CN105647838B

CN105647838B - 皮特不动杆菌及其用途

Info

Publication number: CN105647838B
Application number: CN201610202208.0A
Authority: CN
Inventors: 左剑恶; 李晓霞
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2036-03-31
Also published as: CN105647838A

Abstract

本发明公开了皮特不动杆菌及其用途，其中，该皮特不动杆菌于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.11670，保藏名称为皮特不动杆菌Acinetobacter pittii SYJ1‑3。本发明的皮特不动杆菌能够以石油为碳源生长和增殖，利用自身代谢降解石油，可以有效用于石油废水、石油污染土壤等的治理，不仅石油降解效率高，且操作简单、方便，成本较低。

Description

皮特不动杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及皮特不动杆菌及其用途，更具体，涉及皮特不动杆菌及其在降解石油中的用途，以及降解石油的方法。

背景技术

随着经济发展对能源需求的不断增加，目前我国大多数油田开采已经进入了二/三次采油期，开采难度的增加，导致通过注水或者改变注入水的特征来提高采油率已然成为大多数油田主要的开采方式。每年需大量的与地下储层配性好的清水注入目的层，同时又随采出液从目的层中开采出大量的含油废水，我国陆上大部分油田采出液的综合含水率达80％以上，注入水和含油污水的处理及排放问题越来越引起人们的关注。

由于采油方式、原油性质、地质条件等条件的差异，油田采出水的水质有所不同，但基本都含有原油、悬浮固体、盐类、微生物等成分。利用微生物可以使油中的一部分物质作为营养物质被吸收、转化合成微生物体内的有机成分或者繁殖成新的微生物，剩下的部分被生物氧化分解成简单的有机或无机物，达到废水净化的目的。微生物修复技术在石油污染土壤治理的过程中起到重要作用，利用微生物进行含油废水的处理方法也受到广泛关注，和其它生化处理方法相比，其优点是运行成本低、环境友好、不会对环境造成二次污染等。

但现有的石油废水生物处理技术普遍存在微生物降解油能力差、菌群适应性不佳、需频繁接种等问题，导致运行成本高、连续运行困难、处理后的残油含量很难达到回注水质标准，使得生物处理技术很难实现大规模工业化推广应用。

因而，目前石油废水生物处理相关技术仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种利用自身代谢能够高效率降解石油的皮特不动杆菌及其用途。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种皮特不动杆菌，其于2015年11月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.11670，保藏名称为皮特不动杆菌Acinetobacter pittii SYJ 1-3。根据本发明的实施例，本发明的皮特不动杆菌能够利用石油作为唯一的碳源进行生长和繁殖，从而有效利用自身代谢降解石油，显著降解所在环境中的石油烃含量，不仅降解效率较高，且能够耐受较高的盐度和石油烃浓度，环境适应性较强。另外，发明人发现，将该皮特不动杆菌菌株加入到处理石油废水的生物处理工艺中，能够明显提高该工艺对石油的去除效率，经过一段时间的连续运行，有较好的环境适应性，并在工艺微生物中所占的比重趋于稳定。

在本发明的第二方面，本发明提供了前面所述的皮特不动杆菌在降解石油中的用途。根据本发明的实施例，将上述皮特不动杆菌与石油接触，或者说以石油作为碳源对上述皮特不动杆菌进行培养，可以利用皮特不动杆菌自身代谢降解石油，进而，该皮特不动杆菌可以有效用于石油废水、石油污染土壤等的治理，且石油降解效率较高，能够达到60％至90％。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种降解石油的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将含有前面所述的皮特不动杆菌和石油的混合物置于适合所述皮特不动杆菌生长或繁殖的条件下进行培养。发明人发现，只要使得皮特不动杆菌与石油接触，在适宜该皮特不动杆菌生长或繁殖的环境条件下，该皮特不动杆菌可以以石油作为碳源进行生长和繁殖，利用自身代谢降解石油，且石油降解效率能够达到60％至90％，降解效果显著优于现有石油生物处理相关技术。

根据本发明的实施例，所述培养的温度为28～30摄氏度。

根据本发明的实施例，在所述培养过程中，对所述含有皮特不动杆菌和石油的混合物进行搅拌处理。

根据本发明的实施例，所述搅拌处理的转速为150～200rpm。

根据本发明的实施例，所述石油以含有石油的液体混合物形式提供。

根据本发明的实施例，所述含有石油的液体混合物为石油和无机盐培养基的混合物。

根据本发明的实施例，该降解石油的方法包括：将一环所述皮特不动杆菌菌落接种于LB培养基中，并于28～30摄氏度、150～200rpm搅拌条件下进行培养，得到皮特不动杆菌种子培养液；然后将所述皮特不动杆菌种子培养液接种于含有石油的无机盐培养基中，并于28～30摄氏度、150～200rpm搅拌条件下进行培养。

根据本发明的实施例，所述无机盐培养基含有：NH₄NO₃ 2g/L、Na₂HPO₄·12H₂O3.8g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、NaCl 1g/L、MgSO₄ 0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，无水CaCl₂0.05g/L，pH 7.0～7.2。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得更加容易理解：

图1显示了根据本发明实施例1的分离获得的皮特不动杆菌Acinetobacterpittii SYJ1-3的扫描电子显微镜照片。

图2显示了根据本发明实施例3的SBR工艺中不同时间点进水和出水中的石油浓度和不同时间点的石油降解效率结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在本发明的第二方面，本发明提供了前面所述的皮特不动杆菌在降解石油中的用途。根据本发明的实施例，将上述皮特不动杆菌与石油接触，或者说以石油作为碳源对上述皮特不动杆菌进行培养，可以利用皮特不动杆菌自身代谢降解石油，进而，该皮特不动杆菌可以有效用于石油废水、石油污染土壤等的治理，且石油降解效率较高，能够达到60％至90％。值得一提的是，该皮特不动杆菌可以以石油作为唯一碳源进行生长和繁殖。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种降解石油的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将含有前面所述的皮特不动杆菌和石油混合物置于适合所述皮特不动杆菌生长或繁殖的条件下进行培养。发明人发现，只要使得皮特不动杆菌与石油接触，在适宜该皮特不动杆菌生长和繁殖的环境条件下，该皮特不动杆菌可以以石油作为碳源生长和繁殖，利用自身代谢降解石油，且石油降解效率能够达到60％至90％，降解效果显著优于现有石油生物处理相关技术。

根据本发明的实施例，培养含有皮特不动杆菌和石油的混合物的具体条件不受特别限制，只要适于皮特不动杆菌的生长和增殖即可。在本发明的一些实施例中，可以于28～30摄氏度培养含有皮特不动杆菌和石油的混合物。由此，有利于皮特不动杆菌的生长和增殖，进而有利于提高石油的降解效率。在本发明的另一些实施例中，在上述培养过程中，可以对含有皮特不动杆菌和石油的混合物进行搅拌处理。搅拌的转速不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况灵活选择，例如包括但不限于为150～200rpm。由此，有利于提高石油的降解效率。

根据本发明的实施例，石油的具体提供形式不受特别限制。在本发明的一些实施例中，石油可以以含有石油的液体混合物形式提供。由于该皮特不动杆菌可以以石油作为唯一碳源进行生长和繁殖，含有石油的液体混合物中可以不包含其他可以作为碳源的物质，例如仅包括一些无机盐类。在本发明的一些实施例中，该含有石油的液体混合物可以为石油和无机盐培养基的混合物。由此，皮特不动杆菌可以快速高效地生长和繁殖，进而能够有效降解石油。

根据本发明的实施例，上述无机盐培养基的具体组成不受特别限制，只要能够提供皮特不动杆菌生长所需的无机盐物质即可。在本发明的一个具体示例中，无机盐培养基含有：NH₄NO₃ 2g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 3.8g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、NaCl 1g/L、MgSO₄ 0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，无水CaCl₂ 0.05g/L，pH 7.0～7.2。

根据本发明的具体示例，该降解石油的方法可以包括以下步骤：将一环上述皮特不动杆菌菌落接种于LB培养基中，并于28～30摄氏度、150～200rpm搅拌条件下进行培养，得到皮特不动杆菌种子培养液；然后将上述得到的皮特不动杆菌种子培养液接种于含有石油的无机盐培养基中，并于28～30摄氏度、150～200rpm搅拌条件下进行培养。由此，皮特不动杆菌生长和繁殖状况较好，并能够有效通过自身代谢降解石油，石油降解效率较高，可达60％至90％，且该方法不需要频繁接种，运行成本较低且操作简单，可以实现连续运行。

下面详细描述本发明的实施例。

实施例1：具有石油降解能力的皮特不动杆菌Acinetobacter pittii SYJ1-3的筛选

筛选步骤：将从长庆油田现场10个长期被石油污染的土壤地表下方5～10cm处分别获取500g土壤样品，混合均匀后，取10g混合后的土壤样品加入到盛有100mL LB培养基的250mL摇瓶中进行微生物富集，具体为于28～30℃，180rpm条件下摇床培养5d，得到富集液，吸取1mL上述得到的富集液并转接至新鲜LB培养基中，继续进行上述微生物富集，培养5d后再吸取1mL得到的富集液并转接至以石油为唯一碳源的无机盐培养基(配方为：NH₄NO₃(2g/L)、Na₂HPO₄·12H₂O(3.8g/L)、KH₂PO₄(1.5g/L)、NaCl(1g/L)、MgSO₄(0.2g/L)、FeSO₄·7H₂O0.05g/L，无水CaCl₂ 0.05g/L，原油(5g/L)、pH 7.0～7.2，并于121℃灭菌20min)中进行嗜油菌的选择和驯化，具体为于28～30℃，180rpm条件下摇床培养5d。重复上述嗜油菌的选择和驯化操作3次，然后用接种环蘸取少许经过驯化的培养液，在LB培养基平板上直接划线分离，在平板上选择不同形态特征的菌落，重新转接至以石油为唯一碳源的无机盐培养基中，于28～30℃，180rpm条件下摇床培养以验证是否具有石油降解能力，培养液变浑后，用接种环蘸取少许浑浊的培养液，在LB培养基平板上直接划线分离，在平板上选择单菌落重新画线分离纯化，重复分离、纯化操作3次。筛选得到能够以石油作为唯一碳源生长，并降解石油的菌株SYJ1-3。

16S rDNA保守序列鉴定：从筛选得到的菌株SYJ1-3中提取DNA后，以该菌株的DNA为模板，利用通用引物F27(5'AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQ ID NO：1)和R1492(5'-ACGGTTACCTGTTACGACTT-3'，，SEQ ID NO：2)进行PCR扩增，其中，PCR反应体系为：1μL DNA模板、2μL dNTP、2.5μL 10×PCR缓冲液、上述通用引物各1μL、0.2μL Taq酶、17.3μL去离子水。PCR反应流程为：①94℃预变性(5min)；②94℃变性(30s)，58℃退火(30s)，72℃延伸(90s)；③重复第二步，共30个循环；④72℃复性(10min)；⑤4℃保持。接下来，将PCR扩增产物与PMD18-T载体(Takara Acta Scientiae Circumstantiae公司生产)连接，转化到大肠杆菌感受态细胞。16S rDNA测序工作由中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)完成，DNA测序片段如下所示：

TCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGATTAGCATCCTATCGCTAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGACATTACTCGCTGGCAAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATGTAAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTTACTATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTGTTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCACACTCTAGCTAACCAGTATCGAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATTTGACTTAATTAGCCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCTCTAGGTATTAACTAAAGTAGCCTCCTCcTCGCTTaAAGTGCTTTACAaCcATAAGGCcTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTAGCGCAAGGTCCGAAGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCATTCCTTTCGAAATGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTAAGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTAAGATC(SEQ ID NO：3)

将测得的16S rDNA序列在GenBank进行Blast，序列比对结果表明，筛选得到的菌种菌株SYJ1-3与T32、NCBI数据库中Acinetobacter pittii strain AP_882，SFT_130，CL_120具有100％的同源性，因此该菌鉴定为皮特不动杆菌，命名为Acinetobacter pittiiSYJ1-3。Acinetobacter pittii SYJ1-3的16S rDNA基因在NCBI数据库中的基因序列号为KR262850。Acinetobacter pittii SYJ1-3为革兰氏阴性菌，细胞形态为杆状，其扫描电子显微镜照片见图1。Acinetobacter pittii SYJ1-3可以用柠檬酸，可产生接触酶，可进行硝酸盐还原。在平板上培养24h后菌落呈圆形突起，表面光滑，边缘整齐，不透明，无运动能力，能够以石油为唯一碳源进行生长并且能够降解石油。

实施例2：实验室摇瓶实验测定Acinetobacter pittii SYJ1-3降解石油的效果

从实施例1中得到的Acinetobacter pittii SYJ 1-3纯化平板上选取一环菌落接入LB培养基，摇瓶装液量为摇瓶体积的30％，培养温度为28～30℃，培养转速150-200rpm/min，培养时间为10-16h，得到SYJ1-3种子培养液。称取100mg的石油加入含有90ml无机盐培养基的摇瓶中，再接种10ml上述得到的SYJ1-3种子培养液，同时以未接种SYJ1-3种子培养液的含有石油的无机盐培养基作为对照组，实验组和对照组溶液中初始石油浓度为1mg/mL。将上述实验组(含有SYJ1-3种子培养液)和对照组(不含SYJ1-3种子培养液)摇瓶放在培养箱中，温度为28～30℃，培养转速150-200rpm/min，培养时间为7天。培养7天后将实验组和对照组溶液分别利用紫外分光光度法检测石油降解效果。具体地，将培养7天后的实验组和对照组溶液中的石油利用50ml石油醚进行萃取，以石油醚作为参比，在225nm下测定其光吸收值，然后根据标准曲线计算培养7天后实验组和对照组溶液中的石油浓度，并计算相应的石油降解效率。石油的降解效率＝(初始石油浓度-培养后的石油浓度)/初始石油浓度×100％。实验结果表明，经过摇瓶培养，石油降解菌Acinetobacter pittii SYJ 1-3对石油的降解效率为88.0％，对照组对石油的降解效率仅为6.7％。

采用上述相同的方法测定了初始石油浓度为0.1mg/mL～1mg/mL时，Acinetobacter pittii SYJ 1-3对石油的降解效率，结果表明Acinetobacter pittii SYJ1-3对不同浓度石油的降解效率为60％～90％。

实施例3：Acinetobacter pittii SYJ1-3在小试SBR装置中的应用和环境适应性试验

本实验所用进水为人工配制的模拟废水和长庆油田采出水原水，人工配制的模拟废水配方主要组成为NH₄Cl(0.02g/L)、K₂HPO₄、NaCl(2g/L)、NaHCO₃(4g/L)、Na₂CO₃(1g/L)、MgSO₄(0.2g/L)、Fe₂SO₄·7H₂O(0.05g/L)、无水CaCl₂(0.05g/L)、葡萄糖(0.1g)、石油类(50～500mg/L)、pH(7.5～8.5)。反应器启动时SBR中接种的污泥取自某污水处理厂的活性污泥。污泥接种量为1530mg/L。SBR工艺运行至第15天时，污泥浓度降为390mg/L，将放大培养的Acinetobacter pittii SYJ1-3菌株投加到SBR工艺中，投加比例约为10％(体积百分比)。SBR工艺连续运行82天，运行过程中按照实施例2中的方法测定不同时间点进水和出水中的石油浓度，并计算度对应的石油降解效率(或称去除效率)，结果如图2所示。从图2可以看出，在投加Acinetobacter pittii SYJ1-3菌株前，SBR工艺对石油的降解效率逐渐降低到50％以下。在SBR工艺运行的第15天，向工艺中投加Acinetobacter pittii SYJ1-3菌株后，工艺对石油的降解效率逐渐升高，并趋于稳定，可达到80～99％。另外，在工艺运行中的不同时间点，通过高通量测序方法检测了污泥样品中微生物种群丰度。结果表明，Acinetobacter sp.的丰度在开始投加时较高，随着运行时间增加，Acinetobacter sp.的丰度逐渐趋于稳定，说明Acinetobacter sp.在SBR工艺中的环境适应性较佳。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)菌株，其于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.11670，保藏名称为皮特不动杆菌Acinetobacter pittii SYJ 1-3。

2.权利要求1所述的皮特不动杆菌在降解石油中的用途。

3.一种降解石油的方法，其特征在于，包括：

将含有权利要求1所述的皮特不动杆菌和石油的混合物置于适合所述皮特不动杆菌生长或繁殖的条件下进行培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为28～30摄氏度。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述培养过程中，对所述含有皮特不动杆菌和石油的混合物进行搅拌处理。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述搅拌处理的转速为150～200rpm。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述石油以含有石油的液体混合物形式提供。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含有石油的液体混合物为石油和无机盐培养基的混合物。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括：

将一环所述皮特不动杆菌菌落接种于LB培养基中，并于28～30摄氏度、150～200rpm搅拌条件下进行培养，得到皮特不动杆菌种子培养液；

将所述皮特不动杆菌种子培养液接种于含有石油的无机盐培养基中，并于28～30摄氏度、150～200rpm搅拌条件下进行培养。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述无机盐培养基含有：NH₄NO₃ 2g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 3.8g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、NaCl 1g/L、MgSO₄ 0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L、无水CaCl₂ 0.05g/L，pH 7.0～7.2。