6H₂O：0.19 g.L^-1。

4.根据权利要求1所述的一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的驯化培养，一般以3 d作为一个驯化周期，一个驯化周期后，取5 mL驯化后的菌液转接至设定TCE浓度的新鲜液体培养液中，驯化过程中的TCE的浓度为10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中分离培养基的配制方法为，NaCl 5g,，牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，用5 mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1000mL，121 ℃高压蒸汽灭菌后，在超净台中冷却至38—40℃获得。

6.利用权利要求1—5任一所述的氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法获得的氯代烃好氧降解混合菌剂。

7.权利要求6所述的氯代烃好氧降解混合菌剂在净化含氯代烃的水或土壤中的应用。

8.根据权利要求7所述的氯代烃好氧降解混合菌剂在净化含氯代烃的水或土壤中的应用，其特征在于，降解条件为，TCE浓度50 mg/L，葡萄糖浓度150 mg/L。

9.根据权利要求8所述的氯代烃好氧降解混合菌剂在净化含氯代烃的水或土壤中的应用，其特征在于，降解条件为，温度30 ℃、pH值7、摇床转速180 rpm。

10.根据权利要求7所述的氯代烃好氧降解混合菌剂在净化含氯代烃的水或土壤中的应用，其特征在于，在净化时，加入菌剂的同时联合植物修复。