CN101851027A - 一种使用组合菌液恢复受石油污染水源的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种使用组合菌液还原受石油污染水源的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1，采集污染水样；A2，从所述污染水样中将原油降解菌进行富集、分离和纯化培养；A3，使用所述原油降解菌配置组合菌液；A4，使用所述组合菌液加入所述受石油污染水源中；采用本发明的方法，高效石油降解菌株可产生双加氧酶，对石油中含碳量在C13-C31的组分降解率均在90％以上；降解正十八烷的最适温度为30℃、pH值7.0和Nacl浓度为2％，在低温和高盐碱条件下仍具有良好的降解能力；降解烷烃的同时能迅速产生脂肽类生物表面活性剂，使表面张力58.11mN·m-1下降到36.6mN·m-1。

Description

一种使用组合菌液恢复受石油污染水源的方法

技术领域

本发明属于微生物技术和环境生物技术领域，具体涉及一种利用组合菌液还原受石油污染水源的方法。

背景技术

我国每年石油消耗量将达到4.5亿吨，其中需进口约1亿吨。石油资源匮乏、石油价格猛涨，给我国经济带来很大压力。当前特别是要切实抓好石油天然气的节约和合理使用。我国人口多，资源少，生态环境脆弱，经济和社会发展还面临着环境与资源的压力，环境污染和生态恶化的问题还比较突出。大力发展循环经济，实现资源的高效利用和循环使用，是实现可持续发展的重要途径，也是从中国国情出发的必然选择，也是企业顺应形势要求的重大决策。生物修复技术就是在这种背景下被开发，并在20世纪90年代得到迅速发展的一项污染治理工程技术。

石油是由上千种化学性质不同的物质组成的复杂混合物，主要包括饱和烃、芳香烃类化合物、沥青质、树脂类等。石油的开采、冶炼、使用和运输过程的污染和遗漏事故，以及含油废水的排放、污水灌溉，各种石油制品的挥发、不完全燃烧物飘落等引起一系列水源的石油污染问题。特别是石油开采过程产生的落地原油，已成为水源污染的重要来源。

许多研究表明，一些石油烃类进入动物体内后，对哺乳类动物及人类有致癌、致畸、致突变的作用。水源的严重污染会导致石油烃的某些成分在粮食中积累，影响粮食的品质，并通过食物链，危害人类健康。进行含油污水的生物修复，首先需要了解含油污水中微生物的特性，大多数研究表明水源中存在的微生物种类多样，未被污染水体中的复杂微生物群落都包含着天然的石油降解菌群。水体被石油污染后，烃类污染物能引导具备降解能力的微生物产生诱导酶，正是通过这种自然选择以及基因突变作用，能够适应新的微生物生态环境的微生物种群，逐渐被驯化成为石油降解菌，这样就可以通过这些降解菌来还原受石油污染的水体，降解石油。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用组合菌液来降解污染水源中的石油的方法，能够降解石油、还原水体。

为实现上述目的，本发明提供一种利用组合菌液还原受石油污染水源的方法，包括以下步骤：

一种使用组合菌液还原受石油污染水源的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1，采集污染水样；A2，从所述污染水样中将原油降解菌进行富集、分离和纯化培养；A3，使用所述原油降解菌配置组合菌液；A4，使用所述组合菌液加入所述受石油污染水源中。

所述的方法，其特征在于，所述步骤A1具体执行一下操作：从油井中采集含油污染水样，其中油井深度为800-1000m，温度为26℃-30℃，所述污染水样经除杂、混均。

所述的方法，其特征在于，所述步骤A2具体执行以下操作：A21，取经除杂、混匀的所述污染水样添加到装有无机培养基的三角瓶中，在恒温摇床上进行振荡培养7d，30℃条件下培养7d后取其中的培养物到新鲜的无机培养基中再培养7d，得到富集培养物；A22，移取A21得到的富集培养物接入富集培养基中，在温度30℃下培养7d，A23，取A22得到的培养物到新鲜的富集培养基中30℃条件下重复培养7d，A24，取A23得到的培养物到新鲜的富集培养基中30℃条件下重复培养7d，得到驯化培养液；A25，在无菌的条件下，用接种环蘸取A24得到的所述驯化培养液，在含油无机盐培养基的平板上划线后，平板倒置于30℃恒温培养箱中培养24h，得到典型菌落；A26，将A25得到的所述典型菌落在分离培养基的平板上反复划线纯化后得到单一菌落，分别将纯化的单一菌落的菌株接种至斜面培养基上培养后，保存于冰箱中。

所述的方法，其特征在于，所述无机培养基的组成为：1.0g的K₂HPO₄·3H₂O、1.0g的KH₂PO₄、0.5g的MgSO₄·7H₂O、1.0g的NH₄NO₃、0.02g的CaCl₂、0.03g的FeCl₃、1L去离子水相混合，pH 7.5。

根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述富集培养基的组成为：无机培养基、2g的原油相混合，pH 7～7.5。含油无机盐培养基的组成为：无机培养基、2g的原油、20g的琼脂相混合。

所述的方法，其特征在于，所述步骤A3具体执行以下操作：A31，分别将纯化的单一菌落的菌株接入到种子培养基中，于30℃下，培养24h后得到培养液，A32，分别吸取所述培养液接入降解液体培养基中，于30℃、150r/min摇床培养7d，并分别测定单一菌落的菌株的原油降解率；A33，利用16srDNA分子生物学方法，鉴定原油降解率超过70％的细菌种类，将其中的归属于假单胞菌、黄杆菌、棒杆菌的菌株分别接入到种子培养基进行扩大培养，培养温度为30℃，培养24h后，分别吸取浓度为10⁸～10¹²个/ml的1mL假单胞菌的菌悬液、浓度为10⁸～10¹²个/ml的20mL黄杆菌的菌悬液和度为10⁸～10¹²个/m1的1mL棒杆菌的菌悬液，充分混合配成所述组合菌液。

所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的组分为：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母提取物3g，NaCl 5g，1L的蒸馏水，pH 7.5。

所述的方法，其特征在于，所述降解液体培养基的组分为：无机盐培养基，原油1g。

所述的方法，其特征在于，所述步骤A4具体执行以下操作：按照待处理污水的体积百分比3％的比例，接向装有含油污水的生物反应器中种入所述组合菌液，加入MgSO₄ 2g/L，CuSO₄ 0.5g/L，MnSO₄ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，在温度为28℃～30℃，通气量0.002～0.008m/s的条件下，将反应器搅拌桨的转速调至110～150r/min。

本发明的有益效果是，

(1)高效石油降解菌株可产生双加氧酶，对石油中含碳量在C13-C31的组分降解率均在90％以上；

(2)降解正十八烷的最适温度为30℃、pH值7.0和Nacl浓度为2％，在低温和高盐碱条件下仍具有良好的降解能力；

(3)降解烷烃的同时能迅速产生脂肽类生物表面活性剂，使表面张力58.11mN·m-1下降到36.6mN·m-1。

附图说明

图1为本发明中为接种了组合菌液的新鲜含油污水和没有接种组合菌液的新鲜含油污水的原油降解率随时间的变化曲线，横轴为降解时间，纵轴为原油的降解率；

图2为本发明中接种、未接种组合菌液的新鲜含油污水和新鲜含油污水、灭菌含油污水原油降解变化曲线，横轴为降解时间，纵轴为单位重量污水中原油的重量。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

本发明提供的一种利用组合菌液来降解含油污水的方法，试验用选择性培养基和富集培养基，对试验场含油污水的样品进行菌种、菌群的培养分离，选择优化出试验用降解石油污水的菌种、菌群。具体按以下步骤进行：

步骤1，从油井中采集污染水样

从油井取出含油污水样，其中油井深度为800-1000m；温度为26℃-30℃，水样经除杂、混匀；

步骤2，原油降解菌的富集和分离、纯化培养

取上步的污水样10ml添加到装有200mL无机盐培养基的三角瓶中，在30℃、200r/min的恒温摇床上进行振荡培养7d，培养7d后取其中的培养物到新鲜的同样的无机盐培养基中再培养7d、30℃重复培养，得到富集培养物；

移取10ml的富集培养物接入新鲜的富集培养基中，在温度30℃下培养7d，7d后取其中的培养物到新鲜的同样的富集培养基中再培养7d、30℃重复培养、共重复3次，7天为一周期，经过3个周期的驯化后，得到驯化培养液；在无菌的条件下，用接种环蘸取驯化培养液，在含油无机盐培养基的平板上划线后，平板倒置于30℃恒温培养箱中培养24h，得到典型菌落，然后将典型菌落在含油无机盐培养基的平板上反复划线、纯化后得到纯化的单菌落，分别将纯化的单菌落的菌株接种至斜面培养基上培养后，保存于4℃冰箱中备用。其中：(1)无机盐培养基的组成为：K2HPO4·3H2O 1.0g，KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.5g，NH4NO3 1.0g，CaCl2 0.02g，FeCl3 0.03g，1L去离子水相混合，pH 7.5；(2)富集培养基的组分为(1L)：无机盐培养基，原油2g相混合，pH 7～7.5；

(3)含油无机盐培养基的组分为(1L)：无机盐培养基，原油2g，琼脂20g相混合。

步骤3，组合菌液配置

分别将上步得到的纯化的单菌落菌株接入到种子培养基中，于30℃下，培养24h后得到培养液，分别吸取5mL培养液接入50mL降解液体培养基中，于30℃，150r/min摇床培养7d，并分别测定单菌落菌株的原油降解率；利用16S rDNA分子生物学方法，鉴定原油降解率超过70％的细菌种类，将其中具有高效降解能力，并归属于假单胞菌、黄杆菌、棒杆菌的菌株分别接入到种子培养基进行扩大培养，温度为30℃，培养24h后，分别吸取浓度为108～1012个/ml的1mL假单胞菌的菌悬液、浓度为108～1012个/ml的20mL黄杆菌的菌悬液和度为108～1012个/ml的1mL棒杆菌的菌悬液，充分混合配成组合菌菌液制剂。

其中：(1)种子培养基的组分为(1L)：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母提取物3g，NaCl 5g，1L的蒸馏水，pH 7.5。(2)降解液体培养基的组分为(1L)：无机盐培养基，原油1g。

步骤4，组合菌液对原油的降解率

将占污水体积3％的组合菌液制剂接种入装有含油污水的生物反应器中，根据培养基成分比例加入MgSO4 2g/L，CuSO4 0.5g/L，MnSO40.5g/L，FeSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.5g/L，在温度为28℃～30℃，通气量0.002～0.008m/s的条件下，以3～11h为周期，将反应器搅拌桨的转速调至110～150r/min，使组合菌群能够在反应器中协同降解含油污水中的石油烃。

其中步骤3中16S rRNA基因PCR扩增及序列测定具体步骤为：

(一)菌体收集：将镜检纯化的供试菌株分别接种到5ml LB培养液中，28℃、130r/min震荡培养3-5d，取1.5ml菌液于离心管中，8000r/min离心5min，弃去上清液，然后，重复上述操作两次，收集菌体。

(二)DNA提取：

第一天

加入1ml 1×TE(Tris 10mM，EDTA 1mM，pH 8)，洗涤菌体2-3次，即加入1ml 1×TE溶液后，用手摇动后，在涡旋震荡机上震荡，打散菌体，然后8000rpm离心5min，弃去上清，重复此步骤2次。然后，加入600μlTE缓冲液(含20μl，50mg/ml溶菌酶，即580μlTE缓冲液，20μl溶菌酶)，并转移到1.5ml灭过菌的离心管中，旋涡震荡，37℃在水浴锅温育1h。加入30μl 10％SDS，10μl蛋白酶K(20mg/ml)，并充分混匀，37℃温浴过夜。

第二天

1.加20μl10％SDS，并翻转混匀(非涡旋震荡)。加130μl 5M NaCl，并用手剧烈振荡。在冰上放置30min后，并用手剧烈振荡。

2.12000rpm离心25min。用剪去枪尖的枪头吸取上层水相，转移至新的离心管中，收集上清液，然后在收集的上清液中加入约700μl的P∶C∶I，充分振荡使其呈乳浊液。12000rpm离心5min，用剪去枪尖的枪头吸取上层水相，转移至新的离心管中，收集上清。重复用P∶C∶I抽提2-3次至没有蛋白膜出现。

3.加700μl的C∶I，非涡旋振荡，12000rpm离心10min，若有必要，可重复这一步。

4.收集上清液，加1/10倍体积(约50μl)的3M，PH 5.2NaAC和1倍体积(500μl)预冷的异丙醇(以沉淀核酸)，轻微反转振荡试管(非涡旋)，使DNA析出。

5.12000rmp离心10min，去除上清液，并加500μl的70％乙醇，用手轻微振荡，洗涤DNA沉淀中的无机盐和有机溶剂。

6.12000rmp离心15min，并弃去上清乙醇，干燥DNA。

7.加50μl纯水，轻敲管壁，使DNA重新悬浮起来。

8.加3μl 10mg/ml RNAase并在37℃温浴3h。

9.加ddH2O 47μl，用1/10(10μl)体积的3M PH 5.2NaAC和1体积的异丙醇(预先冷却)，轻微翻转摇晃使DNA沉淀(非涡旋)，12000rpm20min，弃去上清。

10.用500μl的70％乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，去上清并干燥DNA。

11.干燥后，加ddH2O，轻敲离心管使DNA重新悬浮起来。

12.放离心管置4℃冰箱过夜，使DNA能充分溶解。

13.电泳检查，并-20℃保存。

(三)PCR扩增

1.16SrRNA引物

选用来源于E.coli 16SrRNA基因序列保守区域的序列合成引物P1和P6，配成10μM浓度。

正向引物P1：5，-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3，其序列对应于E.coli第8-37碱基位置。

反向引物P6：5，-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3，，此序列对应于E.coli第1479-1506碱基位置。

2.PCR反应体系

16SrRNA PCR反应体系体积为50μl，反应体系组成如下：

Reaction Buffer(10×)5.0μl

MgCl2(25mM)3.0μl

dDNTPs(25mM)4.0μl

正向引物(150μM)1.0μl

反向引物(150μM)1.0μl

DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl

模板DNA(约20-30ng)2.0μl

补足超纯水至50.0μl

3.扩增反应条件如下：

(1)95℃预变性4min

(2)94℃变性1min

(3)54℃退火1min

(4)72℃延伸2min

(5)重复(2)-(4)步骤32循环

(6)72℃最终延伸7min

32个循环后，利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。在16S PCR-RFLP分析的基础上，选择各个基因型的代表的菌株进行了全序列测定。在NCBI网站上进行Blast比对，采用16SrDNA进行了分类和鉴定，其16SrDNA的核苷酸序列如说明书后附表所示。

真菌的分类鉴定依据中国真菌志进行。

菌株鉴定结果表明，供试菌株分别归属于：不动细菌属，奈瑟氏球菌属，邻单胞菌属、黄单胞菌属、动胶菌属、黄杆菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、青霉属、葡萄孢属。

本发明的组合菌液，从渣油、落地油、含油污水及原油中经过富集、筛选、分离和纯化出石油降解率为98％的菌株，具有降解石油的特性。

通过菌体细胞或其发酵液降解石油中的C13-C31，具体过程为：

在菌体细胞或其发酵液作用下，直链烷烃首先被通过氧化烷烃末端的一个甲基转变为相应的醇，源于烷烃的醇在醇脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛，醛则通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸，一种情况是直接经历随后的β-氧化，即形成羧基并脱落两个碳单元，另一种情况是经历羟基化形成羟基脂肪酸，然后在非专一羟基酶的参与下被氧化为二羧酸，最后再经历β-氧化序列，其途经如下式所示：

R-CH₂-CH₃+O₂→R-CH₂-CH₂-OH→R-CH₂-CHO→R-CH₂-COOH

H₃C-(CH₂)n-CH₃+O₂→H₃C-(CH₂)n-CH₂OH→H₃C-(CH₂)n-CHO→H₃C-(CH₂)n-COOH→HOH₂C-(CH₂)n-COOH→OHC-(CH₂)n-COOH→HOOC-(CH₂)n-COOH，其中n的范围是1-22

H₃C-(CH₂)₁₁-CH₃→H₃C-(CH₂)₁₀-CH(OH)-CH₃→H₃C-(CH₂)₁₀-COCH₃→H₃C-(CH₂)₉-CH₂-O-COCH₃→H₃C-(CH₂)₉-CH₂OH+CH₃COOH

以下验证本发明组合菌液降解原油的功效，下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步说明，但不限制本发明。具体方法如下：

本实例中采用有机玻璃质料的、容积为20L的带有搅拌桨和通气装置的间歇式生物反应器进行试验。

用当地取得的含油污水作碳源，即污染物，根据试验用接种量将选择优化出的各菌种、菌群进行放大培养，配成菌液制剂。具体方法为：在无菌的条件下，将其中的假单胞菌、黄杆菌、棒杆菌分别接入种子培养基进行扩大培养，培养温度30℃，培养24h后，分别吸取浓度为108～1012个/ml的1mL假单胞菌的菌悬液、浓度为108～1012个/ml的20mL黄杆菌的菌悬液和度为108～1012个/ml的1mL棒杆菌的菌悬液，充分混合配成组合菌菌液制剂。将占污水体积3％的组合菌液制剂接种入装有含油污水的生物反应器中，根据培养基成分比例加入MgSO₄ 2g/L，CuSO₄ 0.5g/L，MnSO₄0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，在温度为28℃～30℃，通气量0.002～0.008m/s的条件下，以3～11h为周期，将反应器搅拌桨的转速调至110～150r/min，使组合菌群能够在反应器中协同降解含油污水中的石油烃。降解过程持续5d，在降解过程中以3种细菌单独的降解体系和灭菌的含油污水含油污水体系作为对照，空白对照为不加任何物质和菌体的体系作为监控样品。

处理后的含油污水中石油烃降解的结果如图1至图2。图1为本发明为接种了组合菌液的新鲜含油污水和没有接种组合菌液的新鲜含油污水的原油降解率随时间的变化曲线，横轴为降解时间，纵轴为原油的降解率；此图表明投加组合菌液于一定的原油污染水体中可以提高菌体数量，加快石油降解。由此看出，高效石油降解菌株可产生双加氧酶(菌株的摇瓶产物加吲哚后显蓝色，这是能否产生双加氧酶的特征性定性显色反应)，对石油中含碳量在C₁₃～C₃₁的组分降解率均在90％以上。图2为本发明中接种、未接种组合菌液的新鲜含油污水和新鲜含油污水、灭菌含油污水原油降解变化曲线，横轴为降解时间，纵轴为单位重量污水中原油的重量；此图表明新鲜含油污水和灭菌的含油污水在处理中的差别以及接种组合菌液的新鲜含油污水、未接种组合菌液的新鲜含油污水的原油降解率是明显不同的，说明本发明的组合菌液取得了良好的降解效果。

本发明提供高效降解菌烷烃降解谱的测定：烷烃降解谱的测定在FJ培养液中加入5m L正己烷及用正己烷溶解的10000mg·L-1的菲(内标)25μL，充分振荡溶解后离心。用正己烷对萃取液重复萃取两次，合并萃取液后定容至25mL，用干燥的无水硫酸钠脱水，取1μL上清液进行GC-MS测定。气相色谱仪为Thermotrace GCULTRA，色谱柱为TRB-5，FID检测器。色谱条件：80℃保持5min，以3℃·min-1升至165℃，保持2min，然后以5℃·min-1升至270℃，保持10min。进样口温度250℃，检测器温度280℃，无分流比。

本发明提供高效降解菌烷烃降解谱的测定：在烷烃培养液中加入5mL色谱纯正己烷及15μL正十五烷(内标)，充分振荡萃取后，于4℃10000r·min-1离心5min。吸取上清液至20mL刻度试管中，残液用5mL正己烷重复萃取两次，合并后定容至15mL。稀释10倍后用干燥的无水硫酸钠脱水，取1μL进行气相色谱测定。气相色谱仪为OV101，色谱柱为SPB-5，FID检测器。色谱条件：130℃保持5min，以10℃·min-1升至220℃，保持5min。进样口、检测器温度均为250℃。

本发明提供的高效降解菌表面张力的测定：每间隔8h取培养后的30mL石蜡培养液，采用分光光度计于600nm处测细菌生长量，12000r·min-1离心10min去除菌体，用JYW-200A自动界面张力仪(承德实验机有限责任公司)测上清液的表面张力。

本发明属于含油污水的异位生物修复技术。本发明是将具有石油烃降解能力的不同种类的细菌分别通过液体培养后按照一定比例混合制成液体微生物制剂，采用本发明提供的微生物制剂具有在水体中活性高、迁移迅速、能够与污染物充分接触并能够协同降解石油烃污染物的优点。本方法可以保证异位生物修复过程中微生物生长代谢的最佳条件，通过通气为微生物降解石油烃提供了足够氧，剧烈搅拌使得菌体及其产生的酶、表面活性剂能够充分的与石油烃相接触，强化微生物在水体中的迁移和营养物质等的传质过程，从而提高异位生物修复过程的效率。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

核苷酸序列表：

<110>延安微生物研究所

<120>一种使用组合菌液还原受石油污染水源的方法

<160>3

<210>1

<211>933

<212>DNA

<213>假单胞菌属(Pseudoomonas)

<400>1

 

gcggctggct ccaaaaaggt taccccaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg    60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac    120

tagcgattcc agcttcatgt aggcgagttg cagcctacaa tccgaactga gaacggtttt    180

atgagattag ctccacctcg cggtcttgca gctctttgta ccgtccattg tagcacgtgt    240

gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt    300

caccggcagt caccttagag tgcccaactt aatgatggca actaagatca agggttgcgc    360

tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct    420

gtcactctgc tcccgaagga gaagccctat ctctagggtt ttcagaggat gtcaagacct    480

ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc    540

cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg    600

ttaacttcag cactaaaggg cggaaaccct ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt    660

ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gtgtcagtta    720

cagaccagaa agtcgccttc gccactggtg ttcctccata tctctacgca tttcaccgct    780

acacatggaa ttccactttc ctcttctgca ctcaagtctc ccagtttcca atgaccctcc    840

acggttgagc cgtgggcttt cacatcagac ttaagaaacc acctgcgcgc gctttacgcc    900

caataattcc ggataacgct tgccacctac gta                                 933

<210>2

<211>937

<212>DNA

<213>黄杆菌属(Flavobacterium)

<400>2

 

ggcggctggc tccataaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt    60

gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta    120

ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt    180

tgtgggattg gcttaacctc gcggtctcgc tgccctttgt tctgtccatt gtagcacgtg    240

tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg    300

tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg    360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc    420

tgtcactctg cccccgaagg ggaagcccta tctctagggg tgtcagagga tgtcaagacc    480

tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc    540

ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc    600

gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg    660

tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagtt    720

acagaccaga gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc    780

tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc    840

cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgag ccctttacgc    900

ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtatta                             937

<210>3

<211>940

<212>DNA

<213>棒状杆菌属(Corynebacterium)

<400>3

 

gcggctggct ccaaaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga    60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact    120

agcgattccg gcttcatgta ggcgagttgc agcctacaat ccgaactgag aacgacttta    180

tcggattagc tccctctcgc gagttggcaa ccgtttgtat cgtccattgt agcacgtgtg    240

tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc    300

accggcagtc accttagagt gcccaactaa atgatggcaa ctaagatcaa gggttgcgct    360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg    420

tcaccgttgc ccccgaaggg gaaaccatat ctctacagtg gtcaacggga tgtcaagacc    480

tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc    540

ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc    600

gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg    660

tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agtgtcagtt    720

acagaccaga tagtcgcctt cgccactggt gttcctccaa atctctacgc atttcaccgc    780

tacacttgga attccactat cctcttctgc actcaagtct cccagtttcc aatgaccctc    840

cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaagaaac cacctgcgcg cgctttacgc    900

ccaataattc ccggacaacg cttgccacct acgtattacc                          940

正向引物P1：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’其序列对应于E.coli第8-37碱基位置。

反向引物P6：5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3’，此序列对应于E.coli第1479-1506碱基位置。

Claims (9)

1.一种使用组合菌液还原受石油污染水源的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1，采集污染水样；A2，从所述污染水样中将原油降解菌进行富集、分离和纯化培养；A3，使用所述原油降解菌配置组合菌液；A4，使用所述组合菌液加入所述受石油污染水源中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A1具体执行一下操作：从油井中采集含油污染水样，其中油井深度为800-1000m，温度为26℃-30℃，所述污染水样经除杂、混均。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤A2具体执行以下操作：A21，取经除杂、混匀的所述污染水样添加到装有无机培养基的三角瓶中，在恒温摇床上进行振荡培养7d，30℃条件下培养7d后取其中的培养物到新鲜的无机培养基中再培养7d，得到富集培养物；A22，移取A21得到的富集培养物接入富集培养基中，在温度30℃下培养7d，A23，取A22得到的培养物到新鲜的富集培养基中30℃条件下重复培养7d，A24，取A23得到的培养物到新鲜的富集培养基中30℃条件下重复培养7d，得到驯化培养液；A25，在无菌的条件下，用接种环蘸取A24得到的所述驯化培养液，在含油无机盐培养基的平板上划线后，平板倒置于30℃恒温培养箱中培养24h，得到典型菌落；A26，将A25得到的所述典型菌落在分离培养基的平板上反复划线纯化后得到单一菌落，分别将纯化的单一菌落的菌株接种至斜面培养基上培养后，保存于冰箱中。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无机培养基的组成为：1.0g的K₂HPO₄·3H₂O、1.0g的KH₂PO₄、0.5g的MgSO₄·7H₂O、1.0g的NH₄NO₃、0.02g的CaCl₂、0.03g的FeCl₃、1L去离子水相混合，pH 7.5。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述富集培养基的组成为：无机培养基、2g的原油相混合，pH 7～7.5。含油无机盐培养基的组成为：无机培养基、2g的原油、20g的琼脂相混合。

6.根据权利要求3至5任一所述的方法，其特征在于，所述步骤A3具体执行以下操作：A31，分别将纯化的单一菌落的菌株接入到种子培养基中，于30℃下，培养24h后得到培养液，A32，分别吸取所述培养液接入降解液体培养基中，于30℃、150r/min摇床培养7d，并分别测定单一菌落的菌株的原油降解率；A33，利用16SrDNA分子生物学方法，鉴定原油降解率超过70％的细菌种类，将其中的归属于假单胞菌、黄杆菌、棒杆菌的菌株分别接入到种子培养基进行扩大培养，培养温度为30℃，培养24h后，分别吸取浓度为10⁸～10¹²个/ml的1mL假单胞菌的菌悬液、浓度为10⁸～10¹²个/ml的20mL黄杆菌的菌悬液和度为10⁸～10¹²个/ml的1mL棒杆菌的菌悬液，充分混合配成所述组合菌液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的组分为：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母提取物3g，NaCl 5g，1L的蒸馏水，pH 7.5。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述降解液体培养基的组分为：无机盐培养基，原油1g。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤A4具体执行以下操作：按照待处理污水的体积百分比3％的比例，接向装有含油污水的生物反应器中种入所述组合菌液，加入MgSO₄2g/L，CuSO₄0.5g/L，MnSO₄0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂0.5g/L，在温度为28℃～30℃，通气量0.002～0.008m/s的条件下，将反应器搅拌桨的转速调至110～150r/min。

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